本申请要求于2015年8月14日提交的美国临时专利申请序列号62/205,476的优先权，其全部内容通过引用并入本文。资助信息本发明在国立卫生研究院授予的nih基金号r01ar056016、r21ar061881和5u01ar067173下在政府支持下完成。政府对本发明享有一定的权利。1.引言本发明公开的主题涉及允许斑秃的改善的诊断和预后以及该疾病的有效治疗的生物标志物，包括并入能够鉴定将响应于这样的治疗的患者子群的生物标志物的方法和并入能够跟踪这样的治疗的进展的生物标志物的方法。2.背景斑秃(aa)是一种自身免疫性皮肤病，其中毛囊是免疫攻击的目标。患者典型地呈现出通常在头皮上的圆形或卵形的脱发斑块，其可以自发地消退、持续或进展为涉及头皮或全身。该疾病的三种主要表型变体是通常局限于头皮或胡须区域的小卵形区域的斑块型aa(aap)，涉及整个头皮的全秃(at)，和涉及整个身体表面区域的普秃(au)。目前没有fda批准的用于aa的药物，并且治疗通常是经验性的，但通常包括观察、未证实功效的广谱免疫抑制治疗、局部免疫治疗或病灶内类固醇。更严重的疾病形式au和at往往难以治疗。此外，皮肤科医生和治疗医师中普遍存在的假设是，长期存在的au和at变得无法恢复，或者将头皮转变为“烧伤”状态，这得到了由疾病持续时间和治疗响应性之间的负相关性的支持。尽管其发病率很高，仍然需要生物标志物来鉴定疾病的严重程度以及对疾病的有效治疗，包括并入能够鉴定将响应于这样的治疗的患者子群的生物标志物的方法和并入能够跟踪这样的治疗的进展的生物标志物的方法。3.概述本公开内容涉及允许改善斑秃的诊断和预后以及该疾病的有效治疗的生物标志物。在某些实施方案中，治疗受试者中的脱发症(aa)的方法包括通过检测指示该疾病的严重程度的生物标志物来鉴定所述受试者中的aa疾病严重程度并且对所述受试者施用适合于所鉴定的疾病严重程度的治疗性干预。本发明公开的主题进一步提供了治疗受试者的aa的方法，其包括通过检测指示具有aa的受试者对jak抑制剂治疗的响应的倾向的生物标志物来鉴定所述倾向，并且如果所鉴定的生物标志物指示受试者将响应所述抑制剂的倾向，则向所述受试者施用jak抑制剂。本发明公开的主题进一步提供了治疗受试者中的斑秃(aa)的方法，其包括向患有aa的受试者施用jak抑制剂；并检测指示对jak抑制剂治疗的响应性的生物标志物。在某些实施方案中，对本发明公开的生物标志物的所述检测是在从受试者获得的样品上进行的，并且样品选自皮肤，血液，血清，血浆，尿液，唾液，痰，粘液，精液，羊水，漱口液和支气管灌洗液。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，样品是皮肤样品。在某些实施方案中，样品是血清样品。在某些实施方案中，生物标志物是基因表达标志。在某些实施方案中，基因表达标志包含以下多组基因中的一种或多种的基因表达信息：krt相关基因；ctl相关基因；和ifn相关基因。在某些实施方案中，krt相关基因包含dsg4，hoxc31，krt31，krt32，krt33b，krt82，pkp1和pkp2。在某些实施方案中，ctl相关基因包含cd8a，gzmb，icos和prf1。在某些实施方案中，ifn相关基因包含cxcl9，cxcl10，cxcl11，stat1和mx1。在某些实施方案中，基因表达标志是斑秃病活动指数(aladin)。在某些实施方案中，基因表达标志是包含表a中列出的一个或多个基因的斑秃基因标志(aags)。在某些实施方案中，基因表达标志是ikzf1、dlx4或其组合。在某些实施方案中，本文公开的生物标志物的检测通过核酸杂交测定进行。在某些实施方案中，通过微阵列分析进行检测。在某些实施方案中，通过聚合酶链式反应(pcr)或核酸测序进行检测。在某些实施方案中，生物标志物是蛋白质。在某些实施方案中，使用与蛋白质特异性结合的试剂检测蛋白质的存在。在某些实施方案中，试剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，或多克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，检测通过酶联免疫吸附测定(elisa)，免疫荧光测定或蛋白质印迹测定来进行。另一方面，本发明公开的主题提供了用于治疗受试者中的斑秃(aa)的试剂盒，其包含一种或多种用于检测指示受试者疾病严重程度的生物标志物的检测试剂和一种或多种用于治疗aa的治疗试剂。本发明公开的主题可以进一步提供用于治疗受试者中的斑秃(aa)的试剂盒，其包含一种或多种用于检测指示受试者响应用于治疗aa的治疗试剂的倾向的生物标志物的检测试剂和一种或多种用于治疗aa的治疗试剂。在某些实施方案中，试剂盒还包含一个或多个探针组，阵列/微阵列，生物标志物特异性抗体和/或珠子。在某些实施方案中，试剂盒还包含说明书。在某些实施方案中，治疗试剂可以选自jak抑制剂。在某些实施方案中，所述jak抑制剂是与jak1/jak2/jak3/tyk2/stat1/stat2/stat3/stat4/stat5a/stat5b/stat6/osm/gp130/lifr/osm-rβ基因或jak1/jak2/jak3/tyk2/stat1/stat2/stat3/stat4/stat5a/stat5b/stat6/osm/gp130/lifr/osm-rβ蛋白相互作用的化合物。在某些实施方案中，jak抑制剂可选自鲁索替尼(incb018424)，托法替尼(cp690550)，酪氨酸磷酸化抑制剂ag490(cas编号：133550-30-8)，莫米洛替尼(cyt387)，帕瑞替尼(sb1518)，巴利替尼(ly3009104)，fedratinib(tg101348)，bms-911543(cas编号：1310726-60-3)，来妥替尼(cep-701)，氟达拉滨，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(egcg)，培非替尼，abt494(cas编号：1310726-60-3)，at9283(cas编号：896466-04-9)，decernmotinib，filgotinib，gandotinib，incb39110(cas编号：1334298-90-6)，pf04965842(cas编号：1622902-68-4)，r348(r-932348,cas编号:916742-11-5；1620142-65-5),azd1480(cas编号:935666-88-9),cerdulatinib,incb052793,ns018(cas编号:1239358-86-1(游离碱)；1239358-85-0(hcl)),ac410(cas编号:1361415-84-0(游离碱)；1361415-86-2(hcl)),ct1578(sb1578,cas编号:937273-04-6),jte052,pf6263276,r548,tg02(sb1317,cas编号:937270-47-8)，lumbricusrebellus提取物，arn4079，ar13154，ur67767，cs510，vr588，dnx04042，贯叶金丝桃素，其衍生物、氘代变体、盐，或其组合。在某些实施方案中，检测试剂可以选自荧光试剂，发光试剂，染料，放射性同位素，其衍生物或其组合。4.附图简述通过举例给出而不是将本发明限制于所描述的具体实施方案的详细描述可以结合附图来理解。图1.斑秃疾病特异性标志。(a)在训练集中的at/au、aap和nc样品中，aa特异性疾病标志内具有增加的表达的50个最差异表达基因和具有降低的表达的50个最差异表达基因的热图。(b)沿着差异基因表达的主成分排列的样品的表达地形图。点表示每个样品在表达空间中的位置(白色＝nc，蓝色＝aap，红色＝at/au)，并且基于该区域中样品的数量生成峰的大小(更多并置样品产生更高、更宽的峰值)。主成分空间可以压缩成单一的数字得分，反映了样品基于其在地形空间中的位置作为对照、aap或at/au的风险。该一致性得分提供了统计学显著的分离对照、aap和at/au样品队列(盒须图)。盒表示四分位间距和中位数，须表示第5和第95百分位，＊表示针对nc的统计显著性，表示针对aap的统计显著性。图2.全秃和普秃中增加的基因表达复杂性和持续的炎性。(a)at/au与正常相比(“at/au”)和aap与正常相比(“aap”)的差异表达基因的维恩图。所显示的是维恩图每个部分中差异表达基因的数目。(b)at/au，aap或nc患者皮肤切片中cd3浸润的毛囊周/球周组织病理学评分。＊p<0.01；＊＊p<0.0005。(c)反映hps得分0(无浸润)至3(严重浸润)的代表性组织学图像。(d)at/au与正常对照之间和aap与正常对照之间共享的kegg途径列表。(e)at/au与正常对照(红色)、aap与正常对照(蓝色)中上调的kegg途径或在at/au与正常之间和aap与正常对照之间共有的途径的网络图。图3.aa中的个体内基因表达分析。(a)比较患者匹配的病变和非病变样品的热图，以鉴定将它们彼此以及与健康对照区分的基因。(b)通过它们与差异表达的第一主成分的标准化偏差排列的患者匹配的病变(红色)和非病变(蓝色)样品。配对样品之间的线长度表示基于所有标志基因的一致性的总体相似性(较短的线)或不相似性(较长的线)。(c)使用正常对照样品、病变aap和非病变aap样品的前两个主成分分析的显示揭示病变样品聚集在病变样品和对照之间，而不是在任一队列中。(d)病变和非病变aap样品之间过表达和低表达基因的途径和功能注释分析揭示了离散的基因集合，其在非病变中上调而在病变中下调(红色节点)，并且在非病变中下调而在病变中上调(蓝色节点)。这些基因与所示的富集注释相关联(黄色节点)，表示反映在其表达谱中的病变和非病变样品之间的功能分子差异。图4.免疫细胞浸润基因表达标志与aa表型相关。(a)，基于相应免疫标志物的一致表达，根据患者对指示的浸润免疫细胞的相对估计(热图，右图)。越来越多的红色表明浸润量越来越大。患者通过cd8浸润进行排序。通过cd8浸润将患者从最高到最低排序揭示了人群偏倚。盒须图根据cd8浸润排序反映所示临床表现的分布(较低的排序表示较高的浸润水平)。盒表示四分位间距和中位数，须表示第5和第95百分位，＊表示统计显著性p＝0.005，＊＊表示p<1x10-5。(b)使用一致性表达，对于每个呈现队列估计活检样品的浸润污染，aap＝斑状(左侧饼图)，at/au＝全秃/普秃(右侧饼图)，以及每种免疫组织类型在总浸润污染中与未受影响的对照相比的相对份额的(折线图)。(c)每种指示的免疫类型的估计浸润的变化表示为跨nc、aap和at/au的总样品信号的分数。图5.aladin得分与疾病表型相对应。(a)在aa和健康对照之间差异表达的基因的共表达分析揭示了20个基因模块。(b)在aa和对照之间显著差异表达的所有20个基因模块的gsea显示绿色和棕色模块在比较中是最高度富集的。(c)这两个模块(圆圈)的途径分析揭示了几种免疫和免疫反应途径(橙色菱形)的显著富集，并且包括先前牵涉于gwas(黄色)、aladinctl基因(洋红色)、ctl基因(也是gwas命中)(粉红色)和aladinifn基因(蓝绿色)的基因。(d)aladin得分将患者样品分为三个维度，将免疫浸润和由基因表达反映的结构改变整合，以鉴定患者中aa严重程度的相对风险(黑色：nc，绿色：aap，红色：at/au)。(e)来自au/at患者的疾病持续时间的ctl(上图)，ifn(中图)和krt(下图)标志得分。图6.aa验证集。验证数据集中33个样品的树状图和热图。使用2002affymetrix进行使用欧几里德距离和平均连锁的分层聚类，在发现数据集中被确定为在aa患者与正常对照之间差异表达的psid用于聚类样品。图7a-7b。aa样品中的t细胞免疫基因标志。(a)使用每种浸润性免疫组织特有的标志基因对aa患者和未受影响的对照进行无监督共识聚类，允许对每个样品中的浸润进行相对定量。在这个热图中，红色表示较高的表达，白色表示较低的表达。基于标志物表达，三个主要超级聚簇被划分为低、中(med)和高相对浸润水平。(b)三个浸润超级聚簇与预后有统计学显著相关性。3×3卡方检验显示浸润严重程度可预测这些患者aa表型的严重程度。在每个单元格中显示的数字代表在伴随的超级聚簇中发现的每个临床表现的百分比，例如，在低聚簇中发现72％的nc样品。提供了卡方统计量和伴随的p值。图8a-8c。aa疾病特异性标志中的模块定义aladin成分。(a)反映基因共表达聚类结果的树状图。沿着底部的彩色条形码表示鉴定本工作中使用的20个共表达模块的分隔线。(b)当测试与20个模块关联的几种临床特征时的结果表。在每个单元格中显示相应模块和标志之间的关联的p值。细胞着色的红色加深对应关联的显著性。(c)基因集富集分析测试aa队列中每个原始aladin途径的统计学富集。在与未受影响对照的所有比较中，ifn、ctl和krt途径中的基因在预期方向上统计富集(ifn和ctl被正向富集，krt被负向富集)。图9.aladin成分区分aa表型和正常对照。在正常对照、aap和au/at样品之间比较aladin的ctl(上图)、ifn(中图)和krt(下图)成分。＊p<0.05；＊＊p<0.0001。图10.持续时间不会显著影响aap患者的aladin成分得分。在持续时间少于5年或至少5年的aap患者中比较aladin的ctl(上图)、ifn(中图)和krt(下图)组分。没有发现显著差异。图11a-11g。cd8+nkg2d+细胞毒性t淋巴细胞在皮肤中积累并且对aa小鼠中的疾病诱导是必需和足够的。(a)毛囊内根鞘中的nkg2d配体(h60)的免疫荧光染色(由k71标记)。比例尺，100微米。(b)c57bl/6、健康c3h/hej和c3h/hejaa小鼠毛囊中的cd8+nkg2d+细胞。顶部比例尺，100μm；底部比例尺，50微米。(c)c3h/hejaa小鼠的皮肤淋巴结病和细胞过多。(d)在脱发小鼠与未移植小鼠的皮肤和皮肤引流淋巴结中cd8+nkg2d+t细胞的频率(显示在盒装区域上方的数字)。(e)c3h/hej脱发小鼠的皮肤淋巴结中cd8+nkg2d+t细胞的免疫表型。(f)左侧，rae-1t表达从c3h/hej毛囊生长的真皮鞘细胞。右侧，在阻断性抗nkg2d抗体或同种型对照存在下，由aa小鼠皮肤淋巴结分离的cd8+nkg2d+t细胞诱导的剂量依赖性特异性细胞裂解。效应器与靶标的比例如图所示。数据表示为平均值±s.d.。(g)皮下注射总淋巴结(ln)细胞、单独的cd8+nkg2d+t细胞、cd+nkg2d-t细胞或耗尽nkg2d+的淋巴结细胞的c3h/hej小鼠(每组5只小鼠)的脱毛。小鼠是两个实验的代表。＊＊＊p<0.001(fisher精确检验)。图12a-12i。通过阻断针对ifn-γ、il-2或il-15rβ的抗体来预防aa。c3h/hej移植小鼠从移植时开始全身治疗。(a-h)移植后用针对ifn-γ(a，b)、il-2(d，e)和il-15rβ(g，h)的抗体全身治疗的c3h/hej移植小鼠中的aa发育。与经pbs处理的小鼠相比，在用针对ifn-γ(b)、il-2(e)和il-15rβ(h)的抗体治疗的小鼠的皮肤中的cd8+nkg2d+t细胞的频率(显示在框上方的数字)(＊p<0.05，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001。显示用同种型对照抗体或用ifn-γ(c)、il-2(f)或il-15rβ(i)抗体治疗的小鼠的皮肤中cd8和mhci类和ii型表达的皮肤活组织检查的免疫组织化学染色。比例尺，100μm。图13a-13j。全身性jak1/2或jak3抑制阻止移植c3h/hej小鼠中aa的发作。(a-j)移植后用鲁索替尼(jak1/2i)(a，b)或托法替尼(jak3i)(f，g)(＊＊p<0.01)全身治疗的c3h/hej移植小鼠的aa发展。使用pbs或jak1/2i(c)或jak3i(h)治疗的小鼠的皮肤和皮肤淋巴结中的cd8+nkg2d+t细胞的频率(盒装区域上方显示的数目)(＊＊＊p<0.001)。显示用pbs或jak1/2i(d)或jak3i(i)治疗的小鼠的皮肤中的cd8和mhci类和ii类表达的皮肤活组织检查的免疫组织化学染色。用pbs或用jak1/2i(e)或jak3i(j)治疗的小鼠的aladin得分作为log2平均表达z-得分给出。还显示了治疗停止后额外12周后的毛发再生(a，f)。比例尺，100微米。图14a-14i。下游效应激酶jak1/2或jak3的局部小分子抑制剂对已建立的aa的逆转以及aa患者的临床结果。(a)用0.5％jak1/2i(中心)、0.5％jak3i(底部)或单独的媒介物(aquaphor，顶部)在背部局部治疗具有长期aa的每组三只小鼠(移植后至少12周)，每日施加持续12周。该实验重复三次。还显示了治疗停药后额外8周的毛发再生。(b)显示为治疗后周数的毛发再生指数的时间过程。(c)与媒介物对照小鼠相比，用jak1/2i或jak3i治疗的小鼠的皮肤中cd8+nkg2d+t细胞的频率(显示在框上方的数字)(平均值±s.e.m.，每组n＝3，＊p<0.05，＊＊p<0.01)。ns，不显著。(d)aladin得分显示治疗相关的ctl和ifn标志缺失，以log2平均表达z-得分给出。(e)小鼠皮肤活组织检查的免疫组织化学染色显示治疗相关的cd8和mhci类和ii类标志物的表达缺失。比例尺，100微米。(f)使用鲁索替尼治疗患有aa的患者3，其在基线时脱发涉及其头皮的>80％，以及在口服治疗12周后的毛发再生。(g)对患者2治疗前(基线)和治疗12周后获得的活检的临床相关性研究，包括cd4、cd8和人类白细胞抗原(hla)i类(a，b，c)和ii类(dp，dq，dr)的免疫染色。比例尺，200微米。(h，i)来自患有aa的治疗的患者1和2的rna微阵列分析(在治疗之前相对于治疗之后相对于3个正常受试者)，呈现为热图(h)和累积aladin指数(i)。krt，毛囊角蛋白。图15.来自用托法替尼治疗的aa患者的头皮皮肤活检样品的的临床照片和血清cxcl10和aladin图谱。上图，拍摄了每天两次使用5mg托法替尼治疗16周的头皮后部的照片。在底部左图中，在基线和用托法替尼治疗4周后获得血液和头皮皮肤样品。进行cxcl10elisa。底部中间图，从健康对照患者(正常)和aa患者在基线(t0)和治疗4周(t4)后获得的头皮皮肤样品的aladin基因的热图。右下图，从健康对照患者(黑色)和aa患者在基线(红色)和治疗4周后(黄色)获得的头皮皮肤样品的aladin图。图16.停用口服托法替尼治疗后的脱发复发。左图，停止治疗后8周。可以发现最小程度的脱发。右图，停止治疗后16周。患者表现出毛发几乎完全丧失。图17.用口服托法替尼治疗的斑秃患者的头皮活组织检查样本。在基线(左图)和托法替尼治疗后4周(右图)h&e染色的头皮活检切片。图18.鲁索替尼治疗期间和停用之后的毛发再生。上图，在鲁索替尼治疗期间和停用之后的个体患者的salt得分。中图，鲁索替尼治疗期间和停用之后个体患者的再生百分比。底部图，来自回归模型的预测的(黑线)和实际的患者再生长轨迹(蓝线)。图19.响应鲁索替尼的aa患者的临床照片。每对的左侧图处于基线，右侧图处于使用鲁索替尼治疗结束时。图20.基于皮肤基因表达的生物标志物与临床反应相关。a，使用基线响应者和健康对照样品之间差异表达的基因对来自基线、治疗12周时的患者样品和来自健康对照的样品的热图和聚类树状图。b，在治疗后12周和在基线时取自受试者的样品的主成分图。c，aladin基因的热图。d，aladin标志的三维图。黑色，正常人；红色，在基线的aa响应患者；紫色，治疗12周后的aa患者；黄色，在基线的aa无响应患者；蓝色，治疗12周后的aa无响应者。e，aladin成分标志得分。左图，ctl标志得分；中间图，ifn标志得分；右图，krt标志得分。＊p<0.05，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001。图21：选择的患者在基线、治疗结束和停止治疗的观察结束时的临床照片。a，d，g，基线照片。b，e，h，治疗结束。c，f，i，结束观察。图22.aladin标志在响应者中通过治疗正常化。在基线时、在第12周和在某些情况下在中间或治疗后的时间点确定来自aa患者皮肤样品的aladin成分得分。蓝色，响应患者；红色，无响应的患者；黑色，正常对照(nc)患者。图23.无响应患者。a，c，e，基线照片。b，d，f，治疗结束照片。图24a-24c。基因表达分析鉴定混合组织基因标志。(a)使用aags对aap、at/au和未受影响的对照(正常)的队列进行无监督的分层聚类(蓝色，低表达，和红色，过度表达)。(b)显示基因聚簇的基因共同相似性矩阵。橙色越强，表示基因表达的差异越小。指示了aa中过表达和低表达的聚簇。(c)标志中基因以及与它们相关的统计学上富集的功能类别的图形表示。蓝色表示信号途径；黄色表示免疫/炎症途径；橙色表示hla；红色表示细胞死亡途径。这个分析保留了p<0.05fdr校正的途径。图25a-25c。ikzf1和dlx4鉴定为mr。用于使在终末器官(皮肤)中表达的基因的调节器与浸润组织(免疫细胞)中表达的基因的调节器去卷积的整个流程。(a)根据是否可以映射到皮肤网络(r)中的调节器，将从复杂的原发组织样品测量的基因(标记为a-f的浅绿节点)分配至终末器官(红色，aags)或浸润(蓝色)。只有映射到红色节点的基因才被用于mr分析。映射到蓝色节点的基因被修剪掉。(b)由此产生的aags修剪提供了与igs互相排斥的终末器官富集的基因表达标志(浅绿节点)，p＝1.77×10-4，其在aa中被过度表达(聚簇1，节点大小与倍数变化成比例)和抑制(组2)。(c)为了去卷积头皮皮肤调节器，对aags和igs进行mr分析，产生每个标志的候选调节器。只有在使用aags而不是在igs中时才会出现皮肤中的真实mr(r2)。使用aags不会检测到浸润调节器(r1)。使用aags时，ikzf1和dlx4仅具有显著的fdr值，而在使用igs时不显著(fdr＝1)(左)。该分析将ikzf1和dlx4建立为皮肤中的aags(浅绿方块)和mr(黄色方块)(右)。图26a-26e。ikzf1和dlx4的外源表达诱导上下文独立的aa样基因表达标志。(a)在用表达ikzf1、dlx4的质粒载体或表达rfp和ikzf8(缺乏dna结合结构域的同种型)的对照转染的hudp和hk中测量的基因表达的2d分层聚类。每个实验的治疗类型和细胞类型显示在热图的顶部。蓝色表示表达减少，红色表示过度表达。(b)一式四份分析转染细胞中ikzf1和dlx4mrna表达，以平均值±sem表示，标准化至b-肌动蛋白。(c)蛋白质印迹证实ikzf1和dlx4蛋白。通过在(d)ikzf1或(e)dlx4过表达之后通过aags的差异表达测定aa样应答的特异性的gsea图。这些基因在x轴上从最大到最小差异性表达从左到右排列，条形码表示ikzf1和dlx4标志基因的位置。浓度得分(es)显示在图中，标准化的富集得分(nes)显示在顶部。nes是从图的“前缘”处的es得出的，即获得的第一个最大es峰。计算nes与随机空分布比较的p值。图27a-27c。在三种培养细胞类型中，ikzf1和dlx4的外源表达诱导增加的nkg2d依赖性的pbmc相关的细胞毒性。每排左侧的示意图描述了导入pbmc进行细胞毒性测定的组织(一式三份)。颜色表示宿主来源(匹配的颜色表示宿主匹配的组织)。中间柱状图显示了孵育6小时后所获得的细胞毒性值(总条高)或添加人抗nkg2d单克隆抗体6小时后观察到的细胞毒性(灰色条)。nkg2d依赖性细胞毒性是两者之间的差异(白色条)。右边的柱状图报告了标准化至rfp对照的nkg2d依赖性细胞毒性的变化。ikzf1.2b表示用ikzf1δ载体转染的细胞，ikzf1.3b表示全长转录物。y轴报告以最大细胞毒性(总细胞计数)的分数测量的细胞毒性。所有误差条都报告±sem。＊＊表示在fdr<0.05时与rfp对照的统计学显著性差异。(a)对应于wb215jpbmc和wb215j成纤维细胞的数据集。(b)针对培养的hudp的wb215jpbmc。(c)针对培养的hk的wb215jpbmc。图28a-28c。完全重建的主调节器模块预测免疫浸润和严重程度。(a)使用外源表达数据，可以推断直接转录mrt(mr→t)，以及由作为mr的t的tf调节的t(mr→tf→t)。任何与mrikzf1或dlx4(tfa)配对并且在tfa过表达时表现出表达变化的tf(tfb)受tfa调控。随后，aags中与tfb连锁的任何基因(t)是tfa的继发性t(tfb应答)。任何对tfa转染没有应答的tfb都不受tfa调控，因此tfb调节tfa(tfb稳定，左)或两者由第三种tfc(tfb稳定，右)共调控。(b)使用这种方法，78％的aags可以映射到一个间接tfb内的ikzf1或dlx4。蓝色节点代表响应于ikzf1或dlx4表达的aags基因，节点的大小按实验观察到的倍数变化缩放(仅显示具有至少25％变化的节点)。(c)使用这些t，生成ikzf1和dlx4转录活性的单个数值得分并用于创建aa严重程度的分类器。然后将aa样品施加到搜索空间以评估准确性(上图)。该表提供了在搜索空间中跨区域呈现的分离的定量和统计数据(未受影响：nc；斑块状aa：aap；以及全秃/普秃：at/au)。质心表示可用于显示群体如何通过跨越训练的边界转变为疾病状态(底图；非病变：aap-n和病变：aap-l)。图29a-29b。可以使用相同的朴素框架为aa、ps和ad生成解卷积调节模块。(a)ps和ad的疾病相关基因表达标志可以通过差异表达明确定义。这些标志与aa基因标志的比较表明，aa标志在统计上与ps和ad标志不同(fisher's精确检验)，然而有统计学证据表明ps和ad标志之间有某些共享性。(b)将这些标志翻译成调节模块显示与aa相比完全不同的控制ad和ps的mr。黄色节点＝aa基因标志；蓝色节点＝ad基因标志；浅绿节点＝ps基因标志；橙色节点＝aamr；深蓝色节点＝admr；青节点＝psmr。提供前五个ad和psmr列表，按相应标志的覆盖率排列。还提供了没有去卷积的每个mr的p值(igsp值)(＊表示公布的调节器，而表示ad和ps一致的mr)。图30.图24的aags中富集的途径。补充的独创性途径分析显示aags内浸润群体和终末器官过程的免疫和细胞毒性信号传导级联富集。由mr调节的差异表达基因包括许多膜结合相关、细胞死亡相关和免疫相关蛋白。图31a-31b。图29的ad和ps疾病基因标志。使用基因表达进行病变的和未受影响患者样品的无监督分层聚类。使用相关的基因表达标志，患者通过临床表现清楚地分离出银屑病(a)和特应性皮炎(b)。此处提供的样品树状图用于参考图29中提供的热图。银屑病和特应性皮炎群组具有基因表达标志，其清楚地描绘来自未受影响对照的患者。图32a-32b。图27的细胞毒性测定。用于细胞毒性测定的pbmc浓度(a)和时间窗口(b)的优化鉴定了100:1的pbmc:靶标比率和至少6小时的时间以实现最佳分离。图33描绘了与本公开内容相关的用作生物标志物的snp列表。图34描绘了与本公开内容相关的用作生物标志物的snp列表。图35概述了鲁索替尼治疗aa的临床研究设计。图36概述了图35中描述的研究的状态。图37概述了图35中描述的研究的结果。图38描述了与图35中描述的研究相关的结果。图39描述了与图35中描述的研究相关的结果。图40描述了与图35中描述的研究相关的结果。图41描绘了与图35中描述的研究相关的结果。图42描绘了与图35中描述的研究相关的结果。图43描绘了与图35中描述的研究相关的结果。图44描绘了与图35中描述的研究相关的结果。图45概述了托法替尼治疗aa的临床研究设计。图46描绘了与图45中描述的研究相关的获得的结果。5.详细描述目前公开的主题涉及允许改善aa的诊断和预后以及对疾病的有效治疗的生物标志物，包括并入能够鉴定将对这些治疗作出反应的患者子群的生物标志物的方法和并入能够跟踪这些治疗的进展。a.定义根据本公开内容，“受试者”或“患者”是人类或非人类动物。尽管动物受试者优选是人，但是本发明的化合物和组合物也可用于兽医学，例如用于治疗驯养物种如犬科动物，猫科动物，鼠科动物和各种其它宠物；牛，马，绵羊，山羊，猪等农场动物物种；和野生动物，例如野生动物或动物园，如非人灵长类动物。如本文所用，术语“治疗”，“医治”等涉及获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可能是预防性的，和/或可能是对部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不利影响的治疗。如本文所用，“治疗”涵盖受试者或患者对疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防可能易患疾病但尚未诊断患有疾病的受试者发生疾病；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓解疾病，即导致疾病消退。“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以实现疾病的此类治疗的化合物或组合物的量。“治疗有效量”可以根据所使用的化合物或组合物，疾病及其严重程度，以及待治疗的受试者的年龄，体重等而变化。本文使用的术语“药物组合物”和“药物制剂”是指这样一种组合物，其形式使得其中所含有的活性成分的生物活性是有效的，并且不含有对将要施用制剂的患者是有不可接受的毒性的额外组分。本文所用的术语“药学上可接受的”，例如关于“药学上可接受的载体”，是指对受试者无毒的性质。药物制剂中的药学上可接受的成分可以是除了无毒的活性成分以外的成分。药学上可接受的载体可以包括缓冲剂，赋形剂，稳定剂和/或防腐剂。如本文所用，“jak抑制剂”是指与jak1/jak2/jak3/tyk2/stat1/stat2/stat3/stat4/stat5a/stat5b/stat6/osm/gp130/lifr/osm-rβ基因或jak1/jak2/jak3/tyk2/stat1/stat2/stat3/stat4/stat5a/stat5b/stat6/osm/gp130/lifr/osm-rβ蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或其表达的化合物。该化合物可以降低由jak1/jak2/jak3/tyk2/stat1/stat2/stat3/stat4/stat5a/stat5b/stat6/osm/gp130/lifr/osm-rβ编码的蛋白质的活性或表达。在某些实施方案中，jak抑制剂可以是氘代化合物。在某些实施方案中，氘代化合物可以通过在化合物上的一个或多个位点处氘化来修饰。本公开内容的jak抑制剂可以是针对由本文公开的相应序列编码的多肽的蛋白质，例如抗体(单克隆，多克隆，人源化，嵌合或完全人)或其结合片段。抗体片段可以是不同于全长形式的抗体的形式，并且除了已经工程化的抗体片段之外，还包括存在于全长抗体内的部分或组分。抗体片段可以包括但不限于，单链fv(scfv)，双抗体，fv和(fab')2，三抗体，fc，fab，cdr1，cdr2，cdr3，cdr可变区的组合，四抗体，双功能杂合抗体，框架区，恒定区，等等。根据本领域中建立的方法，抗体可以商业获得，定制生成，或针对感兴趣的抗原合成。本公开内容的jak抑制剂可以是结合蛋白质并破坏其功能的小分子。小分子是通常具有低分子量的多种合成和天然物质。它们可以从天然来源(例如植物，真菌，微生物等)中分离出来，可以商业获得和/或作为文库或收藏品获得或合成。可以通过计算机筛选或组合文库的高通量(htp)筛选鉴定调节蛋白质的候选小分子。大多数常规药物，例如阿司匹林，青霉素和许多化学治疗试剂是小分子，其可以商业获得，可以化学合成，或可以从随机或组合文库获得。在某些实施方案中，试剂是与靶蛋白或rna结合，相互作用或缔合的小分子。这种小分子可以是有机分子，当靶标是细胞内靶标时，能够穿透细胞的脂质双层与靶标相互作用。小分子包括但不限于毒素，螯合剂，金属和非金属化合物。小分子可以连接或缀合到靶向剂上，以特异性地将小分子引导到特定的细胞。在某些实施方案中，jak抑制剂是鲁索替尼(incb018424)，托法替尼(cp690550)，酪磷脂ag490(cas编号：133550-30-8)，莫米洛替尼(cyt387)，帕西替尼(sb1518)，巴利替尼(ly3009104)，fedratinib(tg101348)，bms-911543(cas编号：1271022-90-2)，来他替尼(cep-701)，氟达拉滨，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(egcg)，培非尼替，abt494(cas编号：1310726-60-3)9283(cas号：896466-04-9)，decernmotinib，filgotinib，gandotinib，incb39110(cas编号：1334298-90-6)，pf04965842(cas编号：1622902-68-4)，r348(r-932348，cas号：916742-11-5；1620142-65-5)，azd1480(cas编号：935666-88-9)，cerdulatinib，incb052793(incyte，临床试验id：nct02265510)，ns018(cas编号：1239358(游离碱)；1239358-85-0(hcl))，ac410(cas号：1361415-84-0(游离碱)；1361415-86-2(hcl)。)，ct1578(sb1578，cas号：937273-04-6)，jte052(日本烟草公司)，pf6263276(辉瑞公司)，r548(rigel)，tg02(sb1317，cas号：937270-47-8)，lumbricus(arrienpharmaceuticals，llc。)，ar13154(aeriepharmaceuticalsinc.)，ur67767(palaupharmasa)，cs510(深圳芯片生物科学有限公司)，vr588(vecturagroupplc)，dnx04042(dynamix制药/clevexel)，hyperforin或其组合。在某些实施方案中，jak抑制剂是特异性抑制编码jak1，jak2，jak3，tyk2，stat1，stat2，stat3，stat4，stat5a，stat5b，stat6，osm，gp130，lifr或osm-rβ的基因的表达的反义rna，sirna，shrna，微rna或其变体或修饰。b.斑秃生物标志物本公开内容的实施方案涉及治疗患者的斑秃(aa)的方法。在某些实施方案中，公开了治疗受试者中的aa的方法，其中所述方法包括：在向受试者施用治疗干预之前，期间和/或之后，检测指示受试者对治疗的响应的疾病严重程度和/或倾向的生物标志物。在某些实施方案中，生物标志物是基因表达标志。在某些实施方案中，基因表达标志包含一个或多个以下组的基因的基因表达信息：毛发角蛋白(krt)相关基因，细胞毒性t淋巴细胞浸润(ctl)相关基因和干扰素(ifn)相关基因。在某些实施方案中，krt相关基因包含dsg4，hoxc31，krt31，krt32，krt33b，krt82，pkp1和pkp2。在某些实施方案中，ctl相关基因包含cd8a，gzmb，icos和prf1。在某些实施方案中，ifn相关基因包含cxcl9，cxcl10，cxcl11，stat1和mx1。在某些实施方案中，基因表达标志是斑秃病活动指数(aladin)。斑秃患者疾病活动指数(aladin)是潜在用作追踪疾病严重程度和对治疗反应的生物标志物的三维定量复合基因表达得分。在某些实施方案中，aladin基于ctl，ifn和krt相关基因的基因表达，其中计算受试者每个样品的ctl，ifn和krtaladin得分。在某些实施方案中，相对于正常对照的平均值和标准偏差，为每个探针组计算z-得分。每个基因的z得分可以通过平均映射到该基因的探针组的z得分来获得。在某些实施方案中，然后对属于相应标志的基因的z-得分的平均值计算标志得分。在某些实施方案中，生物标志物是包括表a中列出的一种或多种基因的斑秃基因标志(aags)。在某些实施方案中，生物标志物是ikzf1，dlx4或其组合。表ac.生物标志物检测可以使用本领域已知的任何方法在生物样品中鉴定用于本公开内容的方法中的生物标志物。确定生物标志物、蛋白质或其降解产物的存在，mrna或前体mrna的存在或指示生物标志物表达的任何生物分子或产物或其降解产物的存在可通过本文所述或本领域已知的任何方法来进行以用于本公开内容的方法。核酸检测技术可以使用任何定性或定量检测核酸生物标志物的方法。例如，rna转录物的检测可以通过例如northern印迹实现，其中rna制备物在变性琼脂糖凝胶上运行，并转移到合适的载体上，例如活化的纤维素，硝化纤维素或玻璃或尼龙膜。然后将放射性标记的cdna或rna与制备物杂交，洗涤并通过放射自显影分析。rna转录物的检测可以使用扩增方法进一步完成。例如，将mrna转录成cdna然后进行聚合酶链式反应(rt-pcr)是在本公开内容的范围内；或者，如美国专利no.5,811,621中所述，为两个步骤使用单一酶，或如r.l.marshall等人，pcrmethodsandapplications4：80-84(1994)所述，将mrna逆转录成cdna，接着进行对称间隙连接酶链式反应(rt-aglcr)。在某些实施方案中，使用定量实时聚合酶链式反应(qrt-pcr)来评估生物标志物的mrna水平。可以在受影响的组织或细胞以及相邻的未受影响的组织中定量生物标志物和对照mrna的水平。在一个具体实施方案中，一种或多种生物标志物的水平可以在生物样品中定量。本文可利用的其它已知扩增方法包括但不限于pnasusa87：1874-1878(1990)中所述并且也描述于nature350(no.6313)：91-92(1991)中的所谓“nasba”或“3sr”技术，；如公开的欧洲专利申请(epa)no.4544610中所述的q-β扩增；链置换扩增(如g.t.walker等人，clin.chem.42：9-13(1996)和欧洲专利申请no.684315中所述)；以及靶向介导的扩增，如pct公开wo9322461所述。也可使用原位杂交可视化，其中放射性标记的反义rna探针与活检样品的薄切片杂交，洗涤，用rna酶切割并暴露于敏感乳剂中进行放射自显影。样品可以用苏木精染色以证明样品的组织学组成，并且用合适的光过滤器进行暗场成像显示显影乳剂。也可以使用非放射性标记如地高辛配基。评估生物标志物表达的另一种方法是通过荧光原位杂交(fish)检测生物标志物的mrna水平。fish是一种可以直接鉴定细胞中dna或rna特定区域的技术，因此可以直观地确定组织样品中生物标志物的表达。fish方法具有更客观得分系统的优点，并且存在由同一样品中所有非肿瘤细胞中存在的生物标志物基因信号组成的内在对照。荧光原位杂交是一种相对快速和灵敏的直接原位技术。fish测试也可以自动化。当通过单独的免疫组织化学难以确定生物标志物的表达水平时，可以将免疫组织化学与fish方法结合。或者，可以在dna阵列，芯片或微阵列上检测mrna表达。将对应于生物标志物的寡核苷酸固定在芯片上，然后与从受试者获得的测试样品的标记核酸杂交。用含有生物标志物转录物的样品获得阳性杂交信号。制备dna阵列的方法及其用途在本领域中是公知的。(参见例如美国专利6,618,6796；6,379,897；6,664,377；6,451,536；548,257；us20030157485和schena等人1995science20：467-470；gerhold等人1999trendsinbiochem.sci.24，168-173；和lennon等人2000drugdrugtoday5：59-65，其全部内容通过引用并入本文)。也可以进行基因表达系列分析(sage)(参见例如美国专利申请20030215858)为了监测mrna水平，例如，可以从待测试的生物样品中提取mrna，反转录，并产生荧光标记的cdna探针。微阵列能够与生物标志物杂交。然后用标记的cdna探针探测cdna，扫描载玻片并测量荧光强度。该强度与杂交强度和表达水平相关。用于检测rna的探针类型包括cdna，核糖探针，合成寡核苷酸和基因组探针。例如，所用探针的类型通常由具体情况决定，例如用于原位杂交的核糖探针和用于northern印迹的cdna。在某些实施方案中，探针针对特定生物标志物rna独特的核苷酸区域。探针可以短至差异性鉴定特定生物标志物mrna转录物所需的长度，并且可以短到例如15个碱基；然而，可以使用至少17个碱基，至少18个碱基和至少20个碱基的探针。在某些实施方案中，引物和探针在严格条件下与具有对应于靶基因的核苷酸序列的核酸片段特异性杂交。如本文所用，术语“严格条件”意指仅当序列之间存在至少95％或至少97％同一性时才发生杂交。探针的标记形式可以是任何合适的形式，例如使用放射性同位素，例如32p和35s。通过使用适当标记的碱基，可以实现用放射性同位素标记，不管探针是化学还是生物合成的。蛋白质检测技术用于检测蛋白质生物标志物的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于质谱技术，基于1-d或2-d凝胶的分析系统，色谱法，酶联免疫吸附测定(elisa)，放射免疫分析(ria)，酶免疫分析(eia)，免疫印迹，免疫沉淀和免疫组织化学。这些方法使用抗体或抗体等同物来检测蛋白质，或使用生物物理学技术。也可以使用抗体阵列或蛋白质芯片，参见例如美国专利申请号：2003/0013208a1；2002/0155493a1，2003/0017515和美国专利号6,329,209和6,365,418，其全部内容通过引用并入本文。可以进行elisa和ria程序，从而标记生物标志物标准物(用放射性同位素如125i或35s，或可测定的酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)，其与未标记的样品一起与相应的抗体接触，其上使用第二抗体来结合第一抗体，并且测定放射性或固定化酶(竞争性测定)。或者，使样品中的生物标志物与相应的固定化抗体反应，使放射性同位素或酶标记的抗生物标志物抗体与系统反应，并测定放射性或酶(elisa夹心测定法)。其他常规方法也可以适用。上述技术可以基本上作为“一步”或“两步”测定来进行。“一步”测定包括使抗原与固定化抗体接触，并且不洗涤，使混合物与标记抗体接触。“两步”测定包括在将混合物与标记抗体接触之前进行洗涤。其他常规方法也可以适用。在某些实施方案中，用于测量生物标志物表达的方法包括以下步骤：使生物样品例如血液和/或血浆与选择性结合生物标志物的抗体或其变体(例如，片段)接触，并检测结合到样品上的抗体或其变体。方法可以进一步包括使样品与第二抗体例如标记的抗体接触。该方法可以进一步包括一个或多个洗涤步骤，例如去除一种或多种试剂。可能需要将测定系统的一个组分固定在载体上，从而允许系统的其他组分与该组分接触并且容易地移除而没有费力和费时的劳动。第二相有可能远离第一相而固定，但一个相通常是足够的。将酶自身固定在载体上是可能的，但如果需要固相酶，则通常通过与抗体结合并将抗体附着到支持物上，模型和系统是本领域众所周知的。简单的聚乙烯可以提供合适的载体。可用于标记的酶不受特别限制，但可以例如从氧化酶组的成员中选择。它们通过与其底物反应来催化过氧化氢的产生，并且葡萄糖氧化酶由于其良好的稳定性，易获得性和便宜性以及其底物(葡萄糖)的容易获得性而经常被使用。氧化酶的活性可以通过在本领域公知的控制条件下测量酶标记的抗体与底物反应后形成的过氧化氢的浓度来测定。基于本公开内容，可以使用其他技术根据从业者的偏好来检测生物标志物。可以用于检测和定量生物标志物蛋白质水平的一种这样的技术是蛋白质印迹法(towbin等，proc.nat.acad.sci.76：4350(1979))。可将细胞冷冻，在裂解缓冲液中匀浆，并将裂解物进行sds-page并吸印至膜，如硝酸纤维素滤膜。然后使抗体(未标记的)与膜接触并通过第二免疫试剂例如标记的蛋白a或抗免疫球蛋白(合适的标记包括125i，辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)测定。也可以使用色谱检测。在某些实施方案中，免疫检测可以使用增强的化学发光系统(例如，来自珀金埃尔默生命科学公司，波士顿，马萨诸塞州)用针对生物标志物的抗体进行。然后可以将膜剥离并用对照抗体如来自sigma(st.louis，mo)的抗肌动蛋白(a-2066)多克隆抗体再印迹。可以使用免疫组织化学来检测生物标志物的表达和/或存在，例如在活组织检查样品中。使合适的抗体与例如细胞薄层接触，接着洗涤除去未结合的抗体，然后与第二种标记的抗体接触。标记可以通过荧光标记，酶如过氧化物酶，抗生物素蛋白或放射性标记。使用显微镜对该测定进行肉眼得分，并且可以对结果进行定量。其他机器或自动成像系统也可用于测量生物标志物的免疫染色结果。如本文所用，“定量”免疫组织化学是指对经历了免疫组织化学的样品进行扫描并评分以鉴定和定量特定生物标志物如抗原或其他蛋白质的存在的自动化方法。给予样品的得分是样品的免疫组织化学染色强度的数字表示，并且表示样品中存在的靶标生物标志物的量。如本文所使用的，光密度(od)是表示染色强度的数值得分。如本文所用，半定量免疫组织化学是指通过人眼得分免疫组织化学结果，其中受过训练的操作者在数值上对结果排序(例如，1,2或3)。本领域可获得适用于免疫组织化学的各种自动化样品处理，扫描和分析系统。这样的系统可以包括自动染色(参见例如benchmark系统，ventanamedicalsystems，inc.)和显微扫描，计算机图像分析，连续部分比较(用于控制样品的方向和大小的变化)，数字报告生成，存档和跟踪样品(如放置组织切片的载玻片)。细胞成像系统是市场上可买到的，其将常规光学显微镜与数字图像处理系统组合以对细胞和组织进行定量分析，包括免疫染色的样品。参见例如cas-200系统(becton，dickinson&co.)。针对生物标志物的抗体也可用于成像目的，例如用于检测受试者细胞中生物标志物的存在。合适的标记包括放射性同位素，碘(125i,121i)，碳(14c)，硫(35s)，氚(3h)，铟(112in)和锝(99mtc)，荧光标志物如荧光素和若丹明以及生物素。免疫酶相互作用可以使用不同的酶如过氧化物酶，碱性磷酸酶或不同的色原如dab，aec或fastred来显现。可以使用的抗体及其衍生物包括多克隆或单克隆抗体，嵌合的，人的，人源化的，灵长类动物化的(cdr-嫁接的)，饰面或单链抗体，相产生的抗体(例如来自噬菌体展示文库)以及功能抗体的结合片段。例如，可以使用能够结合生物标志物或其部分的抗体片段，包括但不限于fv，fab，fab'和f(ab’)2片段。这种片段可以通过酶裂解或通过重组技术产生。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割可分别产生fab或f(ab’)2片段。其他具有必需底物特异性的蛋白酶也可用于产生fab或f(ab’)2片段。还可以使用抗体基因以各种截短形式产生抗体，其中一个或多个终止密码子已经被引入天然终止位点的上游。例如，可以将编码f(ab’)2重链部分的嵌合基因设计为包含编码重链ch，结构域和铰链区的dna序列。合成和工程化抗体描述于例如cabilly等人，美国专利号4,816,567；cabilly等人，欧洲专利号0,125,023b1；boss等人，美国专利号4,816,397；boss等，欧洲专利号0,120,694b1；neuberger，m.s.等人，wo86/01533；neuberger，m.s.等人，欧洲专利号0,194,276b1；winter，美国专利5,225,539；winter，欧洲专利号0,239,400b1；queen等，欧洲专利号0451216b1；和padlan，e.a.等人，ep0519596a1。关于灵长类动物化抗体还参见newman，r.等人，biotechnology，10：1455-1460(1992)，和关于单链抗体参见ladner等人，美国专利号4,946,778和bird，r.e。等人，science，242：423-426(1988)。在某些实施方案中，使用特异性结合抗体以外的多肽的试剂，例如肽。可以通过本领域已知的任何方式鉴定特异性结合的肽，例如肽噬菌体展示文库。通常，可以使用能够检测生物标志物多肽的试剂，从而检测和/或定量生物标志物的存在。如本文所定义的，“药剂”是指能够鉴定或检测生物样品中的生物标志物(例如，鉴定或检测生物标志物的mrna，生物标志物的dna，生物标志物的蛋白质)的物质。在某些实施方案中，所述药剂是特异性结合生物标志物多肽的标记抗体。另外，可以使用质谱如maldi/tof(飞行时间)，seldi/tof，液相色谱-质谱(lc-ms)，气相色谱-质谱(gc-ms)，高效液相色谱-质谱(hplc-ms)，毛细管电泳-质谱，核磁共振光谱或串联质谱(例如ms/ms，ms/ms/ms，esi-ms/ms等)等来检测生物标记。参见例如美国专利申请号：20030199001,20030134304,20030077616，其通过引用并入本文。质谱方法在本领域中是公知的并且已经用于定量和/或鉴定生物分子，例如蛋白质(参见例如li等人(2000)tibtech18：151-160；rowley等人(2000)methods20：383-397；和kuster和mann(1998)curr.opin.structuralbiol.8：393-400)。此外，已经开发了允许分离的蛋白质的至少部分从头测序的质谱技术。chait等人，science262：89-92(1993)；keough等人，proc。国家科。科学院。科学。美国。96：7131-6(1999)；综述于bergman，exs88：133-44(2000)。在某些实施方案中，使用气相离子分光光度计。在其他实施方案中，使用激光解吸/电离质谱分析样品。调制解调器激光解吸/电离质谱(“ldi-ms”)可以在两个主要变体中实施：基质辅助激光解吸/电离(“maldi”)质谱和表面增强激光解吸/电离(“seldi”)。在maldi中，分析物与含有基质的溶液混合，并将一滴液体置于基质表面。基质溶液然后与生物分子共结晶。衬底被插入质谱仪。激光能量被引导至基底表面，在那里它将生物分子解吸并离子化而不会显著破碎它们。但是，maldi作为分析工具存在局限性。它不提供分馏样品的方法，基质材料可能干扰检测，特别是对于低分子量分析物。参见，例如，美国专利号5,118,937(hillenkamp等人)，和美国专利号5,045,694(beavis&chait)。有关质谱仪的其他信息，请参阅，例如，principlesofinstrumentalanalysis,3rdedition.skoog,saunderscollegepublishing,philadelphia,1985；和kirk-othmerencyclopediaofchemicaltechnology,4thed.vol.15(johnwiley&sons,newyork1995),pp.1071-1094。检测标志物或其他物质的存在通常会涉及信号强度的检测。这又反映了结合到底物的多肽的数量和特性。例如，在某些实施方案中，可以比较第一样品和第二样品的光谱的峰值的信号强度(例如，通过计算机分析等在视觉上)，以确定特定生物标志物的相对量。诸如biomarkerwizard程序(ciphergenbiosystems，inc.，fremont，ca)的软件程序可用于帮助分析质谱。质谱仪及其技术对于本领域技术人员来说是众所周知的。本领域技术人员理解，质谱仪的任何组件(例如解吸源，质量分析仪，检测器等)和各种样品制备物可以与本文所述的其他合适的组件或制剂或在本领域中已知的那些组合使用。例如，在某些实施方案中，对照样品可以含有重原子(例如13c)，由此允许在相同的质谱运行中将测试样品与已知对照样品混合。在某些实施方案中，使用激光解吸飞行时间(tof)质谱仪。在激光解吸质谱法中，将具有结合标记的底物引入入口系统。标志物通过来自电离源的激光解吸并电离成气相。产生的离子被离子光学组分收集，然后在飞行时间质量分析仪中，离子通过短的高压场加速并且漂移到高真空室中。在高真空室的远端，加速离子在不同的时间撞击敏感的检测器表面。由于飞行时间是离子质量的函数，所以离子形成和离子检测器撞击之间的时间间隔可用于鉴定特定质荷比分子的存在或不存在。在某些实施方案中，部分地通过用可编程数字计算机执行算法来确定存在于第一或第二样品中的一种或多种生物标志物的相对量。该算法鉴定第一质谱和第二质谱中的至少一个峰值。该算法然后将第一质谱的峰值的信号强度与质谱的第二质谱的峰值的信号强度进行比较。相对信号强度是第一和第二样品中存在的生物标志物的量的指示。含有已知量的生物标志物的标准物可以作为第二样品进行分析，以更好地量化存在于第一样品中的生物标志物的量。在某些实施方案中，还可以确定第一和第二样品中生物标志物的身份。d.试剂盒在某些非限制性实施方案中，本公开内容提供了用于确定鉴定患者aa的严重程度以及用于鉴定和追踪将对jak抑制剂治疗作出反应的患者子群的试剂盒。在某些实施方案中，此类试剂盒将包括用于检测选自本文阐述的生物标志物或其组合的一种或多种生物标志物的工具。本公开内容进一步提供了用于确定治疗受试者中治疗aa的疗效的试剂盒。在某些实施方案中，用于治疗受试者中的斑秃(aa)的试剂盒包含用于检测指示受试者疾病严重程度的生物标志物的一种或多种检测试剂以及用于治疗aa的一种或多种治疗试剂。本发明公开的主题可以进一步提供用于治疗受试者中的斑秃(aa)的试剂盒，其包含用于检测指示受试者对一种或多种可用于治疗aa的治疗试剂的响应倾向的生物标志物的一种或多种检测试剂和一种或多种用于治疗aa的治疗试剂。在某些实施方案中，试剂盒还包含一个或多个探针组，阵列/微阵列，生物标志物特异性抗体和/或珠子。在某些实施方案中，试剂盒还包含说明书。在某些实施方案中，治疗试剂可以选自jak抑制剂。试剂盒的类型包括但不限于包装的探针和引物组(例如taqman探针/引物组)，阵列/微阵列，生物标志物特异性抗体和珠子，其还包含一种或多种探针，引物或其他检测试剂用于检测本公开内容的一种或多种生物标志物。在某个非限制性实施方案中，试剂盒可以包括适用于聚合酶链式反应(pcr)或核酸测序的一对寡核苷酸引物，用于检测待鉴定的一种或多种生物标志物。一对引物可以包括与本文所述生物标志物互补的核苷酸序列，并且可以具有足够的长度以选择性地与所述生物标志物杂交。或者，互补核苷酸可以与生物标志物位置的5'和/或3'的足够接近的特定区域选择性杂交以进行pcr和/或测序。试剂盒中可包含多种生物标志物特异性引物，可同时测定大量生物标志物。试剂盒还可以包括一种或多种聚合酶，逆转录酶和核苷酸碱基，其中核苷酸碱基可以进一步可检测地被标记。在某些实施方案中，引物可以是至少约10个核苷酸或至少约15个核苷酸或至少约20个核苷酸长度和/或至多约200个核苷酸或至多约150个核苷酸或至多约100个核苷酸或至多约75个核苷酸或最多约50个核苷酸的长度。在某些实施方案中，寡核苷酸引物可以固定在固体表面或载体上，例如固定在核酸微阵列上，其中每个寡核苷酸引物与固体表面或载体结合的位置是已知的和可鉴定的。在某个非限制性实施方案中，试剂盒可以包括至少一种适用于原位杂交或荧光原位杂交的核酸探针，用于检测待鉴定的生物标志物。这样的试剂盒通常将包括对多种生物标志物具有特异性的一种或多种寡核苷酸探针。在某些非限制性实施方案中，试剂盒可以包括用于通过引物延伸检测生物标志物的引物。在某些非限制性实施方案中，试剂盒可以包括至少一种用于免疫检测待鉴定的生物标志物的抗体。如本领域技术人员通常已知的，可以使用常规免疫技术来制备对生物标志物特异性的多克隆和单克隆抗体。试剂盒的免疫检测试剂可以包括与给定的抗体或抗原本身相关或与其连接的可检测标记。这些可检测标记包括例如化学发光或荧光分子(若丹明，荧光素，绿色荧光蛋白，萤光素酶，cy3，cy5或rox)，放射性标记(3h,35s,32p,14c,131i)或酶(碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶)。在某个非限制性实施方案中，可以提供生物标志物特异性抗体与固体支持物例如柱基质、阵列或微量滴定板的孔结合。或者，支持物可以作为试剂盒的单独元件提供。在某些非限制性实施方案中，试剂盒可以包括适合于检测本文所述的一种或多种生物标志物或其组合的一种或多种引物，探针，微阵列或抗体。在某些非限制性实施方案中，试剂盒可以包括一种或多种适于检测本文阐述的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或更多种生物标志物的引物，探针，微阵列或抗体。在某些非限制性实施方案中，当试剂盒中的测量装置使用阵列时，上述生物标志物组可以构成至少10％或至少20％或至少30％或至少40％或至少50％百分比或至少60％或至少70％或至少80％的在微阵列上表示的标志物种类。在某些非限制性实施方案中，生物标志物检测试剂盒可以包括一种或多种检测试剂和其他组分(例如缓冲液，酶如dna聚合酶或连接酶，扩链核苷酸如脱氧核苷酸三磷酸盐，并且在sanger-进行检测或反应以检测生物标志物所必需的核酸类型dna测序反应，链终止核苷酸，阳性对照序列，阴性对照序列等)。试剂盒还可以包含检测生物标志物所需的附加组分或试剂，例如用于免疫印迹免疫组织化学的二抗。试剂盒可以进一步包括一种或多种其他生物标志物或试剂用于评估其他预后因素，例如肿瘤阶段。试剂盒可以进一步包含用于将生物标志物与标准品进行比较的工具，并且可以包括使用该试剂盒来检测感兴趣的生物标志物的说明书。例如，说明书可以描述本文阐述的生物标志物的存在指示患者aa的严重程度，或者用于鉴定和追踪将响应jak抑制剂治疗的患者子群。在某些实施方案中，试剂盒可以进一步包含治疗试剂。在某些实施方案中，治疗试剂可以是本文实施方案的jak抑制剂。e.报告、程序计算机和系统基于测定本文所述的一种或多种生物标志物和/或任何其他有关的信息，测试结果(例如个体aa的严重程度)或个体预测的药物响应性(例如，对jak抑制剂疗法的响应)在本文中可以称为“报告”。有形报告可以可选地生成为测试过程的一部分(其可以在本文中可互换地称为“报告”，或者“提供”报告，“产生”报告或“生成”报告)。有形报告的例子可以包括但不限于纸质报告(例如测试结果的计算机生成的打印输出)或存储在计算机可读介质(例如cd，usb闪存驱动器或其他可移动存储器，计算机硬盘驱动器或计算机网络服务器等)上的等同格式和报告设备。报告，尤其是存储在计算机可读介质上的报告可以是数据库的一部分，数据库可以选择性地通过因特网访问(例如存储在计算机网络服务器上的患者记录或遗传信息的数据库，其可以是“安全数据库“它具有限制访问报告的安全功能，例如只允许患者和患者的医师查看报告，同时防止其他未经授权的人查看报告)。除了生成有形报告之外或作为替代，报告还可以显示在计算机屏幕上(或其他电子设备或仪器的显示屏)上。报告可以包括例如个体aa的严重程度，或者可以仅包括本文阐述的一种或多种生物标志物的存在，缺失或水平(例如，诸如网络服务器的计算机可读介质上的报告可以包括超链接(一个或多个)描述医疗/生物学意义的一个或多个期刊出版物或网站，诸如具有某些生物标志物或某些生物标志物水平的个体的疾病风险增加或降低)。因此，例如，报告可以包括疾病风险或其他医疗/生物显著性(例如药物反应性，建议的预防性治疗等)以及可选地还包括生物标志物信息，或者报告可以包括生物标志物信息而不包括疾病风险或其他医疗/生物显著性(使得查看报告的个体可以使用生物标记信息来从报告本身之外的来源，例如来自医师、发表的出版物、网站等，来确定相关疾病风险或其他医学/生物显著性，其可以可选地链接到报告，例如通过超链接)。报告可以进一步被“传送”或“传达”(这些术语可以在本文中互换使用)，例如被测试的个体，医师(例如医生，护士，临床实验室从业者，遗传咨询师等))，医疗机构，临床实验室和/或旨在查看或拥有该报告的任何其他方或请求者。基于报告的格式，“传送”或“传送”报告的行为可以通过本领域已知的任何方式。此外，“传送”或“传送”报告可以包括传送报告(“推送”)和/或检索(“拉出”)报告。例如，可以通过各种方式传送/传送报告，包括在各方之间进行实际传送(例如用于纸质报告)，例如通过实际从一方传送到另一方，或通过电子传送或以信号形式传送(例如经由电子邮件或通过因特网，通过传真和/或通过本领域中已知的任何有线或无线通信方法)，例如通过从存储在计算机网络服务器上的数据库中检索等。在某些示例性实施方案中，所公开的主题提供了被编程为执行本文描述的方法的计算机(或其他装置/设备，诸如生物医学设备或实验室仪器)。例如，在某些实施方案中，公开的主题提供了计算机，该计算机被编程为单独地或与其他生物标志物组合接收(即作为输入)本文公开的一种或多种生物标志物的身份，并且提供(即作为输出)基于生物标志物的水平或身份的疾病严重程度或其他结果(例如药物反应性等)。这种输出(例如，疾病严重程度，药物响应性等的传达)可以例如以计算机可读介质上的报告的形式，以纸形式印刷和/或显示在计算机屏幕或其他显示器上。所公开的主题的某些进一步的实施方案提供了用于确定个体aa的严重程度或者个体是否将从jak抑制剂治疗中获益的系统。某些示例性系统包括其中个体(或其医务人员)要求确定该个体的aa严重程度(或药物反应)的集成“循环”，该测定通过测试来自个体的样品来进行，然后结果这个决定被提供给请求者。例如，在某些系统中，从个体获得用于测试的样品(例如，皮肤，血液等)(样品可以由个体或例如由医师获取)，则样品被提交(例如，确定本文公开的生物标志物，单独或与一种或多种其他生物标志物组合)，然后将测试结果发送给患者(其可选地可以通过首先将结果发送给诸如医师之类的中间人来完成，所述中间人然后向个体提供或以其他方式将结果传达给个体和/或对结果采取行动)，从而形成用于确定个体的严重程度的集成环系统aa(或药物反应等)。可以通过电子或信号传输的方式(例如通过计算机，例如通过计算机，通过计算机执行结果被传输到其中的系统的部分(例如，在测试设施，医疗从业者和/或个人之间的任何部分)电子邮件或互联网，通过在网站或计算机网络服务器上提供结果，网站或计算机网络服务器可以可选地作为安全数据库，通过电话或传真或通过本领域已知的任何其他有线或无线传输方法)。在某些实施方案中，系统由个体和/或他们的医疗执业者控制，因为个体和/或他们的医师从事要求测试，接收测试结果，并且(可选地)对测试结果起作用以减少个体疾病风险，例如通过实施疾病管理系统。本文描述的各种方法(诸如将生物标志物的存在或不存在或水平与aa的改变(例如增加或减少)严重程度相关联)可以通过自动化方法进行，例如通过使用计算机(或其他装置/设备诸如生物医学设备，实验室仪器或具有计算机处理器的其他设备/装置)，其被编程为执行本文所述的任何方法。例如，计算机软件(其可以在本文中可互换地称为计算机程序)可以将个体中存在或不存在生物标志物与个体的aa的改变(例如增加或减少)严重程度相关联。因此，所公开的主题的某些实施例提供了被编程为执行本文描述的任何方法的计算机(或其他装置/设备)。f.治疗方法在某些实施方案中，治疗受试者中的斑秃(aa)的方法包括通过检测指示aa疾病严重程度的生物标志物来鉴定所述受试者中的aa疾病严重程度并且对所述受试者施用适合于所鉴定的疾病严重程度的治疗性干预。在某些实施方案中，治疗受试者中的aa的方法包括通过检测指示患有aa的受试者对jak抑制剂治疗的响应的倾向的生物标志物来鉴定所述倾向，并且如果所鉴定的生物标志物指示受试者将对所述抑制剂作出反应的倾向则向所述受试者施用jak抑制剂。在某些实施方案中，治疗有需要的受试者的斑秃的方法包括向受试者施用jak抑制剂；检测指示对jak抑制剂治疗的响应性的生物标志物；基于响应性，通过(1)持续施用jak抑制剂，(2)改变jak抑制剂的施用，或(3)停止jak抑制剂的施用，调节jak抑制剂的施用。在某些实施方案中，生物标志物可以是基因表达标志。在某些实施方案中，基因表达标志包含一种或多种以下组的基因中的基因表达信息：krt相关基因；ctl相关基因；和ifn相关基因。在某些实施方案中，krt相关基因包含dsg4，hoxc31，krt31，krt32，krt33b，krt82，pkp1和pkp2。在某些实施方案中，ctl相关基因包含cd8a，gzmb，icos和prf1。在某些实施方案中，ifn相关基因包含cxcl9，cxcl10，cxcl11，stat1和mx1。在某些实施方案中，如果一个或多个ctl相关基因或一个或多个ifn相关基因下调至一组预定基因表达水平，和/或如果一个或多个krt相关基因上调至一组预定基因表达水平，治疗被认为是有效的并且可以继续。在某些实施方案中，如果大部分ctl相关基因和/或大多数ifn相关基因未下调至一组预定基因表达水平，和/或如果大部分krt相关基因未上调至一组预定基因表达水平，该治疗被认为是无效的并且可以停止或改变，例如，通过施用一种或多种不同的jak抑制剂。在某些实施方案中，基因表达标志是斑秃病活动指数(aladin)。在某些实施方案中，调整jak抑制剂的施用包括(1)如果ctl得分，ifn得分和krt得分中的每一个与治疗之前的得分相比降低，则继续施用jak抑制剂，(2)如果与治疗前的得分相比ctl得分，ifn得分和krt得分均不降低，则改变施用jak抑制剂，或(3)如果ctl得分，ifn得分和krt得分中的每一个与治疗之前的得分相比增加，则停止施用jak抑制剂。在某些实施方案中，检测指示对jak抑制剂治疗的响应性的生物标志物的存在在对用jak抑制剂治疗的响应性的生理征兆出现之前进行。在某些实施方案中，在用jak抑制剂治疗2周至6周后进行检测。在某些实施方案中，在用jak抑制剂治疗后一周，两周，三周，四周，五周，六周，一个月，两个月，三个月，四个月，五个月，六个月(以及其组合或这些值中的任何两个之间的范围内)进行检测。在某些实施方案中，改变jak抑制剂的施用包括改变给药间隔，剂量，制剂或其组合。在某些实施方案中，可以停用施用的特定jak抑制剂并且可以施用不同类型的jak抑制剂(在不同类别的jak抑制剂或同一类中的不同jak抑制剂)。在某些实施方案中，该方法还包括在施用jak抑制剂之前建立指示对jak抑制剂治疗的响应性的生物标志物的基线水平。在某些实施方案中，所述方法进一步包括将所述基线水平与施用后的水平进行比较，以确定在调节施用jak抑制剂之前对jak抑制剂治疗的响应性。在某些实施方案中，所述对本发明公开的生物标志物的检测是在从受试者获得的样品上进行的，并且样品选自皮肤，血液，血清，血浆，尿液，唾液，痰，粘液，精液，羊水，漱口液和支气管灌洗液。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，样品是皮肤样品。在某些实施方案中，样品是血清样品。在某些实施方案中，目前公开的生物标志物的检测通过核酸杂交测定进行。在某些实施方案中，通过微阵列分析进行检测。在某些实施方案中，通过聚合酶链式反应(pcr)或核酸测序进行检测。在某些实施方案中，生物标志物是蛋白质。在某些实施方案中，使用与蛋白质特异性结合的试剂检测蛋白质的存在。在某些实施方案中，试剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，或多克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，检测通过酶联免疫吸附测定(elisa)，免疫荧光测定或蛋白质印迹测定来进行。在某些实施方案中，所述jak抑制剂是与jak1/jak2/jak3/tyk2/stat1/stat2/stat3/stat4/stat5a/stat5b/stat6/osm/gp130/lifr/osm-rβ基因或jak1/jak2/jak3/tyk2/stat1/stat2/stat3/stat4/stat5a/stat5b/stat6/osm/gp130/lifr/osm-rβ蛋白相互作用的化合物。在某些实施方案中，jak抑制剂可以选自：鲁索替尼(incb018424)：托法替尼(cp690550)：pacritinib(sb1518)：巴利替尼(ly3009104)：fedratinib(tg101348)：decernmotinib：来他替尼(cep-701)：bms-911543(cas编号:1271022-90-2),氟达拉滨，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(egcg)，培菲替尼,abt494(cas编号:1310726-60-3),at9283(cas编号:896466-04-9),filgotinib,gandotinib,incb39110(cas编号:1334298-90-6),pf04965842(cas编号:1622902-68-4),r348(r-932348,cas编号:916742-11-5；1620142-65-5),azd1480(cas编号:935666-88-9),cerdulatinib,incb052793(incyte,临床试验id:nct02265510),ns018(cas编号:1239358-86-1(游离碱)；1239358-85-0(hcl)),ac410(cas编号:1361415-84-0(游离碱)；1361415-86-2(hcl).),ct1578(sb1578,cas编号:937273-04-6),jte052(japantobaccoinc.),pf6263276(pfizer),r548(rigel),tg02(sb1317,cas编号:937270-47-8),lumbricusrebellus提取物,arn4079(arrienpharmaceuticals,llc.),ar13154(aeriepharmaceuticalsinc.),ur67767(palaupharmas.a.),cs510(shenzhenchipscreenbiosciencesltd.),vr588(vecturagroupplc),dnx04042(dynamixpharmaceuticals/clevexel),hyperforin，其衍生物，其氘化变体，其盐，或其组合。在某些实施方案中，检测试剂可以选自荧光试剂，发光试剂，染料，放射性同位素，其衍生物或其组合。6.实施例提出以下实施例以向本领域的普通技术人员提供如何制作和使用本申请的主题的公开和描述。以下实施例并不意在限制本发明人视为当前公开的主题的范围。应该理解，鉴于以上提供的一般描述，可以实践各种其他实施方案。6.1实施例1a.简介斑秃(aa)是一种自身免疫性皮肤病，其中毛囊是免疫攻击的目标。患者典型地呈现出通常在头皮上的圆形或卵形的脱发斑块，其可以自发地消退、持续或进展为涉及头皮或全身。该疾病的三种主要表型变体是通常局限于头皮或胡须区域的小卵形区域的斑块型aa(aap)，涉及整个头皮的全秃(at)，和涉及整个身体表面区域的普秃(au)。目前没有fda批准的用于aa的药物，并且治疗通常是经验性的，但通常包括观察、未证实功效的广谱免疫抑制治疗、局部免疫治疗或病灶内类固醇。更严重的疾病形式au和at往往难以治疗。此外，皮肤科医生和治疗医师中普遍存在的假设是，长期存在的au和at变得无法恢复，或者将头皮转变为“烧伤”状态，这得到了由疾病持续时间和治疗响应性之间的负相关性的支持。尽管其高发病率和有效治疗的需要，但该疾病的分子和细胞效应物的身份尚未得到很好的研究。近来在该领域的进展已经改变了对疾病发病机理，药物靶点和潜在治疗方案的理解。特别值得注意的是与aa相关的单核苷酸多态性，其表明ulbp3和ulbp6中的多态性赋予发展该疾病的风险增加。ulbp家族基因编码充当nkg2d配体的蛋白质，并在表达时标记细胞用于天然杀伤细胞或表达nkg2d的cd8t细胞的免疫靶向。这些数据导致在aa患者的病变性头皮活检样本的皮肤切片中以及自c3h/hej小鼠自发性aa模型的受影响的皮肤和皮肤引流淋巴结中的胎盘周浸润中鉴定具有nkg2d的cd8t细胞。将来自患有脱发的c3h/hej小鼠的这种细胞群过继转移到未受影响的c3h/hej小鼠中，导致脱发的诱导，从而证实了这些效应细胞在小鼠aa模型中的关键作用。本发明人先前鉴定了突出的干扰素(ifn)和常见的γ链细胞因子(γc)标志，这两种标志都被假定为促成aa发病机制。基于这些发现，基于抑制信号分子家族的关键成员janus激酶(jaks)的治疗策略被发现在小鼠疾病模型和一系列人类患者中有效治疗aa。基因表达谱分析在选择小分子jak抑制剂治疗aa方面发挥了关键作用，并且在这方面的扩大努力包括不同的aa表型有可能为新的治疗方案和致病机制提供更多见解。在这项研究中，从总共96例aa表型范围患者和正常对照患者中收集到的120多个样品进行了分析。经过专门从事毛发病症的皮肤科医师进行表型分类后，从美国全国斑秃注册网站收集患者样品。然后使用基于微阵列的基因表达分析询问皮肤活检样品以鉴定aa特异性基因表达标志。尽管普遍认为at/au是疾病的“烧尽”形式，或者是不可恢复的，但是通过基因表达分析发现at/au样品中显著量的免疫活性，表明破坏这种免疫活性的治疗可能对治疗目的有用的可能性。此外，基于该数据，创建了斑秃病情严重程度指数(aladin)，其是基因表达度量标准，其将at/au样品、aap样品和nc样品彼此有效区分并可用于追踪在接受常规或实验性治疗的患者中的疾病活动。b.结果aa基因标志对来自96名患者的122个样品进行基因表达谱分析，所述患者包含63名患者的发现数据集和33名患者的外部验证数据集(更完整的描述参考方法部分)。基于微阵列的基因表达分析在发现数据集上进行，包括20个aap，20个at/au和23个正常对照头皮皮肤活检样本。基于aa样品与正常对照的比较鉴定差异表达的基因。为了确保来自该初始样品组的数据的稳健性，使用额外的8个aap，12个at/au和13个正常对照头皮皮肤活检样本作为验证组进行外部验证。从这组分析中，基于以绝对倍数变化(fc)>1.5和错误发现率(fdr)<0.05选择的差异表达基因产生疾病特异性基因表达谱。aa特异性疾病标志由显示增加的表达的1083个affymetrix探针和显示aa中表达降低的919个affymetrix探针组成。值得注意的是，与细胞介导的细胞毒性相关的基因(包括prf1和几种颗粒酶)以及免疫细胞运输趋化因子基因是列出的表现出增加的表达的前几个基因之一，而毛发角蛋白相关基因和发育基因如dsmg4，fgf18和gprc5d属于那些表达减少的基因。基因表达模式将表型组彼此区分开来，正常对照和at/au样品显示出最大的差异(图1a)。在地形表达图中绘制样品揭示了对应于健康对照，aap患者和at/au患者的三个聚簇。这些患者组沿着通过地形图的近似直线路径下降(图1b)。生成单一得分，根据其在该地形中的位置评估任何给定样品是aap还是at/au的相对风险。引申开来，该得分基于aa与健康对照之间所有差异表达基因的一致性(参见方法)。得分介于0-10之间，10代表最大严重程度(at/au)的风险，0代表最小风险(健康对照)。aap样品落在这两个极端之间的中间范围(得分范围2-6)。与健康对照组相比，aap组和at/au组的平均得分在统计学上是可区分的(图1b盒须图)。来自发现数据集的差异表达基因能够通过验证集中的分层聚类将aa样品与正常样品区分开来(图6)。这些数据表明aa的病理学可以在分子基因表达的水平上表达，并且aap样品表现出aa特异性标记，其介于at/au和正常对照之间。at/au皮肤样品具有免疫活性在全基因表达分析中，对照、aap和at/au之间的分子分类的线性呈现与疾病标志中免疫相关基因的存在结合，导致我们怀疑at/au样品是否具有免疫活性。由于基于差异表达水平和差异表达基因的数目，at/au样品似乎表现出比aap更严重的aa特异性标签，所以分别进行了检查与正常相比较的at/au的基因表达谱和与健康对照相比较的aap的基因表达谱。基于fc>1.5和fdr<0.05，at/au特异性疾病标志由2239个表达增加的基因和1643个表达降低的基因组成。基于相似阈值的aap特异性疾病标志显示出低得多的差异表达基因数量，仅有376个affymetrix探针具有增加的表达，537个affymetrix探针具有降低的表达。at/au和aap特异性基因列表的比较显示aap特异性基因在两个列表中重叠，少数aap特异性基因不包含在at/au特异性基因列表内(图2a)。这些数据与先前的数据一起表明，与at/au是“烧坏的”疾病状态的假设相比，at/au比更加局限的aap疾病形式更加复杂和更严重。注意到免疫相关基因的更强有力的表达，发明人试图用另一种方法证实在at/au样品中看到的更严重的基因表达谱。为了确定与aap样品相比at/au样品中观察到的t细胞浸润程度(aa中最富集且最功能相关的浸润性免疫细胞)，在at/au、aap和nc样品上进行pan-t细胞标志物cd3的免疫组织化学染色。与nc样品相比，at/au样品的免疫浸润相对量显著增加(图2b)，并且使用组织病理学得分系统(球周/毛囊周浸润)另外观察到与aap样品相比浸润增加的趋势(图2c)。这些数据表明at/au样品表现出高且持续量的免疫活性和炎症。对于在aap或at/au样品中上调的标签进行途径分析。有趣的是，在aap和au/at(图2d-2e)中上调的共有途径集合(包括“移植物抗宿主病”，“i型糖尿病”，“同种异体移植物排斥”，“细胞粘附分子”和“抗原加工和呈递”)由抗原呈递基因组成，支持aa中毛囊微环境的免疫特权丧失和免疫激活的致病主题。有趣的是，还发现“趋化因子信号传导途径”显著上调，提高了靶向这些细胞间运输分子用于治疗目的的可能性，正如对其他自身免疫性皮肤病提出的那样。这些结果表明aa中的大多数活跃免疫途径在温和以及更严重的疾病形式中是相同的。配对的病变和非病变样品在基因表达谱中相似尚不清楚aa特异性基因标志在症状出现后是否存在，或者是作为可用于区分aa受试者和未受影响的受试者的全局标签的一部分存在。为了测试aa患者的非面部皮肤是否与正常患者的皮肤显著不同，使用相应的病变皮肤(aap-ls)分析来自aa患者的另外18个非面部皮肤样品(aap-nl)作为训练组和另外8个具有相应aap-ls的aap-nl样品用于验证组。基于fc>1.5且p值<0.05，确定了aap-ls皮肤和aap-nl之间差异表达的基因，其中27个基因显示增加的表达，143个基因显示aap-ls中表达减少。检测这组基因的表达水平表明aap-nl显示出介于aap-ls和nc之间的图谱(图3a)。为了更清楚地显示可通过基因表达检测的这三个群体之间的差异，进行主成分(pc)分析。该分析试图在高度复杂的数据中鉴定最小维度，其最大程度地基于基因表达分离样品。该分析的最终结果是具有相似基因表达谱的样品紧密聚集在一起，并且具有不相似表达谱的样品彼此分开聚类。基于pc分析的第一部分，非病变样品(aap-nl)与患者匹配的病变样品(aap-ls，图3b)显示出高度可变的差异性。将所有样品与前两个主成分排列在一起与这些数据一致，aap-ls和nc样品表现出不同的聚类，而aap-nl呈现介于aap-ls和nc之间的特征(图3c)。来自验证数据集的8个aap-l/aap-nl对的pc分析的第一个组分的图表显示了在发现数据集中观察到的各对之间的相同高度可变的差异。分析非病变和病变样品之间差异表达的基因的功能注释，并发现存在于非病变样品(但不存在病变样品)中的最常见基因是毛发相关角蛋白和一些炎症反应基因(图3d)。免疫响应和浸润相关的基因，包括ccl5/13，prf1，gzmb/k，itgam和cd209，在非病变样品中缺失。这些结果表明虽然来自aa患者的非病变样品活检不完全类似于病变区域，但它们也不像健康的对照头皮皮肤。这些样品存在于与正常的未受影响的样品不同的中间状态，但尚未引发完全自身免疫响应，如在病变样品中所见。浸润基因表达标志与aa表型相关aap和at/au患者队列中显著浸润的存在以及基因表达阵列队列中免疫相关标志基因的存在使我们怀疑这些浸润是否可以在微阵列分析中直接检测到。检测浸润群体的能力将证明aa的病理和特征。为了鉴定任何浸润免疫组织，采用了独特的基因表达标志来定义几种浸润免疫细胞中的每一种，并用作免疫基因标志(igs)。这项工作为包括但不限于b细胞、t细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞的几种免疫类型提供了全面的、互相排斥的基因标志物。这些组织类型的相对浸润的数值相对测量被建立为相应igs表达的函数(图4a)。使用该度量，发明人能够逐个患者地定量每种免疫组织的相对浸润并测试它们与aa发作和严重程度的相关性(图7a-7b)。在测试的浸润物中，只有cd8t细胞和自然杀伤细胞的排序有能力将nc与aap或at/au分离。通过cd8活性排序产生三个临床表现之间的剂量依赖性分离，显著分离该三个群体(散点表示每个队列的中位数)。nk特异性标志物不反映cd8t细胞特异性标志物的能力，表明相关性可能不是nk浸润或共有的nk/cd8t细胞基因的结果。使用igs度量，发明人还估计了污染aap样品(图4b，左侧饼)和at/au样品(图4b，右侧饼)的总体浸润信号。还给出了每种免疫组织类型的总体浸润浸润变化(图4b，图表)。从基因表达数据中，观察到估计的0.8-1.4％的浸润污染，与aa的临床严重程度增加相关。一致地，只有aap或at/au患者的样品中cd8+浸润占总浸润负荷的65％以上。还显示了三种呈现中每种免疫组织浸润的绝对变化(图4c)，表明仅有cd8+浸润在三种群体中显著变化。这些结果表明，虽然有多种浸润组织类型的基于表达的证据，但与aa相关的最显著的类型是非nk的cd8+细胞。另外，发明人能够检测与巨噬细胞，总cd4+t细胞，cd4+t细胞子群，nk细胞和b细胞相关的标志物水平升高，尽管这些代表了与cd8t细胞分数相比较的次要分数。总体而言，每个样品中的污染相对较小-测试免疫组织的整个群体不超过总信号的～3％。此外，igs得分用于评估患者样品中检测到的相对th1和th2得分(图4d)。对于每个患者(aa或未受影响的对照)，样品活组织检查内的th负荷表示为th1：th2信号的比率，并观察到与正常对照相比，aa患者样品显示向更高的th1比率转变。通过mann-whitneyu检验，与aa呈现相关的th1：th2的排序变化具有统计学显著性(p＝1.02×10-4)，表明总体而言，与未受影响的患者相比，来自aa患者的皮肤含有相对于th2特征的升高水平的th1标志，尽管存在同时具有th1和th2标志的aa患者。aladin得分对应疾病表型本发明人试图产生确定aa疾病标志的最显著特征的度量，其将允许对疾病状态进行定量评估。在aa和健康对照之间差异表达的基因的加权基因共表达分析(wgcna)揭示了20个共表达基因聚簇(图5a)。这些基因集代表共同表达的模块，并表明共同调控、共享生物功能和/或共享途径的可能性。对于这些模块中的每一个，本发明人能够使用源自每个模块内的基因的基因表达标志的第一主要成分来定义颜色编码的固有基因(eigengene)或变化基因(metagene)。这些模块的基因集富集分析(gsea)与aa和nc群组之间差异表达的基因排序列表以及模块组分和疾病表型之间的关联测试显示，绿色和棕色模块与疾病表型最显著相关和这些模块(图5b，8a和8b)。这些包含免疫和免疫反应标志(绿色)和结构角蛋白(棕色)。绿色模块的途径富集分析揭示了与自身免疫响应有关的几种基因途径(图5c)。其中包括cd8，cd4，micb，ccl4/5，ccr7和icos等基因。检测到穿孔素和粒酶b以及先前由gwas元分析暗示的基因包括icos，irf1和ciita。开发了原始得分系统-斑秃疾病活动指数(aladin)，其是三维定量复合基因表达得分，其可用作追踪疾病严重程度和对治疗响应的生物标志物。该度量沿细胞毒性t淋巴细胞浸润(ctl)，ifn相关标记(ifn)和毛发角蛋白组(krt)的组合对患者评分。有趣的是，ctl标志包含两个基因，cd8a和prf1，它们组成上述的cd8t细胞标志(图4)。检查绿色模块的成分显示aladinctl和ifn标志中都含有的基因的存在，棕色标志包含构成aladinkrt标志的基因。确定患者的ctl，ifn和krt得分以测试aladin对新数据集的稳健性(图9)。96个at/au，aap和nc样品的组合发现和验证数据集的aladin得分的三维图显示at/au样品聚集在离nc样品最远处，aap样品位于这些集合的两者之间的中间位置(图5d)。在aap和at/au队列中，随后的gsea显示与正常对照相比，aa样品中原始aladin基因集的统计学显著富集(图8c)。这些数据表明，aladin得分可能区分严重程度不同的aa形式，并建议在临床试验中使用该指标。此外，发明人评估疾病的持续时间是否影响aladin得分。来自5年或更长时间病情的at/au患者的皮肤样品与来自时间较短的at/au患者的样品(图5e)相比，ifn和ctl得分显示统计学显著下降。在长期和短期aap样品之间没有发现这种关系(图10)。这些数据表明，aladin得分可区分严重程度不同的aa形式，并且进一步地，随着时间的推移，aa的更严重形式中的炎性和免疫浸润得分减少。c.讨论利用基于微阵列的全基因组基因表达测定来对aa的生物学作出基本的见解。这里的工作包括使用来自aa患者和健康对照的超过120个头皮皮肤活检样本。本发明人首次利用该方法来鉴定疾病发病机理的几个关键特征。首先，与正常对照和aap样品相比，at/au表现出相对高水平的免疫活性。at/au患者无法得到有效治疗的观点可能源于以往可用的局部和口服药物治疗这些患者的困难历史，并且难以在患有严重疾病的患者的皮肤活检样本中鉴定可观数目的基础毛发。然而，该数据挑战了这一想法，因为提供了at/au样品中的持续免疫活性等于(如果不大于)在aap中看到的活性的证据。at/au患者的这种免疫活性，结合自发消退at/au疾病的无对照的报道(尽管罕见)，意味着足够强的免疫抑制剂或针对维持免疫响应所必需的途径的治疗可能对于这些类型的患者是有效的。事实上，最近的机制数据支持aa中janus激酶介导的途径的作用，并且一些病例报道证实小分子jak抑制剂似乎是aa的有希望的类别，即使在严重或广泛疾病的情况下也是如此。其次，aa的分子定义支持cd8t细胞在人类疾病发病机制中的重要作用。当比较nc，aap和at/au样品时可见剂量反应样关系，cd8t细胞的基因表达标志逐渐增加，并且也可观察到支持的球周/毛囊周t细胞趋势。先前的研究已经表明cd8t细胞在aa的小鼠模型中是必需和充分的，并且由于nkg2d的表达和aa与nkg2dl之间的关联在aa发病机理中涉及cd8t细胞的作用。这些数据不仅进一步支持了cd8t细胞在疾病发病机制中的作用，而且还描绘了cd8t细胞参与水平与疾病严重程度/表型之间的相关性。第三，与病变aap和正常皮肤样品之间观察到的关系相比，非病变和病变的aap皮肤样品之间的相对相似性表明，aa患者中未受影响的皮肤共享至少一些导致aa患者皮肤易于发展脱发的因素。然而，由于临床上缺乏疾病，非病变性皮肤样品不具有毛囊自身免疫性破坏所需的全部因素。为了临床疾病的表现，必须克服几种免疫调节障碍来破坏耐受性，只有在发生所有这些情况时才观察到脱发。进一步检查aa患者未受影响和受影响的皮肤样品之间的差异可能对于aa发展的最终刺激性触发是有益的，可能阐明在易感群体中的新治疗或甚至预防策略。这部分工作建立了皮肤疾病过程的分子定义，并且可能会询问与蛋白质介质或细胞参与者相对应的标志。这些数据为研究者追求aa中的致病性疾病机制和治疗靶点提供了丰富的资源。d.材料和方法人类患者人口统计从四个国家斑秃基金会(naaf)注册网站收集两个独立的数据集。发现数据集包括来自63名患者(20名aap，20名at/au和23名正常对照，其中18名aap还贡献非病变皮肤的活组织检查以允许aap病变和非病变样品之间的基因表达的配对比较)的81个样品。验证数据集由来自33名患者(8名aap，12名at/au和23名正常对照，其中8名aap患者还贡献非病变皮肤的活组织检查，以允许aap病变和非病变样品之间的基因表达的配对比较)的41个样品组成。人体组织采样和处理将皮肤穿刺活检样本固定在paxgenetissuecontainers中并过夜运送至哥伦比亚大学。将样品一分为二，使用paxgene组织mirna试剂盒处理样品的一半以提取rna，并将剩余的一半嵌入石蜡中。使用ovationrnaamplificationsystemv2和biotinencore试剂盒(nugentechnologies，inc.，sancarlos，ca)进行用于微阵列分析的文库制备。随后将样品与humangenomeu133plus2.0芯片(affymetrix，santaclara，ca)杂交并在哥伦比亚大学病理学中心或耶鲁大学基因组分析中心扫描。分析包微阵列的质量控制采用http://arrayanalysis.org/的affyanalysisqc软件包进行。批次效应校正是这些研究中的差异表达，其由1.5的绝对倍数变化阈值和benjamini-hochberg校正的0.05的显著性阈值定义。使用bioconductorr软件包中提供的模块进行聚类和主成分分析。网络图像由cytoscape生成。微阵列预处理和质量控制使用bioconductor进行微阵列预处理。使用相同的流水线对两个数据集即发现数据集(63个样品)和验证数据集(33个样品)进行预处理。质量控制使用来自http://arrayanalysis.org/的affyanalysisqc软件包进行。使用gcrma和mas5分别对发现数据集和验证数据集进行标准化。affymetrixhgu-133plus2阵列包含54675个探针组(psid)。进行过滤，以便从所有阵列中去除x或y染色体上的psid，作为affymetrix对照探针组的psid，或不具有基因符号注释的psid，以便进一步下游分析。对于aladin得分的三维图，在进行gcrma标准化和校正批次效应之前，将来自两个数据集的所有96个样品合并。样品过滤和批次校正为了对发现数据集中的63个aa病变(at/au和aap)和nc样品执行分析，对psid进行进一步过滤以去除未被调用为存在于至少一个63阵列上的psid，导致36954个psid。使用sva软件包中提供的combat函数的实现，以性别和aa组(at/au，aap和常规)作为协变量，对批次效应进行校正。验证集不需要批次校正。配对的病变/非病变微阵列与正常对照一起在相同的微阵列批次内处理。配对病变/非病变分析的发现包括18个病变/非病变aap对和23个对照。验证组具有8个病变/非病变aap对和13个nc样品。为了检查配对非病变样品和非病变样品之间的关系，psid以每批中正常样品的平均表达水平为中心。验证集不需要批次校正。差异表达分析使用在bioconductor的limma软件包中实施的线性模型对批次校正的发现数据集进行差异分析。分别进行双样品比较以鉴定在aa患者与正常对照、aap患者与正常对照以及at/au患者与正常对照中差异表达的psid，性别作为固定因子。对aap-ls/aap-nl样品进行配对比较，将性别视为固定效应。因为对于大多数psid，log2(倍数变化)不超过1，以便减少保留在基因表达标志中的错误发现的数量，发明人对发现数据集进行了子采样，每次略去来自一个批次的样品，只保留那些在总数据集和所有子采样中被鉴定为差异表达的psid。主成分分析对用于进行差异表达分析的所有36954个psid进行主成分分析。假设二元分布，估计每个组(at/au，aap和nc)前两个主成分的概率密度。在发现组中使用41个aap-ls，aap-nl和正常对照样品进行主成分分析，使用已鉴定为差异表达的170个psid。组织病理学染色使用克隆ln10抗cd3一级抗体利用bondpolymerrefinereddetection(leicabiosystems，buffalogrove，il)方案进行免疫组织化学。使用0-3级(0-无免疫浸润物；1-轻度；2-中等；3-重度)进行球周/毛囊周组织病理学得分系统，其具有图2c所示的代表性实例。使用kruskal-wallis检验，在0.05的显著性水平上所有组的cd3得分的平均排序相同的无效假设被拒绝(h＝16.51，df＝2，p＝0.00026)。对所有配对比较进行wilcoxon秩和检验，并使用bonferroni校正就多重比较进行调整。在au/at和正常组(p＝4e-04)和aap和正常组(p＝0.0062)之间观察到显著差异(来自r中的货币包(coinpackage)的wilcox_test，使用分布＝“渐近”)为aa严重程度生成线性欧几里得分类器aa疾病标志的主成分分析和地形绘图揭示了nc、aap和at/au患者在由前两个主要成分(pc)定义的表达空间中的近线性依赖性。表达地形图是使用mev软件套件使用欧几里德距离作为度量和10个最近邻居作为聚类参数生成的。为了将其转换成预测严重程度的更直观的数字得分，发明人产生了对pc1和pc2有显著贡献的基因列表。这是通过对基因对每个pc的加权贡献进行排序并在权重分布的拐点之前选择基因集来完成的。然后对这些基因的表达载体进行z-得分转换和排序标准化以产生非零的统计上可比较的表达值。在逐个患者的基础上，使用每个正常化载体中的所有基因在适当的pc载体中构建质心值。每个质心值随后对应于每个患者定义为pc1×pc2的网格中的基点。然后在{pc1minxpc2min}和{pc1maxxpc2max}之间建立线性投影，并将每位患者映射到该线。然后对矢量进行标准化以结合0和10之间的值。通过执行滑动窗口分析来确定每个队列(nc0-2，aap2-6，at/au6-10)的得分断点以鉴定落入每个得分范围内的最大化nc和aap以及aap和at/au的比值比的得分值。生成一致性免疫基因标志采用每个浸润群体的独特标志基因。为了产生相对的分类器排序浸润，在将每组互斥基因就共同分离和分类能力独立地进行测试，然后将其整合到每个个体患者的一致性得分中。整合按以下步骤完成：z得分转换所有基因载体以获得可按比例比较的表达值；对这些向量进行排序转换以获得每个基因信号的有序非负值；最后对队列进行平均，以创建每个浸润组织的排序表达的一致性值。为了估计每个样品的总浸润量，根据每个患者，将一致性z-得分转化回每个单独基因的表达空间，并且针对整个群体中具有最小变异系数的管家基因的一致性进行标准化。下表显示了每种细胞类型的标志：无监督机器学习，加权基因共表达分析加权基因共表达分析(wgcna)是在combat调整表达集中的psid上进行的，其中方差超过所有psid的方差的中值。psid之间的相邻性被定义为样品间表达谱的pearson相关性，其升高到设定为10的软阈值功效等值。所得到的邻接矩阵被转换成拓扑重叠矩阵(tom)，从中计算出相异性矩阵。在不相似矩阵上进行分层聚类，并且从树形图的所得分支中鉴定模块。图5中的共表达热图和树状图是通过使用tom作为邻接度量从分配给20个模块的1/3psid的分层采样创建的。进行kruskal-wallis检验以检验模块固有基因与分类性状疾病表型、性别和naaf发病部位之间的关联性。pearson相关系数和p值在每个模块固有基因和受试者年龄之间进行估计。使用基因组富集分析(gsea)进一步测试aa中相对于不同wgcna模块中的正常对照超表达/低表达的基因的过度呈现。标准化富集得分(nes)反映了基因集合在基因排序列表的顶部或底部被过度呈现的程度，考虑了模块大小的差异。预先排序的基因列表用t统计量创建用于排序。计算aladin得分计算每个样品的ctl，ifn和krtaladin得分。简而言之，计算每个psid相对于正常对照的平均值和标准偏差的z得分。通过平均映射到该基因的psid的z得分获得每个基因的z得分。然后对属于相应标志的基因的z-得分的平均值计算标志得分。6.2实施例2a.简介aa是一种t细胞介导的自身免疫性疾病，其通过脱发来在表型上表征和在组织学上通过浸润毛囊球周围的t细胞来表征。在人异种移植模型以及c3h/hej小鼠中，总t细胞(但不是b细胞或血清)的转移可以引起疾病，c3h/hej小鼠是与人aa具有相当相似性的发生自发性aa的小鼠品系。广泛作用的病变内类固醇是aa最常用的疗法，取得了不同的成功。发展有效的、理性靶向治疗的进展受到对aa中的基础关键t细胞炎症途径的机制了解的缺乏的限制。在人类aa毛囊周围的浸润中鉴定出cd8+nkg2d+t细胞的细胞毒性子集。还发现在囊泡本身中伴随着“危险信号”ulbp3和mica(两种nkg2d配体(nkg2dl))的上调，其在疾病发病机制中的重要性也已由全基因组关联研究提出。b.结果为了确定cd8+nkg2d+t细胞对aa发病机制的贡献，本发明人使用c3h/hej小鼠模型，其自发形成斑秃并重现人类aa的许多病理特征。在来自脱发小鼠的病变皮肤活组织检查中，cd8+nkg2d+t细胞浸润过表达nkg2dl、h60和rae-1的毛囊上皮层，类似于在人类aa的皮肤活组织检查中观察到的情况(图11a-11b)。与无病c3h/hej小鼠相比，结合皮肤淋巴结病和总细胞性增加，皮肤中cd45+白细胞群体的流式细胞术分析显示患病c3h/hej小鼠的皮肤中cd8+nkg2d+t细胞的数量显著增加(图11c-11d)。其他细胞类型，包括cd4+t细胞4和肥大细胞，以远更少的数量存在。具有aa的小鼠中皮肤浸润cd8+t细胞的免疫表型与皮肤淋巴结中发现的cd8+nkg2d+群体的免疫表型相似：带有几种天然杀伤(nk)免疫受体的cd8αβ+效应记忆t细胞(tem，cd8hicd44hicd62llowcd103+)，包括cd49b和nkg2a，nkg2c和nkg2e(图11e)。这些cd8+tem细胞表达高水平的ifn-γ，并表现出对体外扩增的同基因皮肤鞘靶细胞的nkg2d依赖性细胞毒性(图11f)。使用rna-seq从脱发c3h/hej淋巴结细胞分离的cd8+nkg2d+t细胞的基因表达分析证实了效应细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的特征性转录谱，并鉴定了几种另外的nk特异性转录物。本发明人接下来评估了这些cd8+tem细胞在疾病发病机制中的需求。在转移后14周，来自患病小鼠的细胞毒性cd8+nkg2d+细胞或来自患病小鼠的总淋巴结细胞的转移在所有5个健康的c3h/hej受体中诱导aa，而耗尽nkg2d+细胞的淋巴结细胞群不能转移疾病(图11g)。因此，cd8+nkg2d+t细胞是真皮浸润中的主要细胞类型，并且对于t细胞介导的aa转移是必要和充分的。为了表征来自c3h/hej小鼠以及人aa的aa病变皮肤的转录谱，本发明人进行affymetrix微阵列分析以鉴定具有aa的个体之间的皮肤中和来自无疾病对照个体的皮肤中差异表达的基因。在病变皮肤中鉴定了三种基因表达标志：ifn响应基因，如编码ifn-诱导型趋化因子cxcl-9、cxcl-10和cxcl-11的那些，几种关键的ctl特异性转录物，如编码cd8a和颗粒酶a和b的那些，以及人和小鼠aa皮肤中的γc细胞因子及其受体，如白细胞介素-2(il-2)和il-15的转录物。由于先前显示il-2rα在人aa毛囊周围的浸润淋巴细胞上表达，本发明人对il-15及其分子伴侣受体il-15rα进行免疫荧光分析以鉴定皮肤中il-15的来源。发明人检测到人和小鼠aa中aa毛囊中两种组分的显著上调，并发现在人中浸润cd8+t细胞上表达的il-15rβ。il-2和il-15是产ifn-γ的cd8+效应子t细胞和nk细胞的众所周知的细胞毒性活性驱动因子，并且与自体反应性cd8+t细胞的诱导和/或维持有关。为了测试体内ifn-γ-和γc-靶向治疗的功效，本发明人使用良好建立的aa移植模型，其中将具有自发aa的小鼠的皮肤移植物转移到未受影响的10周大的受体c3h/hej小鼠的背部。在该模型中，aa在6-10周内在95-100％的移植受者中可靠地发展，使我们能够测试旨在预防或逆转疾病的干预措施。先前使用基因敲除研究和ifn-γ施用来研究ifn-γ在aa中的作用，其中ifn-γ缺陷小鼠具有抗性并且外源性ifn-γ沉淀疾病。在移植时施用ifn-γ的中和抗体阻止了移植受体中aa的发展并且消除了皮肤中的主要组织相容性复合体(mhc)上调和cd8+nkg2d+浸润(图12a-12c)。同样地，il-2在aa发病机制中的作用以前使用基因实验建立，其中使用移植物模型，c3h/hej背景上的il-2单倍不足赋予约50％的疾病抗性，并且该作用通过人中的基因组关联研究支持。全身给予il-2(图12d-12f)或il-15rβ(图12g-12i)的封闭抗体阻止了移植小鼠中的aa，阻断了皮肤中cd8+nkg2d+t细胞的积聚并消除了mhc上调。然而，il-21阻断未能阻止移植c3h/hej小鼠中aa的发展。值得注意的是，单独给出的这些阻断抗体均不能逆转已建立的aa(数据未显示)。本发明人接下来询问发明人是否可以通过使用jak激酶的小分子抑制剂干预下游来重新描述i型细胞因子阻断的作用，所述jak激酶在广泛的细胞表面受体的下游传导信号。特别地，ifn-γ受体和γc家族受体分别通过jak1/2和jak1/3发出信号。jak活化通过在人和小鼠脱发的毛囊而非正常毛囊中存在磷酸化的信号转导子和转录激活子(stat)蛋白(pstat1，pstat3和较少程度的pstat5)来显示。在来自c3h/hej小鼠的体外培养的皮肤鞘细胞中，外源性ifn-γ增加stat1活化，而ifn-γ+tnf-α增加表面il-15表达。美国食品和药物管理局(fda)批准的针对jak1/2激酶(jak选择性为jak1＝jak2>tyk2>>>jak3)(对ifn-γr信号传导至关重要)的小分子抑制剂鲁索替尼可抑制这些反应。在来自c3h/hej小鼠的培养的ctl效应物中，fda批准的小分子jak3抑制剂托法替尼(jak3>jak1>>jak2选择性)阻断il-15触发的pstat5激活。托法替尼还阻断真皮鞘细胞的杀伤和il-15诱导的粒酶b和ifn-γ表达的上调。为了测试这些信号传导途径的抑制是否在体内是治疗有效的，本发明人在移植时全身地给予了鲁索替尼(图13a-13c)和托法替尼(图13f-13h)，发现它们阻止了所有移植受体中aa的发展和cd8+nkg2d+t细胞的扩增。用任一种药物处理的小鼠的皮肤都没有显示出炎症的组织学征象(图13d和13i)。全皮肤活组织检查的全局转录分析显示，两种药物均可阻断皮肤炎性信号，如通过斑秃病情活动指数(aladin，图13e和13j)和基因表达动态指数(gedi)分析所测量的。本发明人接着询问全身性托法替尼治疗是否可以通过在移植后7周开始治疗来逆转已建立的疾病，这是所有小鼠已经发展为广泛aa的时间点。全身治疗导致整个身体大量的毛发再生，减少了cd8+nkg2d+t细胞的频率并逆转了组织学标志物，所有这些在治疗停止后2-3个月持续存在。接下来，为了测试更加临床相关的递送途径，发明人询问蛋白酪氨酸激酶抑制剂的局部给药是否可以在小鼠中逆转已建立的aa，其动力学类似于全身递送的动力学。在确定的疾病中，发明人发现局部鲁索替尼和局部托法替尼在逆转治疗病变(应用于背部皮肤)中都是非常有效的。经过7周的治疗，在鲁索替尼或托法替尼治疗的小鼠中出现完整的毛发，并且发明人在局部治疗后12周内观察到完全毛发再生(图14a-14b)。局部治疗与治疗的皮肤和淋巴结中cd8+nkg2d+t细胞的比例显著降低(图14c)、aladin转录标志的标准化(图14d)、疾病组织学标志物的逆转(图14e)和所有治疗小鼠中gedi的校正相关。值得注意的是，腹部的未治疗区域仍然是脱发的(例如图14a)，表明局部治疗局部起作用，并且观察到的治疗效果不是全身吸收的结果。这些效果在治疗开始后2-4周即可见，并在停止治疗后2-3个月持续存在(图14a)。为了测试jak抑制剂在患有aa的人类受试者中的效力，本发明人用鲁索替尼口服治疗3名患有中度至重度疾病的患者，20mg每天两次。目前fda批准鲁索替尼用于治疗骨髓纤维化，这是一种由造血生长因子受体下游的野生型和突变jak2信号传导驱动的疾病。此外，使用局部鲁索替尼治疗银屑病的小型临床研究已经证实可能是由于il-17信号传导轴的中断而引起的抗炎活性。口服治疗的3至5个月内，所有三种鲁索替尼治疗的患者表现出接近完全的毛发再生(例如，图14f)。在基线和治疗12周后获得的活组织检查结果的比较显示减少的毛囊周t细胞浸润，降低的人类白细胞抗原i类和ii类的囊泡表达(图14g)，和治疗后aladin炎症和毛发角蛋白标志的标准化(图14h和14i)。c.讨论总之，这些数据表明cd8+nkg2d+t细胞促进aa发病，起到了造成毛囊自身免疫攻击的细胞溶解效应物的作用。本发明人假定由cd8t细胞产生的ifn-γ导致毛囊中免疫特权的崩溃，诱导il-15的进一步产生和促进i型细胞自身免疫的前馈环。接受jak1/2抑制剂鲁索替尼治疗的少数aa患者的临床反应表明，该化合物或目前临床开发中的其他jak蛋白酪氨酸激酶抑制剂的未来临床评估在aa中是有保证的。d.材料和方法小鼠c3h/hej小鼠品系(jacksonlaboratories，barharbor，me)用于所有动物研究。只使用雌性小鼠。在移植时使用7-10周龄的脱发皮肤移植物的小鼠受者。对于预防实验，在移植后第一天开始给药。对于全身治疗研究，在小鼠失去毛发约3个月后开始给药。对于局部治疗研究，在移植后20周开始给药。所有的动物程序均按照哥伦比亚大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准的方案完成。人类研究所有的人体研究都已由哥伦比亚大学医学中心机构审查委员会批准，并根据赫尔辛基宣言原则进行。纳入研究之前，收到了参与者的书面知情同意书。斑秃中口服鲁索替尼的临床评价发明人在哥伦比亚大学医学中心皮肤病学系的临床试验部门发起了单中心概念验证临床试验，该试验题目为“开放标签试验研究以评估鲁索替尼对中度至重度斑秃的疗效“(clinicaltrials.gov标识符：nct01950780)。该初步试验研究的主要疗效终点是与基线相比，治疗结束时达到50％或更高再生的响应者比例。次要终点包括作为连续变量测量的治疗期间和之后的毛发生长的变化；患者全局评估；生活质量评估；和治疗停止后的反应持久性。纳入标准包括由salt得分测量的由斑秃(aa)引起的30至95％脱发；脱发持续时间至少3个月；稳定的脱发且没有再生的有效证据；受试者年龄18-75岁。排除标准包括aa以外的活动性头皮病；可能增加与鲁索替尼有关的风险的医学史，例如血液学，传染性，免疫相关疾病或恶性肿瘤；用任何可能影响aa响应的方式进行的当前治疗；已知与鲁索替尼相互作用的药物；怀孕；等等研究受试者用口服鲁索替尼以20mgbid治疗至少3个月。该实验中的患者已经实现了90％以上的再生长。在基线和治疗12周后获得皮肤穿孔活检(4mm)。用于小鼠治疗、流式细胞术、免疫染色和蛋白质印迹分析的抗体这些研究中使用的所有抗体列于下文的表中。流式细胞术分析使用以下抗小鼠抗体：cd3(17a2,ebioscience),cd4(gk1.5,bd),cd8α(53-6.7,bd),cd8β(yts156.7.7,biolegend),nkg2d(cx5,ebioscience),nkg2a/c/e(clone20d5,ebioscience),cd44(im7,bd),cd45(30-f11,bd),cd49b(dx5,bd),cd62l(mel-14,bd),cd69(h1.2f3,bd),cd103(2e7,ebioscience),ifnγ(xmg1.2,ebioscience),粒酶b(ngzb,ebioscience),rae-1(186107,r&d)。对于小鼠皮肤的免疫组织化学研究，用原代大鼠抗体(biolegend)对8μm甲醇固定的冷冻皮肤切片进行染色，所述抗体包括：抗cd8(克隆53-6.7)，生物素抗mhci类(克隆36-7.5)，抗-mhcii类(克隆m5/114.15.2)。使用生物素化山羊抗大鼠igg(lifetechnologies)作为第二抗体。对于免疫荧光研究，抗h60(r&d，克隆205326)，抗panrae-1(r&d，克隆186107)，抗nkg2d(r&d克隆191004)，抗il-15(scbt，h-114)，抗il-15ra(scbt，n-19)，抗k71(abcam)，第一抗体用于免疫荧光。使用alexafluor488或alexafluor594缀合的山羊抗大鼠、驴抗兔或驴抗山羊抗体作为二抗(lifetechnologies)。对于人体皮肤的免疫组织化学研究，使用5μm福尔马林固定和石蜡皮肤切片。热抗原修复后，皮肤切片用第一抗人抗体包括抗cd8(abcamab4055)，抗cd4(leica克隆1-f6)，hla1类abc(abcam克隆emr8-5)，hla-dr/dp/dq(scbt克隆cr3/43)染色。使用immpresshrp抗兔ig或小鼠ig(过氧化物酶)聚合物(vectorlab)作为二抗。在切片和染色之前将人毛囊显微切割并包埋在oct化合物中。用抗il-15(scbt，h-114)和抗il-15ra(scbt，n-19)或抗il-15rb(scbt，c-20)和cd8(scbt，c8/144b)染色8μm甲醇固定的冷冻切片，然后用alexafluor488或alexafluor594偶联的二抗(lifetechnologies)染色。所有图像都用sdrczeiss激发共聚焦显微镜拍摄。为了进行蛋白质印迹分析，用4-12％sdspage(lifetechnologies)分离处理的样品，然后转移至westranpvdf膜(gehealthcarelifesciences)。用以下ab(均来自cellsignalingtechnology)探测印迹：抗磷酸化stat1(tyr701)，抗磷酸化stat5(tyr694)，抗stat1和抗stat5。用于体内治疗的抗体小鼠抗体公司克隆catno.抗-il15rβbiolegendtm-β1123204il-2bioxcels4b6-1be0043-1il-2bioxceljes6-1a12be0043ifn-γbioxcelh22be0254il-21ebioscienceffa2116-7211-85用于流式细胞术的抗体(1/100稀释度)用于免疫染色和蛋白质印迹的抗体(1/100稀释，除非另外指明)人抗体公司克隆catno.cd3abcamps1ab699cd8scbtc8/144bsc-53212cd4leica1-f6cd4-1f6-l-cehlaclassiabcabcamemr8-5ab70328hla-dr/dp/dqscbtcr3/43sc-53302小鼠抗体公司克隆catno.cd8biolegend53-6.7100702mhc-classibiolegend36-7.5114903mhc-classiibiolegendm5/114.15.2107602h60r&dsystems205326mab1155panrae-1r&dsystems186107mab17582nkg2dr&dsystems191004mab1547小鼠/人抗体公司克隆catno.if/ihcil-15scbtpolyclonalh-114sc-7889il-15rascbtpolyclonaln-19sc-1524phospho-stat1(tyr701)cellsignalingd4a77649phospho-stat3(tyr705)cellsignalingd3a791451/200phospho-stat5(tyr694)cellsignalingc11c593591/400stat1cellsignalingpolyclonal9172stat5cellsignalingpolyclonal9363k71abcampolyclonalab133817stat1，stat5，pstat1和pstat5抗体以1/1000稀释用于蛋白质印迹il-15和il-15ra染色封闭试剂封闭试剂公司catno.il-15peprotechaf-200-15il-15ra封闭肽scbtsc-1524prna-seq分析样品在hiseq2000测序仪(illumina，sandiego，ca)上进行50个循环的测序。rna-seq文件被rockefelleruniversitygenomicscorefacility多路解编。使用fastqc进行样品fastq文件的质量控制。使用tophat将转录物映射到来自igenome的ucscmm9参照基因组。使用与此ucscmm9的igenome版本一起打包的refseq基因注释。htseq软件包中的htseq-count实用程序用于将tophatbam文件转换为可用作使用edger的差异表达下游分析的输入的计数。删除缺失的基因并添加假计数1以避免下游分析中的分母为零。edger被用于鉴定差异表达的基因，使用具有三个生物学重复的配对设计。微阵列分析质量控制，预处理对于小鼠，将cdna样品与小鼠基因组4302.0基因芯片杂交，随后洗涤，用抗生物素蛋白链菌素-藻红蛋白染色，并在hpgenearrayscanner(hewlett-packardcompany，paloalto，ca)上扫描。对于人类，将扩增的cdna与humangenomeu133plus2.0基因芯片杂交。使用bioconductor在r中进行微阵列质量控制和预处理。三个实验(1)自发aa小鼠相对正常小鼠，2)具有三种治疗的预防小鼠相对安慰剂和假手术小鼠，以及3)两种治疗的治疗小鼠相对安慰剂)的预处理使用相同的流程分别进行。质量控制使用来自http://arrayanalysis.org/的affyanalysisqc软件包进行。affyanalysisqc使用r/bioconductor软件包：affy，affycomp，affypdnn，affyplm，affyqcreport，arraytools，biodistmbiomart，simpleaffy和yaqcaffy在单个脚本中执行qc。分别对每个实验组进行rma标准化。预防实验需要使用combat进行批次效果校正。对批次、处理和时间点进行建模，将每个处理组效果视为随时间恒定，并将pbs对照分组到反映处理和时间的组中。除了对小鼠皮肤样品进行预处理之外，harshlight还用于校正人体皮肤样品的图像缺陷。数据沉积微阵列和rna-seq数据保藏在geneexpressionomnibus，登录号gse45657，gse45512，gse45513，gse45514，gse45551和gse58573中。基因标志的鉴定差异表达分析使用limma在自发小鼠3x3和人5x5数据集上进行差异基因表达的初始分析。1.5倍变化的阈值和0.05的未调整p值。无监督分析使用来自人5x5的363个基因和来自自发性小鼠3x3的和583个基因上的聚簇进行分层聚类，所述基因满足阈值abs(logfc)>1，未调整的p值≤0.05。基因以中位数为中心并标准化。使用spearman排序相关性作为相似性度量，并使用平均连锁来执行行(基因)和列(样品)聚类。使用javatreeview执行分层聚类的可视化。使用基因表达动态指数(gedi)分析来可视化用自组织映射算法鉴定的“变化基因”如何跨样品变化。变化基因是基因聚簇，其在样品中显示出类似的表达模式，并且在二维网格中被分配给单个像素。相邻的像素表现出彼此相似的表达模式。rt-pcr验证使用rt-pcr证实人和小鼠中预测的差异表达基因。根据制造商的说明，使用随机引物oligo(dt)引物和superscriptiiirt(invitrogen)的2：1的比率合成第一链cdna。在abi7300机器上进行qrt-pcr并用abi相对定量研究软件(appliedbiosystems，fostercity，ca，usa)分析。根据abi指南设计引物，并且使用powersybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems)，250nm引物(invitrogen)和20ngcdna在20μl反应体积中进行所有反应。使用以下pcr方案：步骤1：50℃2分钟；步骤2：95℃10分钟；步骤3：95℃15秒；步骤4：60℃1分钟；重复步骤3和4进行40个循环。所有样品一式四份进行三次独立运行并针对所示的内源内部对照标准化。aladin得分ifn和ctl标志被用于开发双变量得分统计。个体标志ifn和ctl得分按照人类sle中使用的程序确定。选择包含ifn和ctl标志的基因集合是ctl标志的cd8a、gzmb和icos，以及ifn标志的cxcl9、cxcl10、cxcl11、stat1和mx1。计算与假小鼠相关的预防小鼠的得分；而局部治疗实验的得分是相对于第零周的所有样品计算的。根据人体研究，aladin进一步扩展到包括毛发角蛋白(ker)标志。选择包含ker标志的基因集合是dsg4，hoxc31，krt31，krt32，kt33b，krt82，pkp1和pkp2。相对于基线时的健康对照计算从参加口服鲁索替尼临床试验的受试者获得的基线和12周皮肤活检的aladin得分。功效分析(poweranalysis)对于治疗响应的分析，在预期响应治疗的群体1(治疗组)中的真实比例是0.95，并且预期响应的群体2(安慰剂组)的真实比例是0.20的情况下，本发明人针对处理组和安慰剂小鼠各自为5个的组样品大小进行了比例功效计算的双样品比较。在α＝0.05的显著性水平下，使用巴纳德精确检验，本计算单侧检验的功效为0.803，以检测两个群体的比例为0.95和0.20和组样品大小等于5时的比例差异。在每个实验中每组存在少于5只动物的某些情况下，为了确保统计功效，多个实验被瓦解。治疗效果的统计分析预期小鼠在脱发皮肤移植后4-12周出现脱发。弃去其中对照小鼠无法显示8周脱发的实验。对于预防实验，进行了间隔删失数据的时间-事件生存分析。r中的生存和间隔包被用来执行对数秩检验。计算毛发生长指数。对于治疗实验(图14b)，r包nparld用于测试存在通过时间相互作用进行治疗的假设。使用来自每个治疗和安慰剂组的三只小鼠的三次重复实验的毛发生长指数进行分析，每组总共九只小鼠。采用f1-ld-f1设计。对于jak1/2i治疗组与安慰剂组，使用wald-type统计量和anova-type统计量，均在5％水平拒绝无相互作用假设(即平行时间分布)，p值分别为4.40e-21和3.35e-18。对于jak3i治疗与安慰剂，使用wald-type统计量和anova-型统计量，均在5％水平拒绝无相互作用的假设(即平行时间分布)，p值分别为1.45e-30，2.42e-21。所有小鼠都包括在生存(时间-事件)分析统计中。对于淋巴结和皮肤细胞分析，在治疗后的指定时间点与对照小鼠平行收获活检。在ifn-γ和il-2中和实验中，未显示脱发的五只对照小鼠中的一只未包括在照片中。为了继续监测脱发，这些小鼠没有被处死，但为了皮肤细胞分析的统计目的，这些未分析的样品被指定为0％cd8+nkg2d+细胞的细胞计数值，以允许与治疗的小鼠进行严格和保守的统计学比较。没有使用随机化，并且研究人员在实验期间或评估结果期间对于组分配不是盲的。使用不配对的参数双侧t检验来测试处理组和未处理组之间平均值和频率的差异。出于统计的目的，发明人假设所有差异对于每个组是相同的。使用间隔检查的对数秩检验来执行所有时间-事件生存分析。此测试正确计算了确切事件时间未知的数据，但事件已知落在某个时间间隔内。使用非参数纵向数据分析来测试响应x时间相互作用。这些方法特别适用于小样品量。样品大小、重复次数和实验间的统计测试对于体内研究，数据作为累积数据提供。提供的重复次数如上所示；例如“3+3+3+3”是指四个独立的实验，每个实验包括三只实验小鼠。对于体外研究，实验一式三份进行。6.3实施例3概述斑秃(aa)是美国高度流行的自身免疫性疾病，其终生风险为1.7％。然而，aa仍然是皮肤病学领域一个重要的未满足的需求，并且缺乏治疗。janus激酶抑制剂正在成为许多自身免疫病的潜在疗法，包括最近的aa。本发明人报道了用口服枸橼酸托法替尼(一种优选的jak3/jak1抑制剂)治疗aa的患者，导致显著的毛发再生和同时的皮肤和血液生物标志物变化。本发明人假设有效的托法替尼治疗斑秃将伴随着皮肤中aa相关基因表达以及循环血清cxcl10水平的改变。在基线和治疗四周后进行穿刺活检。提取总rna，逆转录，扩增，生物素化，然后与humanu133plus2.0基因芯片(affymetrix，santaclara，ca)杂交。如先前所述相对于基线时的健康对照计算aladin得分。根据制造商的说明，使用人类ip-10/cxcl10elisa试剂盒(sigma-aldrich，st.louis，mo)测定在开始托法替尼治疗前和治疗四周后采集的抽血血清的cxcl10水平。结果持续中度/重度aa的40岁白人女性参加了开放标签试点研究，以测试口服托法替尼治疗aa的疗效(https://clinicaltrials.gov/nct02299297)。她的aa在招募前5年开始在头皮上发生，并在妊娠一年内完全消退。分娩后几个月，她的aa复发为斑块状疾病。用局部皮质类固醇、蒽林霜和病变内皮质类固醇治疗效果有限。她的aa进展至涉及所有肢体、睫毛和眉毛，伴有斑块状头皮受累，并保持稳定，直到她进入临床试验(图15)。她过去的病史没有多大意义，她否认aa的家族史。患者开始用5mg托法替尼每日两次治疗。在第1个月注意到斑块再生。在治疗两个月和三个月后，她分别具有62.5％和94％的毛发再生长。注意到她眉毛和睫毛的显著再生。开始治疗4个月后毛发再生几乎完成(图15)。没有报告任何不良事件，并且在她的全血计数，完全代谢组或血脂谱方面没有实验室异常。停用托法替尼治疗导致几乎完全脱发(图16)。在基线和治疗4周后进行头皮穿刺活组织检查(图17)和抽血以监测基因表达和生物标志物变化。治疗4周后，在aa皮肤中以高水平发现的干扰素(ifn)诱导的趋化因子cxcl10的血清水平下降(图17)。另外，对皮肤活组织检查样品进行微阵列分析。基于aa疾病活动指数(aladin)，患者在基线时表现出高的ifn和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)标志，其在治疗4周时降低，尽管没有降至正常对照的水平(图17)。结论斑秃是一种自身免疫性疾病，与具有免疫功能基因的基因位点密切相关。靶向可能导致疾病发病机制的候选免疫途径是一个活跃的研究领域，jak抑制剂靶向aa中涉及的多种免疫信号途径。发明人先前已经显示全身和局部托法替尼在c3h/hej小鼠的aa移植模型中有效预防aa的发展以及逆转已建立的aa。本发明人在此报道了具有持续斑块状aa的人类受试者的有效治疗，其与相较于基线的aladin特征减少相关。6.4实施例4概述斑秃(aa)是一种常见的自身免疫性疾病，终生风险为1.7％，对其没有fda批准的治疗。本发明人先前鉴定了人和小鼠aa皮肤中细胞毒性t细胞(ctl)中的主导ifng转录标志，并且显示用jak抑制剂治疗通过靶向该途径诱导小鼠持久的毛发再生。在此，发明人研究了口服jak1/2抑制剂鲁索替尼在治疗中度至重度aa患者中的应用。本发明人发起了12名患有中度至重度aa的患者的开放标签临床试验，使用口服鲁索替尼的20mgbid进行3-6个月的治疗，然后进行停药后3个月的随访。主要终点是从基线到治疗结束时具有50％或更多的毛发再生的受试者的比例。12名患者中有9名(75％)表现出对治疗的显著应答，治疗结束时平均毛发再生率为92％。安全参数基本保持在正常范围内，并且没有报告严重的不良反应。基因表达谱分析显示炎症标志物(包括ctl和ifn响应基因的标志)的治疗相关下调，和毛发特异性标志物的上调。在这项初步研究中，使用鲁索替尼治疗的12名患者中有9名(75％)显示出明显的毛发再生和aa改善。需要更大规模的随机对照试验来进一步评估鲁索替尼治疗aa的安全性和有效性。介绍斑秃(aa)是一个主要的医学问题，并且是美国最流行的自身免疫疾病之一，终身风险为1.7％。aa影响所有种族的两个性别，并且代表第二种最常见的人类脱发形式，仅次于雄激素性脱发。aa通常呈现斑块状脱发。其中三分之一的患者在第一年内会出现自发缓解。然而，许多患者的疾病将进展为全秃(at，总头皮脱发)或普秃(au，全身脱发)。持续的中度/重度aa导致受影响个体显著毁容和心理困扰。在临床实践中，没有针对aa的基于证据的治疗，但提供了各种治疗，最常见的是局部和病变内类固醇，其功效有限。最近的研究表明，i型细胞免疫在aa发病机制中发挥主导作用，由产生干扰素-γ的带有nkg2d的cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)介导。i型细胞免疫的中心作用也反映在人类和小鼠的aa病变皮肤的转录景观中，其由ifn响应基因和ctl标志主导。这些发现提供了在aa中治疗性靶向jak1/2激酶的基本原理，并且事实上发明人表明用jak抑制剂治疗在c3h/hej小鼠中逆转了aa，并消除了皮肤中的i型炎症反应。基于临床前研究结果，发明人在中度至重度aa中开始了2期疗效信号寻求临床试验，评估了对口服鲁索替尼(目前fda批准用于治疗骨髓增殖性疾病的jak1/2抑制剂)治疗的临床和免疫病理学应答。方法研究设计、监督和参与者这项研究由哥伦比亚大学的调查团队构想和进行。所有作者都有权访问这些数据并证明其准确性以及本报告对研究协议的忠实性。本研究按照国际协调会议(ich)定义的良好临床实践(gcp)进行，并根据europeanuniondirective2001/20/ec和unitedstatescodeoffederalregulations,title21,part50(21cfr50)的道德原则进行。在开始研究之前，从哥伦比亚大学irb获得该方案和所有研究相关材料的批准。在筛选或研究相关程序之前，从每个受试者获得书面知情同意书。哥伦比亚大学临床试验办公室和外科监管团队对监管合规性和遵守irb批准的方案进行监测。该研究在开始前在clinicaltrials.gov上注册。发明人招收了12名成人患者，其中包括10名患有中度至重度aa(30-95％脱发)的患者和2名患有at或au的患者。研究评估和结果该研究的主要疗效终点是治疗结束时响应者的比例，定义为通过脱发工具严重程度(salt)得分(这是一种评估aa中的脱发的标准化的验证方法)评估的与基线相比实现至少50％再生长的那些受试者。次要疗效终点包括毛发再生长作为连续变量。此外，生活质量指标(皮肤生活质量指数-dlqi和skindex)是按照规定的预定时间间隔进行的，但未显示进行的比较的统计学差异(数据未显示)。为了评估响应耐久性，在治疗完成后追踪响应者3个月。纳入安全性分析作为接受至少一次鲁索替尼剂量并如所述的通过每月访视进行监测的所有受试者的次要终点。排除标准如果患有aa少于3个月，则排除患者；活跃、不稳定或再生aa；正在进行可能影响毛发再生的伴随治疗(招募前1个月内)；或有潜在感染、恶性肿瘤、免疫功能低下或不稳定的医疗状况的证据。还排除了头皮上伴有皮肤病的患者；或在前一个月服用实验药物或在该药物的三个半衰期内的患者。报告近期或dmard(疾病调节抗风湿病药物)使用的患者被排除在外。不良反应不良事件被分类为至少服用一剂量研究药物的患者的任何新的不利医学事件(体征，症状或异常实验室发现)或预先存在的医学状况恶化，无论该事件是否被认为具有与研究治疗之间的因果关系。在每个月的访问中评估不良事件。如果患者出现新的体征或症状，还鼓励患者在就诊期间联系研究中心。一些患者开始时白细胞计数开始适度下降，但水平保持在正常范围内，因此不需要调整剂量。一名患者血红蛋白水平降低，需要改变剂量。未观察到血小板计数显著下降。一名患者发生了2次报告的疖/脓肿。这两次发作均由患者的主要医生进行评估，并在研究小组对患者进行评估之前消退。同一名患者还报告了她曾寻求医疗护理的可能的活检部位感染，并据报告在国外时使用口服抗生素进行了治疗。一些患者发展温和的uri，被认为是季节性的，与药物无关。一名患者发生了轻微的肺炎，通过胸部x线确诊，并用口服抗生素治疗。该患者在参加研究前的数年有远处发作肺炎的病史。没有观察到临床上显著的血小板降低。没有观察到肝脏异常。一名患者在基线和治疗期间具有升高的脂质。他在研究药物期间由主治医师监测，并且没有与脂质水平有关的临床上明显的不良作用。两名患者发生与痤疮或头皮毛囊炎一致的病变。这两个发作都在几周内消退。三名患者有胃肠症状，包括腹泻。一名患者发展在预先规划的眼科手术后的结膜出血(常见的手术副作用)和短暂性痔疮出血。血小板循环水平没有伴随变化。几名患者尿液分析/显微镜检查有轻微异常。一名患者接受了尿路感染治疗。生物标志物评估和临床相关研究在基线和12周后获得活检和外周血用于免疫监测和分子研究。几位患者在治疗过程的中间时间点提供了额外的活组织检查，一位患者在第24周时提供了额外的样品。组织样本被固定并保存在paxgenetissuecontainers中。使用paxgene组织mirna试剂盒从临床试验过程中收获的皮肤活检样本中提取总rna。使用ovationrnaamplificationsystemv2和biotinencore试剂盒(nugentechnologies，inc.，sancarlos，ca)进行用于微阵列分析的文库制备。随后将样品与humangenomeu133plus2.0芯片(affymetrix，santaclara，ca)杂交并在耶鲁大学基因组分析中心扫描。从来自三名健康对照的皮肤活组织检查提取的rna的文库制备和微阵列杂交与来自治疗的患者的样品一起针对总共31个样品进行。基因表达分析包括计算aladin得分，鉴定基因表达标志的表达水平的差异表达分析，主成分分析和aladin得分的统计分析。来自31个样品的微阵列数据已经以gee80342的登录号存入geo。微阵列预处理和质量控制微阵列质量控制和预处理在r中使用bioconductor进行。质量控制使用来自http://arrayanalysis.org的r独立版本affyanalysisqc进行。使用gcrma将来自该研究的31个样品加上来自geo登录号gse53573的健康对照的另外三个样品标准化。affymetrix探针组使用在r中实现的mas5算法通过affyanalysiscc被调用为存在或不存在。在x或y染色体上的、作为affymetrix对照探针集的或没有基因符号注释的probesetid(psid)从所有阵列移除用于进一步下游分析。使用log2(强度)分析数据以获得表达水平。为了包括来自早期数据集gse58573的三个健康对照样品以计算aladin得分和增加差异表达分析中的功效，需要批次效应校正。使用combat(m-combat)的修改版本来整合来自早期geo数据集的正常样品。来自当前数据集的样品的表达水平保持固定，而m-combat用于将来自gse58573的三个健康对照样品与当前健康对照样品整合。m-combat是sva包中可用的combat函数的一个实现，它允许其中一个批次用作参考批次。计算aladin得分使用批次校正表达数据计算所有34个样品的aladin得分。ctl、ifn和krtaladin得分按照先前概述的程序确定。简而言之，计算每个psid相对于正常对照的平均值和标准偏差的z得分。通过映射到该基因的psid的平均z得分获得每个基因的得分。然后对属于相应标志的基因的得分计算标志得分的平均值。基因表达标志的鉴定为了在基线(n＝12)与正常对照(n＝6)进行鲁索替尼样品的进一步分析，进一步过滤psid以仅保留在18个样品中的至少一个上存在的特征，存在剩余的36147个psid用于进一步的下游分析。从对鲁索替尼治疗有反应的患者在时间t＝0和t＝12过滤配对样品qc后，在t＝0和t＝12有具有微阵列数据的响应鲁索替尼治疗的8名患者。进一步过滤psid以仅保留在16个样品中的至少一个上存在的特征，剩余35563个psid用于进一步的差异表达分析。差异表达分析使用在bioconductor的limma软件包中实施的线性模型，对来自t＝0和正常对照的样品和来自响应者的t＝0和t＝12的配对数据进行差异表达分析。使用2.0倍变化的阈值和0.05的未调整的p值。在基线和正常对照之间，基线处响应者和非响应者之间，基线处的非响应者和正常对照之间，基线和治疗12周时的响应者之间，以及最终在治疗12周时的响应者和正常对照之间进行比较。在t＝0和t＝12时，6名健康对照和鲁索替尼治疗患者的主成分分析对来自6名健康对照和使用鲁索替尼治疗的患者的基线和12周的样品进行主成分分析，使用在基线和正常对照的响应者之间差异表达的psid组成的响应者标志。统计分析检查所有变量的分布假设，检查精度和超出范围的值。基于先验定义，发明人根据治疗结束时的salt得分，如果患者从基线经历50％或更多的毛发再生长，则将患者分类为响应者。发明人检查了人口统计因素的整体分布，并查看了响应者和非响应者之间可能的差异，使用fisher'sexacttest(双侧)对分类变量进行显著性检验，对连续变量进行mann-whitneyu检验。发明人随后采用mann-whitneyu检验或wilcoxon符号秩检验检查了基线、治疗结束时间(eot)和研究结束时间(eos)得分之间以及响应者和非响应者在相关变量总体上的变化。为了估计随时间再生的程度，本发明人考虑了广义估计方程和混合模型方法来对重复测量数据进行建模，并且鉴于gee的强正态性假设和相对小的样品大小选择后者。对于这些混合模型，发明人首先将从基线到治疗结束的再生长建模，其中时间(以周为单位)为自变量，然后为了评估所观察到的效果的维持，将从治疗结束到研究结束的再生建模，其中时间是自变量。在两种模型中，发明人都指定复合对称作为初始协方差结构。aladin得分的统计分析为了检查响应者和无响应者、响应者和正常对照以及无响应者和正常对照中每种ctl、ifn和krtaladin得分之间可能的差异，发明人使用kruskal-wallis检验，随后是在r中的货币包中实施的wilcoxon秩和检验。发明人然后使用在r中的货币包中实施的wilcoxon符号秩检验在12周时对响应者的基线和aladin得分之间的变化进行检查。本发明人进一步测试了12周时响应者与正常对照之间三个得分的差异。定义aladin得分，使得平均ctl、ifn和krt得分等于零，从而得到平均总体(所有患者)得分，仅响应者得分和仅无响应者得分，对应于它们和正常对照之间的平均差异。在ctl(p<0.0002)，ifn(p<0.005)和krt(p<0.0002)得分中在基线的总体得分相对正常对照组之间，在ctl(p<0.0004)，ifn(p<0.0004)和krt(p<0.0004)中在基线的仅响应者相对正常对照之间；在ctl(p<0.04)和ifn(p<0.0004)中第12周的总体得分相对正常对照之间；以及在krt(p<0.0007)中α＝0.05时仅响应者相对正常对照之间观察到统计学显著性差异。在基线总体相对正常对照的ifn得分中或在第12周的仅响应者相对正常对照的ctl和ifn得分中未观察到统计学显著差异。三个aladin得分中的任何一个在基线的无响应者和正常对照之间没有观察到统计学显著差异。在基线和第12周之间评估个体患者中aladin得分的变化。在ctl和ifn得分中，在基线和第12周期间观察到统计学显著性差异，其中krt得分达到边际显著性(α＝0.05)。ctl得分从8.30下降到1.51(p<0.004)，ifn得分从31.08下降到-0.37(p<0.004)，krt得分从-39.36上升到-15.02(p＝0.054)。仅响应者中，ctl得分从9.37下降到1.6(p<0.008)，ifn得分从38.37下降到0.24(p<0.008)，krt得分从-37.84上升到-15.42(p＝0.039)。在基线时ctl和ifn得分的响应者和非响应者之间观察到统计学显著性差异(平均得分差＝5.91和40.11p<0.036和0.036)，但krt得分没有差异(平均得分差＝-19.74，p＝0.22)。结果功效这项研究是一项开放标签的临床试验，旨在研究鲁索替尼(jakafi，incytepharmaceuticals)20mgpo，每天两次用于治疗中度/重度aa。所有患者接受鲁索替尼3至6个月，然后进行3个月的观察阶段以评估治疗反应耐久性。十二名患者中的九名(75％)具有显著的毛发再生，并获得了至少50％再生的主要结果。平均基线salt得分为65.8±28.0％，3个月时降至24.8±22.9％，6个月时降至7.3±13.5％(p<0.004)。作为一个群体，受访者表现出从基线减少了92％的脱发(图18和19)，其中7名在治疗结束时达到95％以上的再生。在研究药物开始四周后立即见到响应者中的再生，并且最初呈现为由色素性终末毛发组成的不定细斑块状再生区域，除了一名患有并发性白癜风的患者(受试者4)(其主要表现出白发再生)外。值得注意的是，该患者的白癜风区域也注意到使用鲁索替尼治疗的改善。所有响应者的毛发再生都稳步增加，并且每个月都有显著的增加，导致大多数(9个中的8个)响应者在第12周访问后实现了至少50％的再生长。在3个月时对具有再生的证据的患者进行持续治疗，直到受试者达到95-100％再生长或完成6个月的治疗。在3个月的随访期内评估疗效的持久性。9名响应者中有3名注意到鲁索替尼停药后第3周开始脱落，并在停药后第12周出现显著的脱发(图21)；然而，脱发没有达到基线水平(图18)。九名响应者中有六人报告轻度增加的脱落(shedding)。生物标志物和临床相关研究在基线和治疗12周后进行的皮肤活组织检查中进行基因表达谱分析，在治疗过程中早些时候进行额外的可选活组织检查。与取自未受影响的患者的样品相比时，基线头皮样品表现出不同的基因表达谱(图20a)。在鲁索替尼治疗后，aa患者头皮样品与健康对照头皮样品聚集得比基线aa样品更密切(图20b)，表明aa致病性响应的整体标准化。基于干扰素(ifn)，细胞毒性t淋巴细胞(ctl)和毛发角蛋白(krt)标志的基因表达谱在三变量斑秃患者活动指数(aa致病性炎症反应和毛发再生的总体指数)(aladin，图20c)中评估。重要的是，最初的aa响应者在基线处聚集在aladin矩阵上，共享高ifn和ctl得分(图20c，d)。值得注意的是，来自最终aa无响应者的基线样品表现出相对低的ifn和ctl得分(图20d，e)，其与正常对照样品没有统计学差异。此外，在所述的鲁索替尼治疗的aa患者队列中，ctl和ifn标志得分能够区分基线处最终的无响应者和响应者(分别对于ctl和ifn得分，p<0.036和p<0.036)。与治疗中的靶向活性一致，在响应患者的治疗12周后采集的皮肤样品显示低得多的ifn和ctl得分，并且更接近于从aladin基质上取自正常对照患者的皮肤样品(图20d，e)。治疗后活检组织中的ifn和ctl得分下降早在开始治疗2周后即可证明(图22)。不良事件鲁索替尼的耐受性良好，并在所有12例患者中安全使用。没有严重的不良反应，没有患者需要停止治疗。观察到的不良反应很少发生，包括3例轻度细菌性皮肤感染(同一患者)，7例患者发生9次uri/过敏症状，1例uti，1例轻度肺炎，轻度gi症状和1例手术后出现结膜出血。一名患者血红蛋白降低，随剂量改变而降低。讨论在这个概念验证研究中，鲁索替尼20mg每天两次，持续3到6个月，在12名患者中的9名中诱导显著的毛发再生，在aa治疗中对鲁索替尼的总响应率为75％。相比之下，基于两项具有相似受试者群体的随机对照试验，中度至重度aa患者的预期自发缓解率(发生毛发再发，不治疗)的发生率低于12％。即使是最严重的脱发形式at/au，也表明自身免疫过程保持病原活性，并且在jak抑制下保持可逆。毛发再生在响应者的一个月内是明显的，并且发展迅速。9个响应者中有8个响应者在6个月的治疗中接近完成响应，表明6个月的治疗足以在大多数响应者中引起最大的临床缓解。在这9个月的研究中，鲁索替尼耐受性良好。在aa患者(在其它方面是健康的)的这项小规模研究中的安全性信号与先前的骨髓增生性疾病患者中鲁索替尼的临床经验有利地相比，其中的不良事件特别是血液学相关的可以理解的更频繁且与使用托法替尼治疗银屑病患者的结果一致。配对基线和治疗中头皮活检的转录分析在机理和临床上都具有信息性。来自响应者的基线皮肤样品在治疗12周后具有接近归一化的高度炎性aladinifn和ctl得分，表明jak1/2i介导的对自身反应性cd8t细胞响应的抑制。事实上，早在开始治疗后的第2周，早期aladin归一化(图22)可能预示有利的第12周临床结果。相反，无响应者样品表现出较低的基线ifn/ctl得分，并且与正常患者样品相对较近地聚类，暗示这些无响应者的脱发的替代性炎症或非炎症病因(图23)。一名无响应者既有aa又有雄激素性脱发，另一位无响应者的脱发与组织学上的aa一致，但似乎是罕见的弥漫性疾病，最终无响应者表现出瘤样aa模式。最近的单个病例报道描述了用其他jak抑制剂(包括托法替尼，鲁索替尼和巴西替尼)治疗的aa患者的临床反应。这些概念验证数据证明即使在患有长期或更严重疾病形式的患者中，作为aa基础的i型炎症反应的免疫病理学可逆性，为临床开发口服和/或局部jak抑制剂提供了强有力的理论基础用于治疗aa。6.5实施例5概述基于网络的生理行为分子建模在复杂疾病如癌症的研究中已被证明是无价的，但这些方法在涉及相互作用组织(如自身免疫)的情况下仍未被检验。在这里，使用斑秃(aa)作为模型，本发明人已经调整了调节网络分析以特异性隔离皮肤中有助于在自身免疫疾病中招募免疫细胞的生理行为。本发明人使用背景特异性调节网络以ikzf1和dlx4作为主调节器(mr)去卷积和鉴定皮肤特异性调节模块。这些mr足以在三种培养的细胞系中体外诱导aa样分子状态，导致诱导nkg2d依赖性细胞毒性。这项工作证明了一种基于网络的方法的可行性，用于区分和靶向促成自身免疫性疾病组织间相互作用的分子行为。介绍使用反向工程调控网络的系统级分析是一项新兴的计算学科，在复杂疾病(如癌症和阿尔茨海默氏病)的研究中显示出巨大的前景。这种方法能够将复杂的生理行为建模为由主调节器(mr)控制的基因模块(与疾病相关的差异表达基因的子集)。mr代表预测特异性激活或抑制目标模块的转录因子(tf)的最小数目和并且延伸的生理学行为。它们可以被视为调节生理行为的分子“开关”。通过使用诸如aracne之类的计算算法对背景特定的调节网络进行逆向工程，mr的推断成为可能。这些mr在生物学上得到验证，并作为治疗疾病病理学的靶向“中枢”。这些方法已被证明对癌症等疾病中细胞自主行为的研究非常有效。诸如胶质母细胞瘤中的间充质转化和b细胞淋巴瘤或乳腺癌中的肿瘤生成以及阿尔茨海默氏病的发生等生理学行为已与功能上与相对少量的mr相关联，mr又进而成为可用于推断患者的驱动突变的“瓶颈”或成为治疗药物筛选的目标。然而，这种类型的计算方法仅开始实施以靶向不同组织之间的致病性、非细胞自主相互作用如自身免疫性疾病。特别是，由于在调节网络生成期间做出的基本假设，推断mr不能直接使用典型的基于aracne的分析来完成：(1)所用样品相对纯或代表一个潜在的转录网络；(2)数据集的潜在分子行为存在于一个稳定的状态，使得每个样品可以被视为整个网络内调节依赖的“快照”。受污染的样品，特别是具有不同上下文特异性调节网络的组织，可能会损害调节预测的准确性。此外，当发病机制依赖于两种组织之间的相互作用时，污染基因标志与招募它们的分子模块之间总是存在假象相关性，但是在其他组织中表达。当分析由两种组织混合产生的基因表达数据时，这使得难以清楚地定义专用于一种组织或另一种组织的模块。斑秃(aa)为这种研究提供了理想的模型，因为其特征在于细胞毒性t细胞活跃地渗入正常皮肤中通常不存在的毛囊和头皮皮肤。aa典型地表现为可以散布至整个头皮(全秃)或整个身体(普秃)的独特、随机斑块的损失。先前的研究直接提示aa中的免疫基因，其中许多与其他自身免疫性疾病如1型糖尿病，乳糜泻和类风湿性关节炎一致。先前的研究已经鉴定出细胞毒性cd8阳性，nkg2d阳性t细胞浸润到aa皮肤中，并且aa的病理涉及ifn-γ依赖性信号传导途径，其经常在与癌症中的免疫逃避相关联中受到破坏。已经做了很少的工作来确定是否存在导致疾病的“终末器官”(患有自身免疫性攻击的组织)中的内在因素，例如aa中的头皮皮肤，使得该分子组分成为分析的主要目标。发明人预测，头皮皮肤的分子谱中的病原性变化将包含介导与浸润性t细胞相互作用的基因。作为推论，鉴定mr将允许对足以诱导免疫募集的模块进行调节控制。为了研究这一点，发明人利用背景特异性调节网络来对aa患者的混合标志基因表达谱进行调控去卷积。这项工作的目标是开发一个能够将混合的aa组织活检基因表达数据分离成aa病理学的皮肤特异性模块和浸润募集的框架。本发明人通过过滤不精确地映射到皮肤特异性网络的基因来鉴定aa的分子谱，其包括在头皮皮肤中浸润募集的遗传模块。这个头皮皮肤标志允许后续鉴定两个mr头皮皮肤浸润：ikzf1和dlx4。这两个基因在原发性头皮活检中表达，足以在独立的野生型细胞环境中诱导aa样分子标记和nkg2d依赖性细胞毒性，从而允许直接基因诱导免疫介导的细胞毒性。结果aa中致病性表达标志的初始定义揭示局部头皮皮肤和浸润免疫信号的存在首先，发明人创建了一个分子标记，比较aa患者与对照以产生aa的分子表示。发明人分析了来自34个独特活检样品的初始队列的患者活组织检查的微阵列研究的训练组：21个不同临床表现的aa患者和13个未受影响的对照。本发明人另外对21名aa患者中的12名进行患者匹配的非病变头皮活组织检查。这34名患者被收集为两个队列中的第一个，总共96名患者，其余的保存用于验证研究。发明人通过比较两种不同的临床表现(斑块状aa(aap)和全秃和普秃(at/au)，全部针对未受影响的对照)来创建总体基因表达标志。为了解释与浸润的次要影响(例如脱发)有关的标志中的假象，本发明人然后在一组患者匹配的病变(具有脱发的症状性皮肤)和非病变性(无症状的具有毛发的皮肤)样品上使用该基因标志进行分层聚类。该分析确定了这些样品与那些在病变和非病变样品中系统等效的样品之间差异表达的基因聚簇。发明人随后从第一个表达集中去除了与病变与非病变状态相关的聚簇中的任何基因。这主要从标志中除去了大量(但不是全部)的角蛋白和角蛋白相关蛋白。由此产生的基因表达标志斑秃基因标志(aags)由总共136个独特基因组成(表a)，并提供足够的信息将整个训练队列聚类成对应于对照和疾病状态的两个适当的超级聚簇(图24a)。通过共表达将这些基因聚类也揭示了两种不同的基因模块，在疾病状态中上调的基因中共表达的多样性更大(图24b)。作为受影响和未受影响患者之间差异表达的基因的定性测量，发明人分析了他们的功能注释富集。该分析揭示了受影响的患者样品中hla基因，免疫响应元件和炎症和细胞死亡途径基因表达的存在(图24c)。aags的两个最重要的超级聚簇是跨膜信号肽(p＝2.8×10-11)和分泌的细胞信号肽(p＝2.1×10-10)。正如预期的那样，该列表还包含与aa和自身免疫疾病相关的几种抗原呈递元件和免疫响应元件(图30)。这些结果表明aa-呈递细胞中的多种生物学过程显著改变。本发明人假定这些基因的一些子集来源于头皮皮肤并且需要诱导浸润募集。还有一些重要的证据表明源自浸润免疫细胞的免疫相关基因必须事先过滤；否则他们会混淆皮肤特异性分子程序的鉴定。与免疫细胞或免疫反应相关的基因标志物被检测为aags的一部分，包括cd8a，cxcl9/10和ccl5/18/20/26。在初级患者活组织检查样品中，由于aa皮肤样品中存在浸润性t细胞和二级反应途径，定义促成aa的皮肤特异性分子行为是一项困难的任务。利用调节网络将aags中的皮肤和免疫标志去卷积成调节模块有了明确的疾病标记定义，发明人试图以源于浸润免疫细胞的分子程序以系统性、无偏见的方式去卷积aags中的皮肤分子程序。除了使用go途径富集或其他基于先验知识和可能含糊不清的注释的基于注释的方法之外，发明人改为使用推断的调节网络，假设发明人可以通过鉴定基因来过滤非皮肤(免疫浸润)基因表达无法映射到特定于皮肤的调节网络。使用aracne算法和相关软件套件生成头皮皮肤的转录调控网络(参见实验程序)。具体而言，为了产生网络，本发明人包括由正常(未受影响)全皮肤活组织检查组成的106个原发性头皮皮肤样品和几个原代培养的真皮成纤维细胞样品和真皮乳头细胞的样品，其含有很少或没有t细胞浸润。该网络代表未经浸润皮肤组织中的调节网络，并作为解卷积的基石，如图25所示，这两个主要步骤发生。对于调节模块的解卷积，aags中的基因直接映射到调节网络(图25a；详细参见实验程序)。aags中的基因仅在使用皮肤aracne网络(红色，固体边缘)的调节逻辑与其与tf之间存在直接调节相互作用时才被保留。任何来自浸润免疫细胞的独特基因都不会在aracne网络中具有显著的表现，并且随后从皮肤的aags(黑色，虚线边缘)中移除并添加到免疫基因标志(igs)中。igs被用作“阴性对照”标志，改编自以前在表征癌症免疫浸润物方面的工作。特征被定义为在每种免疫细胞类型中特异性表达的一组基因，包括t细胞，b细胞，肥大细胞和巨噬细胞。这一步通过将那些可以通过非浸润性调节网络(aags)进行调节的基因与那些不能进行调控的基因(igs)分开来重复定义aags和igs。通过扩展，发明人预计过滤的aags在皮肤基因表达中足够富集以产生准确的皮肤特异性调节子。如图25b所示，当穿过皮肤特异性调节网络时，13个浸润特异性基因从aags中去除(总标志的9.5％)。这些基因也列在表a中。这导致了两个互斥的基因模块(无重叠基因，p＝1.77×10-4)，aags和igs。随后的途径富集分析进一步证实了“t细胞活化”和“免疫响应”类别的统计学富集的丧失，同时保留了其他聚簇包括已知的皮肤免疫响应元件(例如hla基因)。这在aags中总共留下了123个基因，发明人解释这些基因代表与aa病理相关的所有终末器官程序，包括终末器官启动的免疫募集和免疫响应(表a，加星号的条目)。注意发明人已经区分了与免疫细胞相关的注释(例如cd8a)和与免疫响应基因(例如hla)相关的注释之间的区别。前者被调节网络删除，没有在皮肤调节网络中表示。后者是本发明人旨在保留的标志基因，因为它们代表皮肤中的反应元件并且与疾病的病理学相关。聚类过滤的aags揭示了两种不同的分子模块，其定义了从未受影响的患者(图25b，第二)到aa疾病状态(图25b，第三)的转变。每个节点代表标志中的一个基因，其大小代表每个状态中的相对表达(较大意味着较高的表达)。本发明人对这些基因群进行了标记：(1)转变到疾病状态时其表达增加的基因，和(2)在转换中表达丧失的基因。该过滤的aags反映了器官特异性末端基因模块，并作为mr分析的输入。ikzf1和dlx4是皮肤aags的mr，并通过扩展浸润招募下一步是鉴定终末器官特异性mr的最重要的步骤。本发明人使用头皮皮肤调节网络(图25c，第一，红色轮廓)独立地并且平行地对去卷积的aags和igs两者进行mr分析。仅使用皮肤中表达的调控相互作用，发明人鉴定了对去卷积aags具有最高特异性的转录调节子(红色箭头)并重复igs分析(黑色箭头)。该步骤将aags与毛发皮肤中的调节逻辑相比较，而不是直接覆盖基因表达。这种分析测定tfs是使用特定于皮肤的分子调节网络的解卷积aags(而不是igs)的最佳候选者。本发明人通过仅保留在aags覆盖中具有重要意义并且对于igs覆盖无关紧要的候选人来鉴定皮肤特异性候选mr。在专门针对aags的重要候选mr中，发明人采用了贪婪的种类来确定最大化aags覆盖率所需的最少数量的调节因子。发明人发现两个mr足以覆盖>60％的aags：ikzf1和dlx4。任何额外的候选人提高了覆盖率，统计学上不显著(<5％)。本发明人得出结论，可以通过这两个基因(ikzf1p＝4.17×10-4和dlx4p＝4.8×10-10fdr校正的)实现最大aags保真度(表达标记的最忠实再现)和效率(最少必需的调节子)。在使用头皮-皮肤调节网络时，对igs模块进行的等效mr分析未能产生任何统计学显著或有意义的mr。具体而言，aags，ikzf1和dlx4的最佳候选人下降到统计不相关性(分别从第一和第二降至第159和第210，fdr＝1)(图25c，igs.fdr)。在没有去卷积的情况下对aags进行mr分析未能在通常预期的阈值(在p值和标志覆盖范围内)产生mr候选，这是由于标志中存在污染基因而不能准确地映射到mr，但是尽管如此，在分析中针对富集计数。这两个候选人代表使用来自特定组织背景(头皮皮肤)的调节相互作用重新创建aags所需的调节机构的最低数量，与使用该方法解卷走的任何免疫特异性调控模块不同。因此，ikzf1和dlx4代表了头皮皮肤中的基因调节模块，其有助于aa发病机制(图25c，最后)，并且可能足以以aa样方式诱导渗入募集。ikzf1的鉴定是出人意料的，因为它是一种成熟的t细胞分化因子，尽管ikzf1可能在免疫系统之外的细胞中起作用的先例不是。然而，重要的是要指出，这一分析并不意味着像ikzf1这样的mr在导致aa发病机制的t细胞中没有作用，而是有证据表明ikzf1另外在头皮皮肤中起作用以介导在组织之间的相互作用。ikzf1和dlx4的表达在正常毛囊皮肤乳头和人角质形成细胞中诱导aags样标志为了用功能研究验证mr预测，本发明人在皮肤来源的细胞系和培养的细胞中外源过量表达ikzf1和dlx4以测试影响aags表达的充分性。本发明人克隆了dlx4和两种ikzf1同种型用于在培养细胞中进行外源性表达。活性ikzf1同种型用作研究的实验组，而缺乏dna结合结构域的同种型作为阴性对照(ikzf1δ)。发明人在培养的原代人毛囊真皮乳头(hudp)和人角质形成细胞(hk)中表达这些基因。这个实验系统允许我们直接测试两个不同但相关的假设：(1)ikzf1和dlx4可以诱导免疫细胞的aa样募集；(2)它们通过在皮肤中表达(而不是免疫浸润)。本发明人鉴定了在两种细胞类型的ikzf1和dlx4转染中在相同方向上显著差异表达的一组基因。基于这些转录物的所有样品的无监督分层聚类揭示ikzf1δ和rfp(红色荧光蛋白)对照的ikzf1和dlx4转染的清洁共分离(图26a)。此外，发明人观察到，这些超群内的子群不基于所使用的细胞类型(hk不与hk聚类，并且dp不与dp聚类)，支持发明人已经鉴定了mr过度表达的背景独立效应。有趣的是，发明人观察到dlx4转染导致ikzf1转录物和蛋白质水平升高，而ikzf1转染不影响dlx4表达(图26b和26c)。发明人随后使用基因集富集分析(gsea)询问了用于富集aags基因的表达数据。发明人进行了两种差异基因表达研究，比较ikzf1转染对rfp对照和dlx4转染对rfp对照。结果显示mr的异位表达随后显著富集aags的诱导(ikzf1p＝0.012和dlx4p＝2.08×10-4；图26d和26e)。ikzf1和dlx4表达足以在正常培养的皮肤中诱导nkg2d介导的细胞毒性ikzf1和dlx4过表达表明，这两个基因是应用于hk和hudp时能够介导aags的mr。然而，这些mr对自身免疫和免疫浸润的功能相关性是它们的表达是否足以诱导靶向的自身免疫响应。为了体外研究这种情况，本发明人进行了测量当暴露于外周血单核细胞(pbmc)时hk和hudp细胞中的细胞毒性细胞死亡水平的实验。发明人再次用四种表达构建体之一(ikzf1，dlx4，rfp(阴性对照)或ikzf1δ(阴性对照))再次转染hk和hudp细胞。在转染后24小时，将这些细胞与新鲜的纯化的pbmc一起温育。本发明人另外培养人皮肤成纤维细胞和自体健康供体pbmc。pbmc来自没有aa或任何其他自身免疫疾病史的健康对照受试者。在所有比较中，发明人观察到与rfp和ikzf1δ对照相比，ikzf1和dlx4转染的pbmc依赖性细胞毒性的统计学显著增加(图27，中心列，总条高)。正如在健康靶细胞中预期的那样，患者匹配的pbmc和rfp对照转染的成纤维细胞没有表现出细胞毒性相互作用的证据(图27a，中心)。然而，引入ikzf1和dlx4都足以诱导这些先前不相互作用的细胞之间的相互作用，导致总细胞毒性的显著增加。以类似的方式，hudp(图27b，中心)和hk细胞(图27c，中心)均显示高于背景水平的对pbmc的细胞毒性敏感性的显著增加。由于发明人先前已经显示aa中可能的致病性免疫细胞是cd8+nkg2d+活化的t细胞，本发明人还通过添加nkg2d阻断性抗体(参见实验程序)进行所有处理以防止nkg2d依赖性相互作用。在所有情况下，发明人都观察到阻断nkg2d抑制ikzf1和dlx4处理中的细胞毒性与对照水平相当(图27，中心，灰色条)。根据抑制剂处理和未处理的细胞之间的差异，本发明人可以推断nkg2d依赖性的细胞毒性(图27，中心，白色条)，其可以相对于对照中观察到的相对倍数变化分析标准化。从nkg2d阻断中，发明人观察到在所有试验中ikzf1和dlx4转染特异性显著增加(图27，右)。与对照转染相比，患者匹配的细胞毒性增加很大(>50倍)，其再次显示没有显著的细胞毒性。尽管nkg2d非依赖性细胞毒性具有统计学意义但非常小(<10％)的增加，但与对照相比，nkg2d依赖性细胞毒性增加约2至8倍。发明人从这些实验得出结论，ikzf1和dlx4能够与正常pbmc诱导nkg2d依赖性相互作用，导致转染细胞的毒性，而不管确切的组织类型如何。重要的是，这些实验建立了头皮皮肤中ikzf1和dlx4的细胞自主功能，而不是浸润细胞，因为外源修饰严格地在正常培养的细胞上进行，并且暴露于没有自身免疫病史的来源的健康pbmc。mr表达允许重建定向皮肤特异性浸润招募mr模块在确定ikzf1和dlx4足以诱导aags之后，发明人试图使用这些数据来完全重建aamr模块。aracne能够检测作为潜在目标(t)的tf和非调控基因之间的直接转录依赖性，因为发明人可以推断该调控是tf数学等式t.aracne不能推断tf-tf对之间的方向性相互作用，并且因此不能推断次级由于tf的调节等同性而导致mr的t(图28a，第一)。然而，由于本发明人直接扰动hk和hudps以特定的mr(图28a，星号)，发明人可以使用基因表达数据来推断方向性。如果tfb是mr(tfa)的t，则tfa的过表达将导致tfb的差异表达，并且发明人可以推断tfa数学方程式tfb。随后，与tfb相关的特征中的任何标志物基因可作为第二ttfa数学等式tfb数学等式t(图28a，顶部)与mr相关联。如果tfb在mr上游或与mr平行，则tfb和t的表达不会受到tfa过表达的影响(图28a，底部)。使用该逻辑，发明人重建了调控模块以测量在这些细胞背景中过表达ikzf1和dlx4所获得的覆盖范围的全部范围。本发明人绘制了tf的任何下游t，其(1)在实验中响应于ikzf1/dlx4表达，并且(2)预测与aracne表达的mr具有互相信息至调控模块。根据这些标准，发明人发现78％的响应aags与mr1kzf1和dlx4在下游分离2°内(图28b)。ikzf1和dlx4可用于预测独立队列中的免疫浸润和疾病严重程度作为该模块的验证，发明人返回到原始aa阵列群组并进行机器学习分析。本发明人试图仅使用推测的ikzf1和dlx4活性将验证aa集分为对照和受影响的样品。使用图24中较早的训练集，发明人将样品排列成两维的搜索空间：ikzf1的一致活性(x轴)和dlx4的一致活性(y轴)(参见实验程序)。从训练组中，发明人产生了一致活性空间的地形图，以定义与对照样品，斑块状aa和at/au样品(图28c，黑线)相关的izkf1和dlx4活性的范围。图28c中最接近图的原点的区域代表最低的组合ikzf1和dlx4活性；其上限(较低的黑线)是支持向量机(svm)余量，其使对照和所有aa患者之间的差异最大化。下一个上限(上部黑线)表示最大化at/au患者与aap分离的svm余量。使用这些mr活动的量度，发明人转向验证集并测试这些参数在分离患者和对照时的预测能力。除了临床严重程度之外，发明人观察到将样品分离成疾病和对照状态的强大能力(图28c，顶部，p<1×10-5)。每个患者亚组的质心图更清楚地显示患者组从对照(nc)到aap和at/au的转变如何通过相对ikzf1和dlx4活性(图28c，底部)反映出来。为了比较，本发明人还包括aap非病变样品活组织检查的质心，其未包括在训练组中。解卷积应用于独立炎性皮肤疾病鉴定已知基因为了比较，并为该方法的普遍性提供概念验证，发明人下载了公众可用的特应性皮炎(ad)和银屑病(ps)的基因表达数据集。类似于aa分析(图29a和31)，通过比较病变活检与未受影响的活检，发明人产生了每种疾病的基因表达标志。aa，ad和ps特征内的基因的直接比较揭示了aags不同于ad和ps的统计学显著证据(分别为p＝0.003和3.93×10-13)。相比之下，ad和ps特征相互比较揭示了一致分子特征的统计学显著证据，并且通过扩展可能共享分子病理学(p＝0.0173)。这两个标志被应用于管道。图29b报告了分析后鉴定的前五位mr，按它们对适当疾病标志(ps或ad)的总覆盖率排序。还提供了使用相应的解卷积igs的mr的排序。结果表明，与aa相关的关键调节中心(特别是ikzf1和dlx4)是aa独有的。每种疾病都有自己独特的mrs列表，但在ad和ps：smad2和hltf中还有两种候选mr重叠。smad2和tgfbr1是已发表证据表明参与ps的tf，并且该管道能够使用ps基因表达标志的基本定义在没有先验证据的情况下鉴定它们。这些结果表明建模复杂的遗传行为作为调节模块来区分病理机制的有效性。讨论利用全基因谱分析的基因调控网络和基因表达数据的系统生成和分析已被证明对复杂疾病的研究有帮助。最近，在糖尿病和动脉粥样硬化的全基因组表达标记去卷积和交叉组织相互作用中利用询问功能性相互作用的整合性项目。这些研究对于鉴定浸润性基因标记是非常有价值的，这些标记提供了与疾病相关的致病性免疫浸润类型的洞察。他们还帮助鉴定eqtls和其他基因组关联测试的驱动基因，类似于在癌症和阿尔茨海默氏病研究中开发的系统化算法，通过提供显著的调节活性的基因组水平覆盖以及相互作用组织的组织水平基因图。然而，特别是在诸如aa的情况下，在基因表达谱中表征离散致病分子行为的模块化调控以及它们如何转化为疾病组织之间的生理相互作用已经做了很少的工作。将生理特征建模为由mr控制的遗传程序，为复杂疾病的研究提供了独特而有力的观点。该方法将大量基因表达标志输送到相对少数选定的mr中，其随后变成通过基因疗法或药物和小分子操纵t。在此，发明人通过比较不同皮肤背景(浸润的和正常的)的调节网络，扩展了调节网络的应用以询问aa中终末器官(头皮皮肤)和浸润(免疫浸润)组织的混合样品的复杂分子状态。发明人确定，除了它们用于鉴定控制分子表型转换的关键调控中心的典型用途之外，这些网络可以用于基于它们是否在独立环境中准确地表示而分离和区分源自不同组织的分子行为特定的网络。这允许从混合样品中更精确地鉴定组织特异性分子程序，所述混合样品有助于整合，相互作用的生理行为，例如免疫浸润。通过使用这种管道，发明人能够不仅在aa的背景下重建调解皮肤浸润的mr，而且ps和ad的分析一般为炎性皮肤疾病的基因调节提供了另外的候选者，并且证明了一般该方法的适用性。除了aa病理学的直接影响之外，这项工作为两个关键的可概括概念提供了原理证明：(1)两个组织之间的复杂相互作用可以模拟为可量化的分子基因表达模块；(2)这些模块及其调节因子可以从表达数据中提取出来，划分为组织，并选择诱导正常细胞类型的相关相互作用。这通过mrsikzf1和dlx4异位表达后概括aags的能力以及随后仅使用正常(非aa)pbmc在非aa细胞系中诱导增强的细胞毒性通过末端内ikzf1和dlx4表达的操纵器官本身(没有对pbmc的基因操作)。具体而言，该分析鉴定了仅在头皮皮肤中表达时足以诱导与免疫细胞相互作用的mr。即使在患者匹配的情况下，来自健康，不影响aa的患者的样品，ikzf1和dlx4表达足以诱导真皮成纤维细胞和pbmc之间异常的nkg2d依赖性相互作用，导致细胞毒性。这些相互作用不存在于对照转染中，并且它们在另外两种(非患者匹配)细胞类型中重复，表明ikzf1或dlx4的表达足以诱导与正常免疫细胞的相互作用，而不管特定组织或宿主匹配。如果没有基于网络的解卷积，ikzf1和dlx4的鉴定是不可能的，因为在原始aags中显著存在浸润标志会阻止任何准确鉴定候选mr。相反，基于网络的解卷积鉴定了能够在完全独立于aa本身的任何几种分子环境中诱导特定分子相互作用的mr。ikzf1的鉴定是出乎意料的，因为ikzf1在t细胞分化的背景下被广泛研究。然而，它的鉴定仅仅来自使用解卷的aa标志，而不是使用来自皮肤的调节逻辑的igs。如果发明人依靠公共数据库，以前的文献或go注释来过滤基因表达数据，则由于作为t细胞分化因子的广泛注释，发明人完全忽略并移除了ikzf1。相反，通过转向调节网络，发明人能够确定ikzf1的局部表达可以具有独立于其在免疫细胞中直接确立的作用的致病相关性的可能性。尽管ikzf1在免疫细胞的情况下具有很好的特征，但免疫细胞外ikzf1的作用在文献中并非没有先例。ikzf1和dlx4基因座的丢失也与结直肠癌，肺癌和乳腺癌的癌发生以及低度鳞状上皮内病变相关。这些研究直接从肿瘤组织获得它们的基因组信息，表明这两个基因座的体细胞丢失可能导致癌症病理生理学作为终端器官基因组改变。对ikzf1和dlx4作为诱导免疫浸润的mrs的研究支持了这些结果，并增加了这些基因座的丢失可能有助于癌症中的免疫逃避的可能性。此外，这些观察结果以及将ikzf1和dlx4鉴定为免疫渗入募集的mr提供了支持，认为ikzf1在其作为t细胞特异性分化因子的作用之外存在功能，并且支持aa中自身免疫的假设并且肿瘤免疫逃避存在于正常免疫相互作用的相反极端。免疫浸润的mr损失与癌症相关，并且它们的过度表达与aa中自身免疫性疾病的发作相关。发明人已经表明，可以使用系统生物学和网络分析来模拟介导两种不同组织之间的相互作用的分子机制，鉴定关键的调节因子，并使用它们在其他情况下重新创造交互性特征。虽然用于验证这些mr的输出最终是诱导细胞死亡，但是这些mr在自身免疫疾病背景下的功能是诱导最终发信号并募集免疫浸润物的分子概况。到目前为止，系统生物学的应用主要是鉴定癌细胞自主分子行为中的“断点”。跨组织相互作用的受控诱导，特别是涉及免疫系统的相互作用，引入了用以前不可行的调节网络模拟复杂遗传性状的潜在重要途径。本发明人提供了概念验证框架，其可以用于主动划分用于研究的分子行为，即使在涉及不同组织之间的相互作用的复杂疾病中也是如此。实验步骤本节包含本研究中实施的不常见或独特方法的描述。aracne为了产生用于头皮皮肤的上下文特异性转录相互作用网络，本发明人在128个微阵列实验上采用aracne算法，与本研究中的分析群组无关。这些实验代表在来自正常全皮肤活检组织，aa患者活检组织，显微切割的真皮乳头和分离的真皮和表皮样品的混合物的整个皮肤样品上采集的平台匹配(affymetrixu1332plus)数据。这些样品共同提供了精确检测头皮皮肤中转录依赖性所需的异质性。如上所述合并实验并进行后处理，并进行标准aracne分析。aracne软件套件可从califano实验室网站http://wiki.c2b2.columbia.edu/califanolab/index.php/software获得。mr分析特定基因表达标志的mr定义为其直接aracne预测的t(调节子)在基因表达标志中统计学上富集的tf。使用fisher's精确检验对每个tf的调节子进行富集aags的检测，fdr＝0.05。该分析允许排序和确定特定覆盖与生理性状相关的基因表达模块所需的最小数量的tf。http://wiki.c2b2.columbia.edu/califanolab/index.php/software/marinamr活动分类器将ikzf1和dlx4的aracne预测的t与外源基因表达研究整合以鉴定aags中可映射为ikzf1和dlx4的t的所有基因。这是通过将ikzf1和dlx4的aracne调节子与aags相交而完成的。然后在表达研究中筛选这两组的交集，所述基因的反应至少有25％的变化。这组基因用于构建ikzf1和dlx4基因座的共同“元活性”。整个aa患者群体中每个基因的排序标准化变化被整合到平均值中作为母亲mr相对活性的一致性度量。这些值随后用于定义二维搜索空间，数学公式，其中x＝ikzf1元活动和y＝dlx4元活动，对aa训练集中的每个患者进行分类。元活动向量进行排序转换，使得最小值绑定到搜索空间的起点(0,0)，并且活动度量为正值。除了将搜索空间投影到更直观的网格中以用于显示目的，其中两个轴被绑定在[0，n]之间，其中n是正值之外，该转换对结果没有影响。这个空间中的分类是使用修改的非线性软边缘svm算法完成的。该算法是形式化为：x＝ranksort(activityikzf1)y＝ranksort(activitydlx4)该算法定义了存在于搜索空间matheq内的矢量集matheq，使得每个给定对的matheq最大化似然比matheq。该函数被定义为使得数学eq是数学eq和数学eq的下一个疾病严重程度，并且数学eq是由超平面数学eq和数学eq所创建的网格的象限i和iii。将训练集中的样品映射到具有已知分子亚型的每个网格，并计算由数学等式定义的亚型分离的似然比。用于数学公式的严重程度排序是正常<轻度<重度。matheq中的每个坐标集因此定义了一个非线性平面的点，该平面可以最大化ikzf1/dlx4元活动空间中不同分子类别样品之间的分离。细胞毒性分析使用可通过promega获得的cytotox96nonradioactivecytotoxicityassay测量pbmc依赖性细胞毒性。为了处理样品和溶液，本发明人遵循制造商方案。pbmc的优化：t按照如下进行，但使用可变浓度(1：1,5：1和10：1)(图32)。细胞毒性实验以96孔格式建立，每个处理重复三次。实验前36小时进行转染。实验当天，将hk和hudp细胞用胰蛋白酶消化并用达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)稀释成工作原液。每孔的t浓度为50μldmem中的80,000个细胞，与800,000个pbmc组合。nkg2d抑制剂是来自r&dsystems(cat.mab139)的人nkg2dmab(克隆149810)，其以20μg/ml的终浓度使用。根据制造商的说明，每个转染分三次进行。基因表达研究在由28名aap患者，32名at/au患者和36名未受影响的对照组成的affymetrixu1332plus阵列上对来自96位患者的总共122个样品进行概况分析。其余26个样品对应于来自aap队列的患者匹配的非病变活检组织。这些非病变性样品不包括在初始标志的推断中，但稍后(以下)使用。将这些患者活组织检查的rna在affymetrixu1332plus阵列上分离并处理。数据后处理通过r使用mas5标准化，使用可通过bioconductor获得的标准包进行。这些数据可在gse68801的geneexpressionomnibus中找到。该数据集被分成两组进行训练和验证。通过比较(1)aa与未受影响的和(2)训练集中的病变vs非病变的两种差异表达分析来鉴定基因标志物的初始小组。在p<0.05和倍数变化>25％时设定差异表达的阈值。由于网络分析基于一致性，因此实施了相对宽松的门槛。分析并不主要关注候选人队伍，而是依靠足够的分子信息来推断tf活动。这种方法对于可能通过更宽松的阈值引入的噪声也必然更加鲁棒，因为噪声的添加将被应用于整个数据集并且通过aracne和主控制器分析(参见下文)被标准化为一致性。所有的x和y连锁基因被删除，以消除差异表达基因的排序和聚集中可能存在的性别偏差。基因集富集分析gsea是一种用于测量定义的一组基因的差异表达中的非参数统计学富集的方法。实验组和对照组之间进行默认的差异表达分析，并且基因通过差异表达进行排序，没有阈值(包括所有基因)。这可以根据任何用户指定的标准(折叠变化，p值等)完成。然后通过混洗样品标记，即通过随机化病例和对照样品并重复分析，将该富集得分与凭经验生成的无效分布进行比较。这重复1000次以上迭代以生成富集得分的空分布，观察得分可与之比较以生成p值。克隆下面提供的每个引物对用于accuprimetaqpcr混合物的pcr反应，根据制造商的方案对源自hek293t细胞的cdna进行pcr反应。使用来自invitrogen的superscriptfirst-strandsynthesissystem从培养的细胞产生cdna。pcr产物通过凝胶电泳耗尽，并且使用qiagen凝胶提取试剂盒分开切出存在的任何同种型。mrna保真度通过来自genewiz的测序验证，并且用来自newenglandbiosystems的smartcut缓冲液中的适当酶(spei和asci)消化正确的序列2小时。平行消化ploc-rfp载体，并通过凝胶提取切割切下的骨架。在骨架和插入物纯化后，根据制造商方案使用来自roche的rapidligationkit将每个插入物连接到切割的ploc载体中，并转化到dh5α细胞中用于扩增。通过菌落pcr和测序(genewiz)对序列保真度验证了成功的转化。通过maxiprep(qiagen)扩增并纯化正确的构建体用于实验。以下以5'至3'格式提供了用于克隆用于插入到ploc载体中的基因的引物：间隔酶-mrna序列。ikzf1.1正向ggc-actagt-atggatgctgatgagggtcaa反向att-ggcgcgcc-ttagctcatgtggaagcggtikzf1.2正向ggc-actagt-atggatgctgatgagggtcaag反向att-ggcgcgcc-ttagctcatgtggaagcggt(与1.1相同)dlx4正向ggc-actagt-atgaaactgtccgtcctacccc反向att-ggcgcgcc-tcattcacacgctggggctgg细胞培养和转染hudp和hk细胞都保持在标准生长条件：37℃和5％co2的dmem10％fbs。hudp细胞是从人皮肤样品中显微解剖培养的原代人真皮乳头。对于这项工作的实验，只使用了通道数小于6的hudp和hk细胞。根据制造商方案使用jetprime转染试剂用ploc表达构建体转化细胞。使用2：1浓度的试剂(ul)转染dna(ug)使转染过夜。mr抢救微阵列ikzf1和dlx4向hk和hudp细胞的转染如上所述在10cm平板中培养的细胞中进行。转染后36小时，将这些细胞收获于具有刮落细胞的pbs中，然后裂解并使用来自qiagen的rneasy试剂盒遵循制造商方案处理纯化的rna。使用分光计进行rna质量控制，并且由哥伦比亚设施(病理学部门)提交在affymetrix人类u1332plus阵列上进行处理。阵列数据再次标准化并使用mas5通过bioconductor包进行标准化处理。qpcrs定量pcr反应是从独立的8个原发病灶活检组织中提取的cdna(发现一个被降解并被排除在研究外)，4个未受影响的对照，以及5对病人匹配的病变和非病变样品进行。使用sybrgreen的反应混合物根据制造商方案制成25ul体积，并在来自appliedbiosystems的7300系列实时pcr仪器上分析。本节最后提供了每个基因的引物。所有样品均以技术一式三份的方式进行测试(每个重复在一个平板上进行，所有样品和对照一次制备，重复三次)。通过δδct方法分析来自这些重复的数据，将所有实验序列标准化为对照组织的平均标准化值。使用标准的统计误差传播，跨越比较导出sem。下文提供了通过qpcr测定转录物的引物，5'至3'。使用dlx4全长扩增的引物，因为转录物为(所提供的方案的最佳转录物长度为200-300bp)。ikzf1正向actccgttggtaaacctcac反向ctgatcctatcttgcacaggtcdlx4＊与克隆引物相同＊actb正向gaaggattcctatgtgggcgac反向gggtcatcttctcgcggttg分离新鲜的外周血单核细胞在预期的细胞毒性测定之前的晚上从全血绘制分离新鲜的pbmc。使用histopaque-1077试剂(ficoll)，通过用无菌pbs1:1稀释8ml等份的全血，并将该溶液以2：1的最终体积比层积在ficoll上，从全血中分离pbmc。该溶液在1200rpm下离心45分钟。分离携带单核细胞的界面层，在5倍体积的无菌pbs中稀释并以1500rpm再次离心15分钟。丢弃上清液，并将沉淀重悬于3ml10％fbsdmem中。用血细胞计数器进行细胞计数，用dmem10％fbs将溶液稀释至1×106细胞/ml的终浓度。将其在37℃和5％co2下储存过夜，以用于次日早上的实验。＊＊＊＊＊除了所描绘和要求保护的各种实施例之外，所公开的主题还针对具有本文公开和要求保护的特征的其他组合的其他实施例。如此，本文呈现的特定特征可以以所公开的主题的范围内的其他方式彼此组合，使得所公开的主题包括本文公开的特征的任何合适的组合。已经出于说明和描述的目的呈现了所公开的主题的具体实施例的前述描述。并非旨在穷举或将所公开的主题限制于所公开的那些实施例。本文引用了各种出版物，专利和专利申请以及方案，其内容通过引用整体并入本文。当前第1页12