成像质谱分析数据处理装置及方法与流程

本发明涉及用于处理针对试样上的二维区域内的多个测定点分别进行质谱分析所得到的数据的成像质谱分析数据处理装置及方法。

背景技术：

在利用质谱分析来鉴定未知化合物时，通常进行利用存储有多个已知化合物的质谱的库(数据库)的库检索。例如专利文献1中公开了如下的方法：将通过进行msⁿ分析(n为2以上的整数)而得到的未知化合物的msⁿ谱与库中收录的多个已知化合物的msⁿ谱进行对照，从而分别求出表示质谱的相似性的分数，基于该分数来鉴定未知化合物。

另外，由于化学结构的一部分共有的不同化合物的ms²谱相似，因此有时在实施了库检索时这多个化合物作为鉴定候选而被举出。这种情况下，作为排除相似化合物的影响而以高准确度鉴定目标化合物的方法，有专利文献2所述的方法。该方法中，能对库中收录的质谱上的每个峰附加表示是否用于库检索的信息，因此，通过事先设定为库检索中不使用多个相似化合物中共有的例如与主要骨架对应的峰，从而能够算出反映了源自除主要骨架以外的结构的峰的相似性的分数。由此，能够提高目标化合物的鉴定精度。

通常，在作为分析对象的试样中仅存在作为鉴定对象的未知化合物的情况极少，包含未知化合物的试样也包含其它化合物。于是，在通过库检索鉴定未知化合物的情况下，将包含未知化合物的试样导入到液相色谱仪(lc)、气相色谱仪(gc)、或电泳装置(ce)，使作为目标的未知化合物与其它化合物分离，然后导入到质谱分析装置。不限于利用lc等使未知化合物与其它化合物完全分离，但在大多情况下，未知化合物与其它化合物的重叠被消除，由此能够大幅改善未知化合物的鉴定精度。

近年来，作为利用质谱分析研究具有二维扩展的试样上的物质分布的方法，质谱分析成像受到关注。质谱分析成像是以下方法：对于生物体组织切片等试样的二维区域内的多个测定点(微小区域)分别实施质谱分析，根据由此得到的分析结果，将例如具有特定质荷比的化合物的二维分布可视化，该方法正不断应用于药物发现、生物标记物搜索、各种疾病/疾患的原因探明等。用于实施质谱分析成像的质谱分析装置通常被称为成像质谱分析装置(参考非专利文献1等)。

通常，在质谱分析成像中，大多情况下，在作为生物体组织切片的试样的表面直接涂布基质辅助激光解吸离子化(maldi)用的基质，直接进行基于maldi离子源的离子化。在该情况下，与上述利用lc、gc、ce等事先将化合物分离的情况不同，试样中包含的多个化合物没有被分离，而是在混合的状态下被离子化，因此在质谱中出现源自所述多个化合物的峰。另外，虽然组成不同但质量非常接近的多个化合物、组成相同而仅结构不同的异构体等被观测为在质谱上重叠的峰、即好像是一个化合物。

另外，质谱上的峰的质荷比m/z值相当于对特定化合物加合质子(h)等离子而成的状态的离子的质荷比。当对生物体试样进行质谱分析时，经常在质谱上出现如下的离子：替代质子而生物体中大量含有的钠(na)离子、钾(k)离子加合于化合物所得到的离子，或加合由它们组合所得到的-h+2k、-h+2na(其中，-h意味着质子脱落，+2na或+2k意味着加合2个na离子或k离子)等所得到的离子。另外，根据使用的基质的种类，也有时在质谱上出现对测定对象的化合物加合基质和质子等而成的离子。另外，也有时出现对基质分子的多聚体和/或由其脱落中性分子而成的物质加合h、k、na等离子而成的离子。

因此，当选择作为鉴定对象的特定质荷比下的峰作为前体离子并获取ms/ms谱时，由于该前体离子中包含源自多个化合物的离子，因此在ms/ms谱中出现源自多个化合物的产物离子的峰。因此，即使进行上述那样的以往的库检索，也有时无法进行准确的鉴定。具体而言，混合在前体离子中的多个化合物会以低的分数出现在检索结果中。

另外，也有时在前体离子中包含库中未收录的化合物，这种情况下，若源自库中未收录的化合物的产物离子的峰的强度大，则有时在库检索结果中连库中收录的化合物都不会作为鉴定候选被举出。

作为一例，在前体离子中同时包含源自作为基质的dhb的多聚体的离子和源自还原型谷胱甘肽的离子的情况下，将通过实测得到的ms/ms谱示于图9的(a)。另外，为了与实测的ms/ms谱进行比较，将dhb的多聚体的标准ms/ms谱和还原型谷胱甘肽的标准ms/ms谱示于图9的(b)、图9的(c)。这些标准ms/ms谱是在库中收录的谱。由图9可知，在实测的ms/ms谱中，包含源自dhb的多聚体的产物离子峰和源自还原型谷胱甘肽的产物离子峰这两者。

对于图9的(a)所示的实测的ms/ms谱进行了库检索，结果上述两个化合物作为鉴定候选而被举出。然而，关于它们的相似度的分数，dhb的多聚体只有“37”，还原型谷胱甘肽只有“34”，是与完全一致时的分数“100”相比非常低的值。这种程度的相似度很难说是以充分高的可靠度进行了鉴定，是难以断定包含该化合物的水平。

专利文献1：国际公开第2014/128912号

专利文献2：国际公开第2016/002047号

非专利文献1：“imscopetrio成像质量显微镜”、[online]、株式会社岛津制作所、[2016年6月22日检索]、网址<url:http://www.an.shimadzu.co.jp/bio/imscope/index.htm>

技术实现要素：

发明要解决的问题

本发明是鉴于上述问题而做出的，其主要目的在于，提供在通过将由成像质谱分析装置得到的数据供于库检索来鉴定试样中存在的化合物的情况下能够以高精度进行鉴定的成像质谱分析数据处理装置及方法。

用于解决问题的方案

为了解决上述问题而做出的本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置，用于处理通过对试样上的规定的测定对象区域内的多个测定点分别进行msⁿ分析(其中，n为2以上的整数)所得到的msⁿ谱数据，所述成像质谱分析数据处理装置具备：

a)图像制作部，其基于所述msⁿ谱数据，针对所述测定对象区域或该区域中的一部分区域制作表示特定质荷比下的信号强度分布的质谱分析成像图像；

b)关注区域设定部，其在所述质谱分析成像图像上或与测定对象区域对应的光学图像上将多个小区域分别设定为关注区域；

c)msⁿ谱获取部，其基于多个所述关注区域中包含的测定点处的msⁿ谱数据，获取在多个所述关注区域之间将多个所述关注区域各自的平均的msⁿ谱或代表性msⁿ谱进行相加或相减所得到的已运算msⁿ谱；以及

d)化合物鉴定部，其利用所述已运算msⁿ谱来鉴定在多个所述关注区域中存在的化合物。

另外，为了解决上述问题而做出的本发明所涉及的成像质谱分析数据处理方法为利用上述本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置实现的方法，用于处理通过对试样上的规定的测定对象区域内的多个测定点分别进行msⁿ分析(其中，n为2以上的整数)所得到的msⁿ谱数据，所述成像质谱分析数据处理方法具备：

a)图像制作步骤，基于所述msⁿ谱数据，针对所述测定对象区域或该区域中的一部分区域制作表示特定质荷比下的信号强度分布的质谱分析成像图像；

b)关注区域设定步骤，在所述质谱分析成像图像上或与测定对象区域对应的光学图像上将多个小区域分别设定为关注区域；

c)msⁿ谱获取步骤，基于多个所述关注区域中包含的测定点处的msⁿ谱数据，获取在多个所述关注区域之间将多个所述关注区域中的msⁿ谱进行相加或相减所得到的已运算msⁿ谱；以及

d)化合物鉴定步骤，利用所述已运算msⁿ谱来鉴定在多个所述关注区域中存在的化合物。

在用于实施上述本发明所涉及的成像质谱分析数据处理方法的本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置中，图像制作部当被用户指定例如推测为与作为鉴定对象的目标化合物相关的特定质荷比时，基于所采集到的msⁿ谱数据，针对测定对象区域或该区域中的一部区域制作表示该特定质荷比下的产物离子的信号强度分布的质谱分析成像图像。在该质谱分析成像图像上信号强度大的部分被推测为目标化合物的存在量多的部分。于是，关注区域设定部例如将在质谱分析成像图像上信号强度相对较大的小区域设定为关注区域。该关注区域设定部对关注区域的设定既可以基于质谱分析成像图像、由对试样光学性地进行观测的光学显微镜得到的光学图像来自动地进行，或者，也可以根据通过目视确认了质谱分析成像图像、光学图像的用户基于其判断手动地指示来进行。另外，该关注区域的大小和个数是任意的。

当设定多个关注区域时，msⁿ谱获取部使用在所述多个关注区域中分别包含的测定点处的msⁿ谱数据，例如对每个关注区域求出平均msⁿ谱，将多个关注区域中的平均msⁿ谱相加，从而获取已运算msⁿ谱。也可以使用各关注区域中代表性msⁿ谱来代替平均msⁿ谱。作为代表性msⁿ谱，例如也可以选择在关注区域中上述特定质荷比下的产物离子的信号强度最大的测定点的msⁿ谱，或者通过主成分分析、分层聚类分析等统计分析方法来选择针对关注区域的标准msⁿ谱。

此外，通过主成分分析求出的msⁿ谱例如为后述的因子载荷谱等。后述的处理中，对于测定对象区域内的所有测定点进行了主成分分析，但是，仅对于关注区域内包含的测定点进行主成分分析，将由此得到的针对第1主成分(或其它主成分)的因子载荷谱作为代表性msⁿ谱即可。

当例如如上所述那样目标化合物的存在量多的部分被设定为多个关注区域时，上述已运算msⁿ谱中，源自目标化合物的产物离子的峰的强度值与源自其它化合物的产物离子的峰的强度值相比相对较大的可能性高。因此，当将已运算msⁿ谱供于例如库检索并求出表示谱的相似性的分数时，针对正确的化合物的分数变高。由此，能够正确地鉴定在关注区域中存在的未知化合物的可能性提高。

另外，例如在存在像maldi用基质那样几乎遍布试样上的测定对象区域整体地存在的化合物的情况下，关注区域设定部将目标化合物的存在量多的部分和目标化合物的存在量少的或几乎不存在的部分分别设定为关注区域，msⁿ谱获取部在所述多个关注区域之间将所述多个关注区域各自的平均msⁿ谱或代表性msⁿ谱进行相减为宜。当对于两个msⁿ谱进行相减时，源自两者共有的以同等程度的量存在的化合物的峰的强度值变得接近于零，因此通过上述相减，源自目标化合物的产物离子的峰的强度值与源自几乎遍布测定对象区域整体地存在的化合物的产物离子的峰的强度值相比相对较大的可能性高。因此，这种情况下也是，当将已运算msⁿ谱供于库检索并求出表示谱的相似性的分数时，针对正确的化合物的分数变高。由此，能够正确地鉴定在关注区域中存在的未知化合物的可能性提高。

此外，在msⁿ谱获取部进行msⁿ谱的相减时，想要通过相减来删除的峰的强度值不一定是一致的。于是，也可以在至少一方的msⁿ谱的各峰的强度值乘以适当的系数之后进行相减。

如上所述，本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置中，能够设为根据用户基于其判断手动地指示来利用关注区域设定部对关注区域进行设定。

因此，本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置优选采取如下构成：

还具备：图像显示处理部，其将所述质谱分析成像图像或所述光学图像显示在显示部的画面上；以及

关注区域指定部，其用于用户在所显示的质谱分析成像图像上或光学图像上指定任意的小区域作为关注区域，

所述关注区域设定部将由所述关注区域指定部指定的小区域设定为关注区域。

上述关注区域指定部例如能够设为，根据鼠标等指示装置的操作，在所显示的质谱分析成像图像上或与质谱分析成像图像一起显示的光学图像上叠加地显示任意形状和大小的框，指定由该框包围的部分作为关注区域。

根据该构成，用户可以一边在显示画面上确认质谱分析成像图像，一边简便地指定关注区域。由此，能够可靠地指定被推测为目标化合物的存在量多的关注区域。

另外，在该情况下，本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置采取如下构成为宜：

还具备：参考图像制作部，其基于所述msⁿ谱数据，制作表示主要的多个质荷比下的信号强度分布的参考质谱分析成像图像；

图像分类部，其基于信号强度分布的相似性，将多个所述参考质谱分析成像图像分类为一个或多个组；以及

参考图像显示处理部，其将已被分类的参考质谱分析成像图像显示在显示部的画面上。

此处，上述“主要的多个质荷比”例如设为在将测定对象区域整体的msⁿ谱或经适当疏化后的多个测定点处的msⁿ谱全部相加或取平均而得到的msⁿ谱上，按照信号强度从大到小的顺序检测规定个数的峰的质荷比即可。另外，图像分类部能够通过主成分分析或分层聚类分析的方法来将参考质谱分析成像图像分类为一个或多个组。

被分类到相同组中的多个参考质谱分析成像图像具有相似的信号强度分布模式，能够推测为是源自相同化合物的产物离子的可能性高。于是，用户能够边参考所显示的参考质谱分析成像图像边判断仅包含目标化合物的部分后指定关注区域，或者，判断在目标化合物上重叠有其它化合物后指定应进行相减的关注区域。如此，用户能够正确地指定适当的关注区域。

另外，上述参考图像显示处理部也可以在显示部的画面上显示将分类出的多个组中的代表性的参考质谱分析成像图像以用不同的颜色表示的方式叠加所得到的图像，能够基于该图像来利用上述关注区域设定部对关注区域进行设定。

另外，本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置能够采取如下构成：所述msⁿ谱获取部对多个关注区域中的各个关注区域算出针对该关注区域中包含的测定点的平均msⁿ谱，将针对各关注区域的平均msⁿ谱进行相加或相减，从而得到所述已运算msⁿ谱。

根据该构成，多个关注区域中的msⁿ谱的相加或相减的处理是简单的。另外，对每个关注区域显示平均msⁿ谱也成为可能，因此在进行相加或相减之前或之后，用户容易地通过确认每个关注区域的平均msⁿ谱来判断关注区域的指定是否合适。

另外，本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置的第一方式中，

所述化合物鉴定部参考针对已知化合物存储有msⁿ谱的库来进行化合物鉴定，

将能够与已知化合物混合的包含一个或多个化合物的混合物的msⁿ谱与该混合物的混合条件一起事先存储于所述库中，

在获取到作为处理对象的msⁿ谱数据时的一部分分析条件与所述混合条件一致的情况下，在从实测的msⁿ谱中减去所述库中的与该混合条件对应的msⁿ谱后执行库检索。

作为有可能与已知化合物混合的化合物，在进行利用maldi的离子化的情况下考虑maldi用基质。另外，在试样例如为生物体组织切片等生物体试样的情况下，考虑在生物体组织中一般包含的化合物作为有可能与已知化合物混合的化合物。另一方面，混合条件是指使用的基质的种类、前体离子的质荷比、前体离子的裂解条件等。

在msⁿ谱数据获取时的分析条件与存储在库中的混合条件一致的情况下，源自该混合物的峰出现在实测的msⁿ谱上的可能性高。根据上述第一方式，在这种情况下，从实测的msⁿ谱去除源自所混合的化合物的峰或至少降低其信号强度，因此，通过库检索，对于目标化合物而言正确的化合物的表示相似度的分数变得更高。

此外，在这种情况下也与上述msⁿ谱获取部中的msⁿ谱的相减同样地，可以在至少一方的msⁿ谱的各峰的强度值乘以适当的系数之后进行相减。

另外，本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置的第二方式中，

所述化合物鉴定部参考针对已知化合物存储有msⁿ谱的库来进行化合物鉴定，

该化合物鉴定部执行基于将存储在所述库中的多个msⁿ谱组合所得到的msⁿ谱与实测的msⁿ谱之间的相似性的化合物鉴定。

此处，组合的msⁿ谱的数量例如可以预先决定为“2”等，但也可以事先设为能够由用户指定。

在第二方式中，化合物鉴定部从存储在库中的多个msⁿ谱中选择规定数量的msⁿ谱，将各msⁿ谱上的峰的强度相加。此时，也可以在多个msⁿ谱之中的一个或不是全部的多个msⁿ谱上的峰的强度乘以适当的系数之后进行相加。另外，该系数也可以由用户适当指定，或者通过在用户指定的范围或预先决定的范围内以规定的阶梯发生变化来设定多个阶段的系数。如此，边变更选择的msⁿ谱的组合、相乘的系数，边算出相加所得到的msⁿ谱与实测msⁿ谱的相似度，向用户呈现得到高相似度的msⁿ谱的组合和系数作为鉴定结果。由此，即使在没有充分除尽重叠于目标化合物的其它化合物的影响的情况下，获得用于鉴定目标化合物的重要信息的可能性也提高。

另外，本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置的第三方式中，

所述化合物鉴定部参考针对已知化合物存储有msⁿ谱的库来进行化合物鉴定，

该化合物鉴定部执行基于使存储在所述库中的msⁿ谱上的各峰向上或向下偏移规定的质荷比所得到的msⁿ谱与实测的msⁿ谱之间的相似性的化合物鉴定。

此处，使峰向上或向下偏移的质荷比的值例如可以根据假设会观测的加合离子的种类、加合于离子的加合物的质量等预先决定，也可以设为能够由用户自由地指定。或者，也可以边以规定的阶梯幅度使偏移量变化，边针对该偏移量不同的每个msⁿ谱计算与实测msⁿ谱的相似度。

根据该第三方式，即使在库中未收录考虑了加合离子的msⁿ谱的情况、在实测中生成了通过在库中收录的msⁿ谱中未设想的物质的加合得到的加合离子的情况下，找到对于目标化合物而言正确的化合物候选的可能性也提高。

此外，上述的本发明所涉及的第一方式至第三方式不限定于成像质谱分析数据处理装置、成像质谱分析数据处理方法，能够应用于进行基于库检索的化合物鉴定的通常的质谱分析数据处理装置、质谱分析数据处理方法。

即，与本发明相关的第一质谱分析数据处理装置，用于处理通过对试样进行msⁿ分析(其中，n为1以上的整数)所得到的msⁿ谱数据，所述质谱分析数据处理装置具备：

a)库，其将能够与已知化合物混合的包含一个或多个化合物的混合物的msⁿ谱与该混合物的混合条件一起收录；以及

b)化合物鉴定部，其通过将所述msⁿ谱数据与所述库对照来鉴定试样中的化合物，在获取到该msⁿ谱数据时的一部分分析条件与所述混合条件一致的情况下，在从实测的msⁿ谱中减去所述库中的与该混合条件对应的msⁿ谱后执行库检索。

另外，与本发明相关的第二质谱分析数据处理装置，用于处理通过对试样进行msⁿ分析(其中，n为1以上的整数)所得到的msⁿ谱数据，所述质谱分析数据处理装置具备：

a)库，其收录有已知化合物的msⁿ谱；

b)化合物鉴定部，其通过将所述msⁿ谱数据与所述库对照来鉴定试样中的化合物，基于将存储在该库中的多个msⁿ谱组合所得到的msⁿ谱与实测的msⁿ谱之间的相似性来鉴定化合物。

发明的效果

根据本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置及方法，在通过将针对生物体试样等用成像质谱分析装置得到的n为2以上的msⁿ谱数据供于库检索来鉴定试样中存在的目标化合物的情况下，能够降低或排除共存的其它化合物的影响，以高精度鉴定目标化合物。

附图说明

图1为使用了本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置的成像质谱分析装置的一实施例的概要示意图。

图2为本实施例的成像质谱分析装置中的试样中的化合物鉴定时的特征性的数据处理的流程图。

图3为本实施例的成像质谱分析装置中的试样中的化合物鉴定时的特征性的数据处理的说明图。

图4为示出本实施例的成像质谱分析装置中的roi指定时利用的参考质谱分析成像图像的显示的一例的图。

图5为示出本实施例的成像质谱分析装置中的roi指定时利用的参考质谱分析成像图像的显示的另一例的图。

图6为示出本实施例的成像质谱分析装置中的基于库检索的鉴定处理的一例的流程图。

图7为示出本实施例的成像质谱分析装置中的基于库检索的鉴定处理的另一例的流程图。

图8为示出本实施例的成像质谱分析装置中的基于库检索的鉴定处理的又一例的流程图。

图9为在前体离子中同时包含源自dhb的多聚体的离子和源自还原型谷胱甘肽的离子的情况下的实测的ms/ms谱(a)、dhb的多聚体的标准ms/ms谱(b)、及还原型谷胱甘肽的标准ms/ms谱(c)。

图10为使用9-aa基质针对包含amp的规定的生物体试样得到的实测的ms/ms谱(a)、amp单独的标准ms/ms谱(b)、及从实测的ms/ms谱中减去amp的标准ms/ms谱而得到的结果(c)。

具体实施方式

以下，参考附图对于使用了本发明所涉及的成像质谱分析数据处理装置的成像质谱分析装置的一实施例进行说明。

图1为本实施例的成像质谱分析装置的概要示意图。

本实施例的成像质谱分析装置具备：成像质谱分析部1，其对于试样执行质谱分析成像；数据处理部2，其对于在成像质谱分析部1得到的数据执行后述那样的各种数据处理；输入部3，其用于用户(分析员)操作；以及显示部4，其显示分析结果等以向用户呈现。

成像质谱分析部1虽未图示，但包括大气压maldi离子源、离子阱及飞行时间型质谱仪(tofms)。该成像质谱分析部1能够对于由用户指定的试样上的测定对象区域内的多个测定点分别实施质谱分析(ms分析及ms/ms分析)，针对每个测定点获得遍及规定的质荷比范围的ms(＝ms¹)谱数据及ms/ms(＝ms²)谱数据。

数据处理部2包含谱数据存储部20、参考信息制作处理部21、roi(关注区域)设定处理部22、平均谱制作部23、谱加减运算部24、鉴定处理部25、谱库26等作为功能块。

参考信息制作处理部21包含主要峰提取部210、图像制作处理部211、图像分类部212、参考信息显示处理部213作为详细的功能块。在谱库26中，针对多个已知化合物，与化合物信息(化合物名称、组成式、理论分子量、cas号等)关联地收录有标准的ms谱及ms/ms谱。

此外，数据处理部2的实体为个人计算机(或更高性能的工作站)，通过执行预先安装于该计算机的专用的数据处理用软件来实现上述各块的功能。

以下，对于使用本实施例的成像质谱分析装置来鉴定在生物体试样中特异性分布的化合物时的用户进行的操作及本装置的处理工作进行说明。

图2为此时的特征性的数据处理的流程图，图3为该数据处理的说明图。

成像质谱分析部1首先针对试样上的具有二维扩展的测定对象区域中的多个测定点分别执行质谱分析，采集ms谱数据(步骤s1)。针对一个测定点得到的数据为构成遍及规定质荷比m/z范围的质谱的数据。所得到的数据被送至数据处理部2，与测定点的空间位置信息关联地存储到谱数据存储部20。此外，通常在成像质谱分析部1中附设光学显微镜，用户能够参考由光学显微镜得到的光学图像来指定测定对象区域。

接着，根据用户从输入部3进行的规定的输入操作，图像制作处理部211基于在谱数据存储部20中存储的质谱数据，针对测定对象区域整体或由用户指定的一部分区域制作表示由用户指定的特定质荷比下的信号强度的二维分布的ms成像图像，显示在显示部4的画面上。此时，光学图像也能够一并显示在显示部4的图像上。另外，根据用户从输入部3进行的规定的输入操作，平均谱制作部23制作将针对测定对象区域整体或由用户指定的一部分区域中包含的测定点得到的质谱取平均而得到的平均质谱，显示在显示部4的画面上。用户参考如此显示的ms成像图像、平均质谱，还根据需要参考在谱库26中收录的已知化合物的信息，指定被推测为源自想要鉴定的目标化合物的离子作为前体离子(步骤s3)。

当由用户指定前体离子的质荷比时，成像质谱分析部1对于测定对象区域中的多个测定点分别执行以所指定的前体离子为目标的ms/ms分析，采集ms/ms谱数据(步骤s4)。若所指定的前体离子为仅源自目标化合物的离子，则在ms/ms谱中仅出现源自目标化合物的产物离子。然而，在所指定的前体离子中重叠有源自除目标化合物以外的其它化合物的离子的情况下，在ms/ms谱中，除了出现源自目标化合物的产物离子的峰之外，还出现源自上述其它化合物的产物离子的峰。这种情况下，若将该ms/ms谱直接供于库检索来进行化合物鉴定，则存在未能以足够的相似度鉴定(即无法鉴定)正确的化合物作为目标化合物、或者举出错误的其它化合物作为化合物的候选的担心。

于是，本实施例的成像质谱分析装置中，首先，参考信息制作处理部21制作通过ms/ms分析观测到的主要质荷比下的产物离子的ms/ms成像图像作为参考ms/ms成像图像，显示在显示部4的画面上(步骤s5)。更详细而言，参考信息制作处理部21例如执行如下所述的处理。

首先，主要峰提取部210求出将针对测定对象区域中的所有测定点得到的ms/ms谱取平均而得到的ms/ms谱，对于该ms/ms谱按照规定的基准检测出峰，将其作为主要峰。例如，检测峰强度值为规定阈值以上的峰，或按照峰强度值从大到小的顺序检测规定个数的峰即可，通常检测多个主要峰。

图像制作处理部211制作上述主要峰的质荷比下的ms/ms成像图像作为参考ms/ms成像图像，图像分类部212将所述多个图像根据二维分布的相似性进行分组。对于该图像的分类，能够使用主成分分析、分层聚类分析等统计分析方法。

图4为利用主成分分析对参考ms/ms成像图像进行了分类的显示的一例。

在本例中，对于包含多个主要峰的m/z值和各测定点处的主要峰的强度值信息的矩阵数据，以各m/z值为解释变量进行主成分分析，将各m/z值的线性组合作为新的主成分(即第二、第三、…主成分)。基于针对该m/z值的线性组合的ms/ms谱数据的各像素(测定点)的强度值制作二维分布图像而得到的是图4所示的参考图像显示画面100中的最左端的列的图像。该图像能够理解为表示被分类到该主成分的组中的m/z值下的标准二维分布的热图。另外，在图4中上述图像的右侧示出表示根据主成分分数计算的每个m/z值的因子载荷(主成分载荷)的大小的因子载荷谱，再在其右侧，针对各主成分按照因子载荷从大到小的m/z值的顺序显示了该m/z值的ms/ms成像图像。此外，因子载荷谱是指将按每个m/z值求出的因子载荷表现为质谱形式所得到的谱。

通过该参考图像显示画面100，能够汇总地确认ms/ms成像数据中的特征性的空间分布以及与该分布接近的各个ms/ms成像图像。

另外，也可以代替图4所示那样的信息，或者与图4所示那样的信息一起，制作将通过主成分分析分类出的各组中的代表性的参考ms/ms成像图像以用不同的颜色表示的方式叠加所得到的图像，将其显示以供用于roi设定的参考。

图5为利用分层聚类分析对参考ms/ms成像图像进行了分类的显示的一例。

以各m/z值下的ms/ms成像数据为分类对象来进行分层聚类，将ms/ms成像图像分类为用户预先指定的簇数，或者分类为通过jain-dubes法、x-means法、uppertail法等自动决定的簇数。然后，将各m/z值下的ms/ms成像图像按每个簇分别显示。

在图5所示的参考图像显示画面110中的上部区域显示各簇的代表性的成像图像，当用户通过点击操作等选择其中一个成像图像时，属于(被分类到)该簇的m/z值的ms/ms成像图像在下部区域列表显示。

在该参考图像显示画面110中，能够确认ms/ms成像数据中的特征性的空间分布以及其中一个簇中包含的多个ms/ms成像图像。

在上述步骤s5中对参考ms/ms成像图像进行了分类的结果是，在分布模式仅存在1种的情况下，可知在该ms/ms谱的前体离子中仅包含1种化合物的可能性高。另外，相反地，在对参考ms/ms成像图像进行了分类的结果是，在分布模式为多种的情况下，能够判断为与它们对应的峰为源自不同化合物的产物离子的峰的可能性高。于是，基于所显示的空间分布信息，用户能够识别例如被推测为仅包含目标化合物或包含特别多的目标化合物的区域，并指定roi。另外，能够判定在目标化合物的分布区域是否重叠有其它化合物的分布区域，在重叠的情况下，在后述的roi指定时指定平均ms/ms谱的相减而非相加。

如上所述，用户确认所显示的参考ms/ms成像图像，指定被推测为例如与目标化合物的分布接近的适当的m/z值(步骤s6)。于是，roi设定处理部22将所指定的m/z值的ms/ms成像图像显示在显示部4的画面上(步骤s7)。当然，也能够将多个m/z值下的ms/ms成像图像例如并排地显示。用户在该ms/ms成像图像上指定多个关注区域(roi)，或者边参考ms/ms成像图像边在光学图像上指定多个关注区域(roi)，进而选择执行平均ms/ms谱的相加处理和相减处理中的哪一个处理(步骤s8)。例如图3的(a)所示，当用指示装置进行以包围所显示的ms/ms成像图像上的任意范围的方式画框的操作时，roi设定处理部22识别画出的框，将用该框包围的范围设定为roi。用户能够指定任意数量、任意大小的roi。此外，虽然在选择相加处理的情况下是不需要的，但是在选择相减处理的情况下优选设为能够分别指定被减的roi和要减去的roi。

如上所述那样在前体离子中除了重叠有源自目标化合物的离子之外还重叠有源自其它化合物的离子的情况下，在ms/ms谱中混合存在源自目标化合物的产物离子的峰与源自其它化合物的产物离子的峰。在被推测为源自目标化合物的产物离子的质荷比(例如图3的(a)中m/z＝m1)的ms/ms成像图像上，信号强度高的部分被推测为目标化合物的存在量多。于是，用户指定信号强度高的部分作为roi即可。

当roi设定处理部22根据由用户进行的操作设定多个roi时，平均谱制作部23从谱数据存储部20获取与所述多个roi中分别包含的测定点对应的ms/ms谱数据，如图3的(b)所示，对每个roi算出平均ms/ms质谱。进而，谱加减运算部24在步骤s8中选择了相加处理的情况下，如图3的(c)所示，通过将各roi的平均ms/ms谱相加，从而算出相加处理后的ms/ms谱(步骤s9)。

如上所述那样在ms/ms成像图像上指定了信号强度高的部分作为roi的情况下，在与各roi对应的平均ms/ms谱中以高信号强度出现源自目标化合物的产物离子的峰，源自共存的其它化合物的产物离子的峰的信号强度应该相对较低。多个roi中的各个roi中应该状况相同，因此，当将针对各roi的平均ms/ms谱相加时，源自目标化合物的产物离子的峰的信号强度与源自其它化合物的产物离子的峰的信号强度之差扩大。即，与其它化合物相比，源自目标化合物的产物离子峰的强度变得相对较大。

鉴定处理部25通过将在上述相加处理后的ms/ms谱中检测出的峰的信息供于库检索来鉴定化合物(步骤s10)。即，将从相加处理后的ms/ms谱得到的峰信息与在谱库26中收录的各种化合物的ms/ms谱进行对照，分别计算谱图案的相似度，提取相似度的分数高的化合物作为目标化合物的鉴定候选。然后，该鉴定结果、即作为鉴定候选的化合物的名称等信息与相似度的分数一起显示在显示部4的画面上(步骤s11)。

如上所述，关于相加处理后的ms/ms谱，与相加处理前的ms/ms平均谱相比，源自目标化合物的产物离子的峰强度与源自其它化合物的产物离子的峰强度之比变得相对较大。因此，在鉴定处理中计算了谱图案的相似度时，与目标化合物对应的正确的化合物候选得到高分数的可能性变高，能够提高目标化合物的鉴定精度。

另外，为了降低与目标化合物共存的其它化合物的影响，优选在步骤s8中，用户指定两者共存的roi、以及仅存在其它化合物或其它化合物以特别高的信号强度存在的roi，进行从前者减去后者的选择。这种情况下，在ms/ms谱上源自其它化合物的产物离子的峰强度下降，因此与上述同样地，在基于库检索的鉴定处理时与目标化合物对应的正确的化合物候选得到高分数的可能性变高，能够提高目标化合物的鉴定精度。

此外，也可以设为，为了在进行ms/ms谱的相减时可靠地去除不需要的峰，在要减去的ms/ms谱乘以特定的系数之后进行相减，或者，若要减去的ms/ms谱的峰的m/z值与原本的ms/ms谱的峰的m/z值在一定的允许范围内一致，则无论信号强度如何，均在从原本的ms/ms谱删除该峰之后进行库检索。

此处，作为上述处理的具体例，说明对于针对上述dhb的多聚体与还原型谷胱甘肽的混合物得到的ms/ms谱数据应用本实施例的方法来实施了鉴定的情况的例子。

在该情况下，如上所述那样进行了以往的通常的库检索的结果是，虽然相似度的分数低，但举出dhb和还原型谷胱甘肽作为鉴定候选。由在谱库26中收录的ms/ms谱可知，还原型谷胱甘肽的主要产物离子的峰为m/z＝178(质子加合离子的情况下m/z＝179)。若显示该峰的质荷比下的ms/ms成像图像，则能够知晓还原型谷胱甘肽的大致的二维分布。同样地，dhb多聚体的主要产物离子峰为m/z＝290，还原型谷胱甘肽的产物离子不存在该峰，因此若利用该峰制作ms/ms成像图像，则能够知晓dhb多聚体的大致的二维分布。

此处，还原型谷胱甘肽为想要鉴定的目标化合物，因此在m/z＝178(质子加合离子的情况下m/z＝179)下制作ms/ms成像图像，在该图像中信号强度值大的部分设定了两个的roi。将对这些各roi中包含的各测定点的平均ms/ms谱相加而得到的ms/ms谱供于库检索时，其结果，还原型谷胱甘肽的相似度的分数为“67”，比以往的分数值大幅提高。

另一方面，若在作为源自dhb多聚体的产物离子峰的m/z＝290(质子加合离子的情况下m/z＝291)下制作ms/ms成像图像，则知晓dhb多聚体的存在量多的区域。于是，将从与源自还原型谷胱甘肽的产物离子的强度大的roi对应的平均ms/ms谱减去与源自dhb多聚体的产物离子的强度大的roi对应的平均ms/ms谱而得到的ms/ms谱供于库检索时，其结果，还原型谷胱甘肽的相似度的分数同样为“67”，比以往的分数值大幅提高。

此外，在上述实施例的成像质谱分析装置中，在步骤s5中显示了如图4、图5所示那样的参考图像显示画面时，也可以设为能够由用户指定空间分布不同的成像图像中的代表性的成像图像并将其叠加显示。这种情况下，也可以设为用户参考该叠加显示的图像在仅分布有想要鉴定的目标化合物的区域设定roi，能够基于该roi的范围内包含的多个测定点的ms/ms谱的平均值等来进行化合物鉴定。

另外，在上述实施例的成像质谱分析装置中，在执行不使离子裂解的质谱分析时将对试样照射的激光的直径事先设定为小于激光照射点间隔，在ms/ms分析执行时，在与质谱分析执行时重复的范围内，将在该质谱分析执行时未照射激光的部位作为激光照射点来进行ms/ms分析为宜。由此，即使在质谱分析执行时因激光照射而使该激光照射部位附近的试样中的目标化合物的量减少，也能够在ms/ms分析执行时可靠地得到针对该化合物的产物离子信息。

另外，在上述实施例的成像质谱分析装置中，在ms/ms谱的相加或相减时设定的roi不仅可以在同一试样中的单一测定对象区域内设定，还可以在同一试样上的不同的测定对象区域内或不同的试样上的测定对象区域内设定。例如，使用投放了药物的动物的特定脏器的组织切片作为目标样品，并使用未投放任何物质的动物的相同脏器的组织切片作为对照样品，对于因投放药剂而强度值变动的质谱的峰实施ms/ms分析。通过从针对目标样品的roi的ms/ms谱减去针对对照样品的同样的roi的ms/ms谱，从而能够判别强度值变动的原因是否单纯地基于与该峰相当的化合物的增减，或者是否以同一质量出现了其它化合物等。

另外，成为相加或相减的对象的质谱也可以是基于由成像质谱分析装置获取到的数据的特定的roi中的代表性的质谱、以及例如用液相色谱质谱联用仪(lcms)等其它质谱分析装置获取到的质谱。另外，理想的是，在谱库中收录的化合物的msⁿ谱是用与测定所使用的成像质谱分析装置相同的方式的装置针对标准试样获取到的msⁿ谱、针对实际试样获取到的msⁿ谱，但是，也可以是基于用离子化法不同的lcms等其它方式的质谱分析装置获取到的数据的msⁿ谱。

另外，在进行了相减处理后的质谱、通过主成分分析得到的因子载荷谱中，有时出现负的强度值。这种情况下，可以在将负值替换为零后进行后续的检索处理。

另外，在上述实施例的成像质谱分析装置中，基于根据各测定点处的实测的ms/ms谱数据求出的ms/ms谱与在谱库26中收录的已知化合物的标准ms/ms谱之间的相似性，进行了化合物鉴定，但也可以进一步进行以下所述那样的鉴定处理。

[鉴定处理的变形例1]

图6为在本变形例1中鉴定处理部25执行的特征性的处理的流程图。

在上述实施例中，在谱库26中收录的ms/ms谱与已知化合物对应，但此处，将有可能与某个化合物混合的未知的、即无法鉴定的混合物的ms/ms谱与其混合条件即分析条件一起事先保存在谱库26中。

当列举具体例时，例如使用9-氨基吖啶(以下简写为“9-aa”)基质，对于包含腺苷酸(以下简写为“amp”)的规定的生物体试样，在负离子化模式下将前体离子的m/z值设定为349.07并进行了ms/ms分析，其结果，得到图10的(a)所示那样的ms/ms谱。另一方面，amp单独的标准ms/ms谱如图10的(b)所示。于是，求出从实测的ms/ms谱减去amp的标准ms/ms谱而得到的图10的(c)所示那样的ms/ms谱。该ms/ms谱可以说是有可能与amp混合的混合物的ms/ms谱。此外，该混合物有时为一种化合物，也有时混合有多种化合物。即使在无法根据上述混合物的ms/ms谱鉴定该化合物的情况下，也将该混合物的ms/ms谱与分析所使用的基质、试样的种类、前体离子的m/z值等分析条件一起事先收录在谱库26中。

鉴定处理部25在被提供了基于实测数据的ms/ms谱时，关于是否存在符合得到了该数据时的分析条件的ms/ms谱，在谱库26中执行检索(步骤s21、s22)。若存在符合的ms/ms谱，则从步骤s22向s23推进，在不存在符合的ms/ms谱的情况下跳过步骤s23的处理，从s22向s24推进。

例如，在上述混合物的ms/ms谱上的峰源自9-aa基质、或源自生物体试样中通常含有的化合物、或源自它们的混合物的情况下，在以相同的分析条件对其它生物体试样进行了ms/ms分析时，在该ms/ms谱中也有可能出现上述混合物的ms/ms谱上的峰。于是，在步骤s22中判定为存在符合的ms/ms谱的情况下，判断为该ms/ms谱混合在实测ms/ms谱中，从实测的ms/ms谱减去从谱库26读取到的混合物的ms/ms谱(步骤s23)。然后，在进行了相减处理的情况下将该相减后的ms/ms谱供于通常的库检索，或者在未进行相减处理的情况下将实测的ms/ms谱供于通常的库检索，从而执行化合物的鉴定(步骤s24)。

当然，即使在步骤s22中判定为“是”的情况下，该符合的混合物的ms/ms谱也未必混合在实测ms/ms谱中。因此，优选事先设为并非自动从步骤s22移向s23的处理，而是例如将符合的混合物的ms/ms谱显示在显示部4的画面上，能够由用户在对其进行确认之后选择是否执行步骤s23的处理。

[鉴定处理的变形例2]

图7为在本变形例2中鉴定处理部25执行的特征性的处理的流程图。

在上述实施例中，逐一判定了在谱库26中收录的每个ms/ms谱与实测的ms/ms谱的相似性，但在本变形例2中，将在谱库26中收录的多个ms/ms谱组合所得到的、即进行相加而得到的ms/ms谱也作为检索的对象。

即，鉴定处理部25在被提供了实测的ms/ms谱时，首先从谱库26中选择预先指定的数量的ms/ms谱(步骤s31)，在使它们乘以初始设定的系数之后将ms/ms谱进行相加(步骤s32、s33)。优选事先设为，ms/ms谱的选择数量能够由用户预先指定。另外，优选事先设为系数的范围及使系数变化的阶梯幅度也能够由用户预先指定，系数的初始设定值能够与之相应地自动地决定。然后，计算相加处理后的ms/ms谱与实测的ms/ms谱的相似度(步骤s34)。该相似度的计算方法例如能够使用专利文献1所记载的方法。然后，针对根据所指定的系数范围和系数的阶梯幅度决定的所有系数，判定是否处理已结束(步骤s35)，若未处理，则在变更系数(步骤s36)后返回至步骤s33。通过重复步骤s33～s36的处理，计算针对所选择的ms/ms谱的组合的在各种系数下相加得到的ms/ms谱与实测ms/ms谱的相似度。

当在步骤s35中判定为“是”时，这一次针对所有ms/ms谱的组合判定是否处理已结束(步骤s37)，若未处理则返回至步骤s31，在选择不同组合的ms/ms谱之后重复上述处理。因此，通过重复步骤s31～s37的处理，计算针对规定数量的ms/ms谱的所有组合的相似度。然后，最终提取其中得到最高的相似度的ms/ms谱的组合、系数及该相似度，将其作为鉴定结果显示在显示部4(步骤s38)。另外，也可以按照相似度从高到低的顺序显示规定数量的结果。

此外，优选的是，在指定了3以上的值n作为ms/ms谱的组合数的情况下，不仅针对n个ms/ms谱，而且针对小于n的数量的ms/ms谱的组合，也设为相似度的计算对象。

此外，优选的是，在谱库26中，除了事先收录有已知化合物的ms/ms谱之外，还事先收录有在选择了加合离子加合于基质的多聚体而成的离子、或加合离子加合于从基质的多聚体脱落了特定中性分子的物质而成的离子作为前体离子时得到的ms/ms谱、以及在上述变形例1中使用的混合物的ms/ms谱等。另外，优选的是，还事先收录有针对同一化合物在maldi离子源中的激光的照射条件(激光能量、照射时间等)、通过碰撞诱导裂解使离子裂解时的条件(碰撞能量、碰撞气压等)不同的条件下得到的ms/ms谱等。

[鉴定处理的变形例3]

图8为在本变形例3中鉴定处理部25执行的特征性的处理的流程图。

在利用maldi离子源使化合物离子化时，质子加合于该化合物或质子从该化合物脱离地发生离子化的情况较多，但根据条件，有时na、k等碱金属离子代替质子而加合于该化合物地发生离子化。当选择这种加合离子作为前体离子来进行ms/ms分析时，存在以下情况：在通过碰撞诱导裂解使离子的特定的键合部分裂解而碎片化的结构体上加合已加合于前体离子的碱金属离子等，其作为ms/ms谱上的峰而被观测到。于是，在本变形例3中，考虑与该加合离子相当的质荷比差来进行库检索。

通常，在谱库26中收录的ms/ms谱为针对纯化合物的标准品选择该化合物的质子加合离子的峰作为前体离子的ms/ms谱。另一方面，在实际测定试样时，在目标化合物的质子加合离子的峰与源自其它化合物的峰重叠等情况下，有时不得不选择加合离子的峰作为前体离子来实施ms/ms分析。在该情况下，实测的ms/ms谱接近相对于在谱库26中收录的ms/ms谱而言横轴平移了与h与na的质量差相应的量后的谱。

于是，鉴定处理部25在被提供了实测的ms/ms谱时，在从谱库26选择ms/ms谱后，使该ms/ms谱上的各峰沿m/z值的增加方向或减少方向偏移基于由用户指定的偏移条件的偏移量的初始设定值(步骤s42、s43)。优选事先设为该偏移条件、即偏移量的范围及使偏移量变化的阶梯幅度能够由用户预先指定，偏移量的初始设定值能够与之相应地自动决定。然后，计算偏移后的ms/ms谱与实测的ms/ms谱的相似度(步骤s44)。然后，判定按照所指定的偏移条件进行的所有处理是否已结束(步骤s45)，若未处理则在变更偏移量(步骤s46)之后返回至步骤s43。通过重复步骤s43～s46的处理，计算使所选择的ms/ms谱偏移了各种偏移量所得到的ms/ms谱与实测ms/ms谱的相似度。

当在步骤s45中判定为“是”时，这一次针对所有ms/ms谱判定是否处理已结束(步骤s47)，若未处理则返回至步骤s41，在选择不同的ms/ms谱之后重复上述处理。因此，通过重复步骤s41～s47的处理，计算针对所有ms/ms谱的相似度。然后，最终提取其中得到最高的相似度的ms/ms谱、偏移量及该相似度，将其作为鉴定结果显示在显示部4(步骤s48)。另外，也可以按照相似度从高到低的顺序显示规定数量的结果。

此外，在执行ms/ms分析时无法确定前体离子的加合离子的种类的情况下，也可以由用户输入该加合离子的种类、质量等信息，基于该输入，鉴定处理部25使在谱库26中收录的ms/ms谱偏移与加合离子相当的量，并与实测ms/ms谱对照。

当然，上述变形例1～3既能够全部一并应用于上述实施例的成像质谱分析装置，也可以仅应用其一部分。

另外，在上述变形例1～3中说明的鉴定方法不仅能够利用于基于由成像质谱分析装置得到的数据的化合物鉴定，也能够利用于基于由更普遍的能够进行ms/ms分析的质谱分析装置、例如串联四极杆型质谱分析装置、q-tof型质谱分析装置、离子阱质谱分析装置、离子阱飞行时间型质谱分析装置等得到的数据的化合物鉴定。

另外，上述实施例、上述各种的变形例均不过是本发明的一例，即使在本发明的主旨的范围内适当进行变更、修改、追加也当然包含在本申请权利要求书的范围之内。例如，上述实施例中使用ms/ms谱进行了化合物鉴定，但在使用n为3以上的msⁿ谱进行化合物鉴定时也能够利用本发明。

附图标记说明

1：成像质谱分析部；2：数据处理部；20：谱数据存储部；21：参考信息制作处理部；210：主要峰提取部；211：图像制作处理部；212：图像分类部；213：参考信息显示处理部；22：roi设定处理部；23：平均谱制作部；24：谱加减运算部；25：鉴定处理部；26：谱库；3：输入部；4：显示部。