颗粒的蛋白质固定方法与流程

本发明涉及一种将蛋白质固定在颗粒上的方法，更具体地涉及一种将抗体固定在磁性颗粒上的方法。

背景技术：

用于免疫色谱分析的固定有蛋白质的颗粒在医疗保健领域中用于鉴定疾病或检测疾病的变化，并且在包括食品和生物处理领域、环境领域等在内的各领域中还用于简单地分析少量分析物。具体而言，在医疗保健领域，其应用范围扩大到怀孕、排卵、传染病、药物滥用、急性心肌梗塞、癌症等。例如，上述颗粒可用于分离血液中的疾病标志物。

在这些颗粒中，由于易于控制、高生物相容性和高灵敏度等优点，磁性颗粒作为用于结合化验的标记材料备受关注。例如，韩国专利申请2014-0106268公开了一种使用磁性颗粒检测生物分子的方法。

同时，将蛋白质固定在颗粒上的方法以颗粒表面被改性以使羧基(-COOH)固定在颗粒表面上，随后通过与蛋白质的氨基(-NH₂)酰胺键合的方式进行固定。作为上述方法的代表性实例，已知一种使用可从Thermo公司获得的Magnabind将蛋白质固定在颗粒上的方法，以及一种使用可从生命技术公司(Life Technology)获得的Dynabeads Myone^TM将蛋白质固定在颗粒上的方法。然而，Thermo和Life Technology的蛋白质固定方法的问题在于由于非特异性结合而可能形成蛋白质-蛋白质聚集体或蛋白质-颗粒聚集体，并且Life Technology的方法具有处理时间长的缺点。因此，仍然需要一种能够克服这些缺点的将蛋白质固定在颗粒上的方法。

技术实现要素：

技术问题

因此，本发明旨在提供一种将蛋白质固定在颗粒上的方法，其中，可以固定相对少量的蛋白质，同时解决现有技术中遇到的问题，例如处理时间长和由蛋白质之间以及蛋白质和颗粒之间的非特异性结合所导致的聚集。

技术方案

因此，本发明提供了一种将蛋白质固定在颗粒上的方法，包括：对颗粒表面进行改性以使羧基(-COOH)固定在颗粒表面上；对经改性的颗粒进行蛋白质添加，然后超声处理；和在超声处理后通过添加用于促进固定在颗粒表面上的羧基与蛋白质的氨基(-NH₂)之间的酰胺键合的催化剂，将蛋白质固定在颗粒表面上，其中，在将蛋白质固定在颗粒表面上的过程中，进行超声处理，从而防止蛋白质之间或蛋白质与磁性颗粒之间的非特异性吸附。

在本发明的另一实施方式中，在对颗粒表面进行改性之后并且在对经改性的颗粒进行蛋白质添加，然后超声处理之前，可以对经改性的颗粒进行超声处理。

在本发明的又一实施方式中，在将蛋白质固定在颗粒表面上的过程中，可以将表面活性剂与用于促进酰胺键合的所述催化剂一起加入。

在本发明的又一实施方式中，所述颗粒可以是磁性颗粒。

在本发明的又一实施方式中，所述颗粒可以具有范围为100nm～3μm的尺寸。

在本发明进一步的实施方式中，所述蛋白质可以是抗体，并且所述抗体可以通过固定在颗粒表面上的羧基与抗体重链恒定区的氨基(-NH₂)之间的酰胺键合固定在所述颗粒上。

在本发明又进一步的实施方式中，用于促进酰胺键合的所述催化剂可以是选自由EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、CDI(N,N'-羰基二咪唑)和DOC(二环己基碳二亚胺)组成的组中的至少一种。

有益效果

根据本发明，将蛋白质固定在颗粒上的方法可以防止由蛋白质之间以及蛋白质和颗粒之间的非特异性结合而导致的聚集，从而可以将相对少量的蛋白质固定在颗粒上。

附图说明

图1示意性地示出了将抗体固定在颗粒上的典型过程；

图2示出了在血样中添加6mg比较例1的固定有蛋白质的颗粒时使用相差显微镜观察的结果；

图3示出了在血样中添加4mg比较例1的固定有蛋白质的颗粒时使用相差显微镜观察的结果；

图4示出了在血样中添加6mg比较例1的固定有蛋白质的颗粒后使用磁铁分离红细胞的结果；

图5示出了在血样中添加4mg比较例1的固定有蛋白质的颗粒后使用磁铁分离红细胞的结果；

图6示出了在血样中添加1mg实施例1的固定有蛋白质的颗粒时使用相差显微镜观察的结果；和

图7示出了在血样中添加1mg实施例1的固定有蛋白质的颗粒后的照片(左)和使用磁铁分离红细胞的结果(右)。

具体实施方式

本发明涉及一种将蛋白质固定在颗粒上的方法，更具体地涉及一种将抗体固定在磁性颗粒上的方法。本发明的方法使用超声处理和表面活性剂可以防止由蛋白质之间以及蛋白质和颗粒之间的非特异性结合所导致的聚集，从而可以将相对少量的蛋白质固定在颗粒上。

在下文中，将详细描述本发明。

本发明涉及一种将蛋白质固定在颗粒上的方法，包括以下步骤：对颗粒表面进行改性以使羧基(-COOH)固定在颗粒表面上；对经改性的颗粒进行超声处理，蛋白质添加，然后超声处理；和在超声处理后通过添加用于促进固定在颗粒表面上的羧基与蛋白质的氨基(-NH₂)之间的酰胺键合的催化剂，将蛋白质固定在颗粒表面上，其中，在将蛋白质固定在颗粒表面上的过程中，进行超声处理，从而防止蛋白质之间或蛋白质与磁性颗粒之间的非特异性吸附。

超声处理用于防止蛋白质之间以及蛋白质和颗粒之间的非特异性吸附，并且还用于均匀地将蛋白质固定在颗粒上。超声处理在对颗粒表面进行改性的步骤之后、在蛋白质添加步骤之后，以及在通过添加催化剂将蛋白质固定在颗粒表面上的步骤期间进行，超声处理的次数在各步骤中没有特别的限制。例如，在通过添加催化剂将蛋白质固定在颗粒表面上的步骤期间，可以以5分钟为间隔进行7次超声处理。

在将蛋白质固定在颗粒表面上的步骤中，可以将表面活性剂(去污剂)与用于促进酰胺键合的催化剂一起加入。表面活性剂在防止蛋白质的静电结合以及蛋白质与磁性颗粒之间的非特异性结合中起作用。表面活性剂没有特别限制，只要能够防止非特异性结合即可，并且可以使用选自由阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂和非离子表面活性剂组成的组中的至少一种。例如，T-20或SDS可以用作表面活性剂。表面活性剂也可以在对颗粒表面进行改性的步骤中使用，使得羧基(-COOH)固定在颗粒表面上。

颗粒可以是磁性颗粒。本发明的磁性颗粒没有特别限制，只要它们根据常规技术可以应用于磁泳即可，并且优选包括Fe₂O₃或Fe₃O₄的磁性颗粒。颗粒的尺寸优选为100nm～3μm，更优选为100nm～400nm。

蛋白质可以是抗体。如本文所用，术语“抗体”，如本领域已知的，是指能够通过特异性反应与特定抗原或其表位结合的特定蛋白质分子，并且可以包括对抗原具有结合能力的免疫球蛋白分子(例如，单克隆抗体、多克隆抗体等)，免疫球蛋白分子的片段(例如，Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG、单链Fv片段(scFv)等)等。具体而言，免疫球蛋白分子具有重链和轻链，并且重链和轻链各自包括恒定区和可变区(所述区也称为“结构域”)，并且轻链和重链的可变区包括能够与抗原表位结合的三个可变互补决定区(CDR)和四个“骨架区(FR)”。每条链的CDR从N端开始依次分别通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，并且由具体的CDR所处的链来识别。

从抗体的形态学方面来看，抗体优选包括对抗原特异的天然抗体，例如IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgT、IgY、单链抗体等；配置成包括部分天然抗体的重组抗体；为了降低抗体对抗原的解离常数、减少体内对抗体的排斥反应或提高抗体稳定性而使天然抗体的一部分突变的突变型抗体，更优选包括天然抗体(诸如：IgG)、突变以降低抗体对抗原的解离常数的突变型抗体、包括直接与抗原结合的CDR(互补决定区)的重组抗体，或它们的片段。

将抗体固定在颗粒上可以通过固定在颗粒表面上的羧基和抗体重链恒定区(例如赖氨酸)的氨基(-NH₂)之间的酰胺键合来实现。

在将蛋白质固定在颗粒上的方法中，对颗粒表面进行改性以将羧基固定在颗粒表面上，并进行该过程以通过与具有氨基的抗体的酰胺键合来实现固定。颗粒的表面改性可以通过本领域已知的方法进行。例如，可以仅将柠檬酸钠施用于颗粒表面上，或者可以用二氧化硅涂覆颗粒，然后用APTES(氨基丙基三乙氧基硅烷)处理，以便用戊二酸酐处理末端氨基，由此固定羧基。颗粒的表面改性必须在不超过40℃的温度下进行，并且优选在室温下进行，以防止蛋白质变性。此外，反应时间设定为30分钟，可以以5分钟为间隔施加超声波数秒。

在超声处理之后添加用于促进酰胺键合的催化剂，并且催化剂用于促进固定在颗粒表面上的羧基与蛋白质的氨基(-NH₂)之间的酰胺键合。因此，催化剂可以没有特别限制地使用，只要其起到促进酰胺键合的作用即可。催化剂优选为选自由EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、CDI(N,N'-羰基二咪唑)和DOC(二环己基碳二亚胺)组成的组中的至少一种。

用于促进酰胺键合的催化剂可以以适当的量加入，然后在室温下混合5至60分钟以将蛋白质固定在颗粒表面上，并且可以如上所述进行超声处理，由此防止蛋白质之间或蛋白质与磁性颗粒之间的非特异性吸附。

通过上述方法制备的固定有蛋白质的颗粒可以用于食品和生物处理、环境、医疗保健等领域。具体而言，磁性颗粒具有吸磁性，因此沿着施加外部磁场的方向移动。当抗体被固定在磁性颗粒上时，在移动到所期望的位置之后进行反应变得可能，由此在医疗保健领域中可以快速检测生物分子。

通过以下实施例将更好地理解本发明，这些实施例仅仅是为了说明而提出的，不应解释为限制本发明，并且可以进行多种改变和更改。

实施例1：制备固定有蛋白质的颗粒

用1～5ml PBS(钾缓冲盐水)洗涤1ml 20mg/ml的磁性颗粒(AMO-Mag，购自AMOGREENTECH)三次。之后，向其中添加225μl的PBS和225μl的混合溶液(pH4.7，0.1M MES+0.9％NaCl+0.02％T-20；添加表面活性剂T-20以防止由蛋白质的静电结合以及蛋白质与磁性颗粒之间的非特异性结合导致的聚集)，然后充分进行超声处理，并向其中添加1mg或2mg的IgG(免疫球蛋白G)，即抗RBC(红细胞)抗体(Fitzgerald生产)，之后再次进行超声处理。

接下来，向其中添加50μl溶于混合溶液(pH 4.7，0.1M MES+0.9％NaCl+0.02％T-20)中的10mg/ml EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，然后在室温下混合30分钟(在初次超声处理后以5分钟为间隔进行超声处理)。随后，用1ml PBS洗涤三次并最终贮存在PBST(PBS+0.1％T-20)中，由此制备固定有蛋白质的颗粒。

比较例1：制备固定有蛋白质的颗粒(Thermo制备方法)

用1ml PBS洗涤1ml 20mg/ml的磁性颗粒(Magnabind，购自Thermo)三次。接下来，将5～10mg的IgG和pH4.7的含0.1M MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)和0.9％NaCl的反应溶液添加到20mg经洗涤的磁性颗粒中，并且向其中添加100μl 10mg/ml的EDC，随后在室温下混合30分钟。之后，用1ml PBS洗涤3次，得到固定有蛋白质的颗粒。

比较例2：制备固定有蛋白质的颗粒(Life Technology制备方法)

将100μl 10mg/ml磁性颗粒(Dynabeads Myone，购自Life Technology)添加到pH 6.0的15mM MES中，然后向其中添加10μl 10mg/ml的EDC，随后在室温下混合30分钟。之后，进行磁性收集，然后除去上清液，并加入200～500μl pH6.0的15mM MES和0.4mg IgG，然后在室温下混合过夜。之后，用1ml PBST(PBS+0.1％T-20)洗涤3次，最后贮存在PBSTB(PBS+0.1％T-20+0.1％BSA)中，由此制备固定有蛋白质的颗粒。

测试例1：使用固定有蛋白质的颗粒分离红细胞的测试

将实施例1(1mg固定有蛋白质的颗粒)和比较例1(4mg或6mg固定有蛋白质的颗粒)的固定有蛋白质的颗粒(50μl)添加到50μl血样中，然后在室温下反应约5分钟。结果示于图2至图7中。

图2示出了在血样中添加6mg比较例1的固定有蛋白质的颗粒时使用相差显微镜观察的结果。

图3示出了在血样中添加4mg比较例1的固定有蛋白质的颗粒时使用相差显微镜观察的结果。

图4示出了在血样中添加6mg比较例1的固定有蛋白质的颗粒后使用磁铁分离红细胞的结果。

图5示出了在血样中添加4mg比较例1的固定有蛋白质的颗粒后使用磁铁分离红细胞的结果。

图6示出了在血样中添加1mg实施例1的固定有蛋白质的颗粒时使用相差显微镜观察的结果。

图7示出了在血样中添加1mg实施例1的固定有蛋白质的颗粒后的照片(左)和使用磁铁分离红细胞的结果(右)。

如图2～图7所示，比较例1的固定有蛋白质的颗粒聚集成呈黑色的大团，当添加6mg固定有蛋白质的颗粒时，通过磁性颗粒红细胞被分离。但是，实施例1的固定有蛋白质的颗粒几乎不发生聚集，即使添加小于上述6mg的1mg固定有蛋白质的颗粒，全部红细胞都被分离。具体而言，如图7所示，与比较例1相比，实施例1管壁的颜色干净，由此证实颗粒与血液中的目标物质进行了反应而没有非特异性吸附。