本发明涉及肝素诱导的血小板减少症检验技术领域，尤其涉及一种免疫微球层析快速HIT抗体检测试试纸制备方法。
背景技术：
HIT是一种抗体介导的综合征，有较高的发病率和致死率，过去由于很多医生没有足够的认识及难以确诊常被认为是一种罕见疾病。并且除了肝素外也无更好的治疗手段。HIT的发病率高低主要与肝素使用时间，肝素类型，使用途径，患者类型，性别及人种等因素相关。
有关HIT的发病机制还不是很明确，目前普遍认为是血循环中出现肝素样化合物时，PF4(血小板因子4)即以高亲和力与之结合，形成肝素-PF4(H-PF4)复合物(肝素失去活性)。H-PF4复合物形成后，其构象发生改变(松散，在第3、4个半胱氨酸残基间暴露出多个抗原表位，机体内发生免疫反应，产生免疫球蛋白IgG，IgA,IgM)——IgG-H-PF4复合物。IgG-H-PF4复合物结合到血小板膜受体上——大量血小板激活和聚集及血小板数量下降。血小板广泛激活后，其囊泡内颗粒释放——激活凝血系统，凝血酶形成增加。活化的血小板与凝血因子相互作用——血栓形成。
HIT与其它原因诱导产生的血小板减少症相比，HIT患者血小板计数常>20*10^9.发作时间在使用肝素后5～14天。
HIT的主要并发症不是因血小板减少导致的出血性疾病，而是因血小板抗体原因机体处于高凝状态，病理性血栓形成。且动脉血栓栓塞发生率极高。另外，HIT有50％的风险会导致一系列的并发症，血栓多发生于静脉。例如双下肢深部静脉血栓形成、肺栓塞、肢端静脉坏疽fingers,toes,penis,or nipples、心梗、卒中、肠系膜动脉血栓、四肢局部缺血及截肢(Circulation 1999；100:587-93)。
另外，部分患者局部肝素注射部位可出现痛性红斑或皮肤坏死。急性血小板激活(寒战、肌痛、发热、心动过速、大汗及恶心等，罕见症状有急性一过性遗忘。)HIT相关死亡率约为18％。但是，正确的管理可以减少发病率和死亡率。
HIT目前尚无确诊方法。但目前常用的方法为根据临床表现进行4TS评分(表1)评估结合实验室检查排除HIT阴性患者，Warkentin通过血小板计数、发生时间、血栓情况以及血小板的可能原因四个因素设计了简明4Ts评分表，经过不断演变和大量研究验证，高概率(评分6～8分)阳性预测值为0.64；低概率(评分≤3分)阴性预测值为0.998。用于初步排除可疑HIT被广泛应用于临床，并得到指南推荐。
由于目前HIT阳性确诊较为困难，因此，快速，高NPV的PF4-H检测作为阴性排除手段则显得尤其重要！
目前西方国家采用的HIT抗体检测试剂主要为ELISA方法，该方法在国外临床筛查中非常普及，但由于需要专业的检测人员，操作复杂，耗费时间长，阳性预测值不高。流式细胞术HITKit和SRA放射免疫方法产品因临床操作复杂，检测报告时间过长，临床普及程度较低，HemosIL公司的免疫比浊法HIT-Ab(PF4-H)经过临床实践后，具有很好的实验室应用价值，但是该方法为大型凝血仪检测项目，不适合用于床旁POC，临床需要更便捷快速的方法进行检测，Stago公司的STic Expert和Akers Biosciences公司的PIFA PlussPF4TM可用于临床快速POCT检测，但是HIT抗体没有被定量检测，临床检测敏感度低。
针对以上方法进行肝素/PF4抗体检测时的临床局限性，我们提供了一种新的HIT抗体的检测试纸，该检测试纸条应用荧光微球标记重组蛋白A的颗粒，避免了传统标记抗体的不稳定性，提高检测灵敏度，通过免疫侧向层析技术定量检测血液样本中的HIT抗体。
技术实现要素：
(一)要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题是提供了灵敏，准确，可靠的，定量的，成本低，快速，容易使用的一种免疫微球层析快速HIT抗体检测试纸制备方法，采用荧光染色标记重组蛋白A的颗粒作为指示系统，以取代胶体金标记，提高标记检测稳定性，定量检测样本中肝素/PF4抗体，侧向免疫层析方法可用于患者的床旁检测，弥补了实验室检测的局限性。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种免疫微球层析快速HIT抗体检测试纸制备方法，图1为本发明的试纸条的示意图。
本发明提供的一种免疫微球层析快速HIT抗体检测试纸制备方法包括如下步骤：
图一所示的部位3为检测线，该检测线标记有肝素-PF4复合物，肝素-PF4复合物特异性结合样本中的HIT抗体和荧光染色微球的标记物质；
S1、肝素-PF4复合物制备方法如下：
将缓冲液配制的肝素制剂与血小板4因子在室温条件按照以下体积比1:1-1:5但不限于该比例进行混合孵育，向反应液中加入10％-50％的糖类物质作为稳定剂；
S2、蛋白A颗粒制备,选用但不限于染色荧光微球、乳胶微球、制备包被有蛋白A用于显色，便于仪器定量或定性检测肝素/PF4抗体浓度；
S3、反应膜的制备，其特征在于反应垫包括但不限于NC膜，硝酸纤维膜、醋酸纤维膜，反应垫上质控线与检测线各一条，检测线固定喷涂有S1步骤肝素/PF4复合物，质控线固定喷涂有人免疫球蛋白抗体。
图一所示的部位1为样品垫区域，该区域接受人样本，并将样本进行分离，允许分离后的血浆或血清样本与图一部位的部位2结合。
S4、样品垫制备,应用但不限于玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、NC膜，用一种或几种防腐剂、表面活性剂、血清白蛋白、氯化钠、糖类试剂进行浸泡，置于37-56℃干燥处理，储存于密封包装袋中待用；
图一所示的部位2为显色颗粒标记区，由纤维膜组成，标记有蛋白A与染色颗粒，该颗粒为过量，部分与人样本中的HIT抗体结合，通过侧向层析膜流向图一所示的部位3区域。
S5、颗粒标记的样品垫，在干燥后的图一的部位2纤维膜标记S2中的蛋白A颗粒试剂，置于37-56℃干燥处理；
S6、图一所示的部位1为血液分离膜，将测试条的样品垫上加入血液分离膜，用于分离血细胞，允许分离后的血浆或血清进入样品垫；
S7、图一所示为试纸条的整体示意图，试纸条的组装主要是将S5中标记蛋白A的样本垫组装到带有黏胶载体塑料板一端，用力按压，将一种不限于硝酸纤维素膜或NC膜组装于试纸条中部，试纸条的另一端粘贴吸水膜，维持样品侧向层析，将试纸条放入塑料盒中，将样品垫的一段放置在塑料盒底部，吸水纸一端固定于塑料盒顶端；
临床样本检测，室温下在试纸条的样品垫部位加入全血样本，反应；
其中在步骤S1中的制备肝素-PF4复合物，肝素制剂和血小板因子4的缓冲液包括但不限于磷酸盐、Tris、HEPES等常规的缓冲液。
其中在步骤S1中肝素制剂和血小板因子4的混合比例包括但不限于体积比1:1-1:5进行混合反应，
其中在步骤S1中加入的糖类物质包括但不限于加入蔗糖、海藻糖、葡萄糖等糖类，糖类物质加入比例包括但不限于10％-50％。
其中在步骤S2中的蛋白A颗粒制备的显色颗粒包括但不限于荧光微球、染色微球。
其中步骤S2所述的蛋白A标记颗粒方法，其特征在于，微球或显色颗粒粒径包括但不限于0.1-1微米。
其中步骤S2所述的显色颗粒标记为重组蛋白A标记颗粒。
其中步骤S3所述的检测线标记有S1步骤中的肝素/PF4复合物。
其中步骤S4中的样品垫处理试剂表面活性剂包括但不限于吐温、曲拉通等，血清白蛋白包括但不限于牛血清白蛋白、人血清白蛋白等，糖类物质包括但不限于加入蔗糖、海藻糖、葡萄糖等糖类，
其中步骤S7所述的制备方法，其特征在于试纸条中部的纤维素膜上分布有检测线和质控线。
其中步骤S7所述的质控线标记有重组蛋白A抗体，该抗体特异性结合重组蛋白A标记颗粒。
其中步骤S7所述的测试样本是全血或成分血液。
其中测试样本中的HIT抗体为人免疫球蛋白抗体，抗体类型包括IgA、IgG、IgE、IgM抗体。
其中样品垫中防腐剂包括但不限于叠氮钠、硫柳汞、硫酸庆大霉素等生物防腐剂。
(三)有益效果
本发明的上述技术方案具有以下有益效果：本发明为一种免疫微球层析快速HIT抗体检测试纸的制备方法，采用蛋白A标记的荧光或染色微球作为指示系统，染色微球的共价结合蛋白A和HIT抗体，以取代常规胶体金定性检测HIT抗体方法，解决了HIT抗体的临床定量检测，提高了现有市场上的胶体金检测的灵敏度、稳定性，准确性，通过POCT光密度检测仪定量检测HIT抗体，提示抗体滴度弱、强、较强的梯度变化，使临床检验时操作简便，省时，样本用量少，一般只需要50ul患者样本即可，检测结果清晰准确，可重复性强，检测结果同时达到肉眼和自动化机器准确判读的效果，检测结果易于标准化。同时在进行HIT抗体检测试纸实验时增加了对照质控线，保证实验结果的有效性和质量控制。
附图说明
图1为本发明实施例一种免疫微球层析快速HIT抗体检测试纸的示意图；
图2为本发明实施步骤流程图
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例一
如图1所示，一种免疫微球层析快速HIT抗体检测试纸制备方法，包括如下步骤：
S1、肝素/PF4复合物制备具体步骤：
40ul的肝素(1000U/ml)，用PH7.4的PBS缓冲液溶解，混合94ul的1.4mg/ml的血小板因子4，加入56ul纯水，室温孵育30min后变成黄色的复合溶液,然后加入4ul的50％的蔗糖溶液和4ul的25％的海藻糖溶液，混合后加入2ul的PH9.0的1M的TAPS缓冲液待用。
实施例二
S2、蛋白A颗粒制备
具体步骤：取100ml 10％的0.3um的荧光微球，用PH4.5 50mM的MES溶液洗涤3次，加入1ml新鲜配制的10mg/ml的EDAC溶液(PH4.5 50mM的MES配制)，室温孵育30min，然后用2000rpm离心5min,然后用PH4.5 50mM的MES溶液洗涤，用1ml的0.65mg/ml的重组蛋白A(PBS)室温孵育过夜，用10％BSA、100×Tris-EDTA室温孵育1小时，离心后用1mlPBS洗涤3次，储存用4％蔗糖、0.05％的叠氮钠溶液中。
实施例三
S3、反应膜的制备
将复合物以0.075μl/mm喷涂到Millipore Hi-Flowmylar背衬的硝酸纤维素膜(25mm宽，SHF0900425)上，以45mm/s的等速喷涂形成测试线。同时，将包含0.25mg/mL重组蛋白A的参比试剂与1％蔗糖/0.5％海藻糖/10mM TAPS pH 9.0混合，以45mm/秒在0.075μl/mm下喷涂质控线。然后将膜在56℃下烘烤一周。
实施例四
S4、样品垫制备
S5、染色颗粒标记的样品垫
具体步骤：玻璃纤维膜来源Millipore,用混合的含1％的乙二胺四(丙氧基化-嵌段-乙氧基化物)四醇表面活性剂、0.8％的酪蛋白，和5×Tris-EDTA浸泡，56℃干燥，干燥后，将混合物体积比2.5％的重组蛋白A颗粒，5％的蔗糖、2.5％的海藻糖、5×Tris-EDTA，使用专业喷枪，在高度5-7mm以速度75mm秒喷涂蛋白A颗粒，56℃干燥待用。
实施例五
S6、血液分离膜组装，
S7、试纸条组装
具体步骤：选取Millipore的优质玻璃纤维膜BT100作为样品垫材料，裁切成30×2cm大小备用，选取30×2cm吸水纸，规格为30×6cm的PVC塑料板，粘上双面胶，再将NC膜、样品垫、吸水纸黏贴在PVC板上，每个规格的膜之间的搭接长度不超过0.5mm,便于侧向层析，组装后将其裁切成4mm宽的试纸条，分装与铝箔袋中，4℃储存。
综上所述，本发明提供了一种免疫微球层析快速HIT抗体检测试纸制备方法，该方法应用蛋白A标记的荧光或染色微球作为指示系统，微球的共价结合蛋白A和HIT抗体，以取代常规胶体金定性检测HIT抗体方法，解决了HIT抗体的临床定量检测，提高了现有市场上的胶体金检测的灵敏度、稳定性，准确性，通过POC仪器定量检测HIT抗体的滴度，提示抗体滴度弱、较强、强的梯度变化，使临床检验时操作简便，省时，样本用量少，一般只需要50ul患者样本即可，检测结果清晰准确，可重复性强，检测结果同时达到肉眼和自动化机器准确判读的效果，检测结果易于标准化。同时在进行HIT抗体检测试纸实验时增加了对照质控线，保证实验结果的有效性和质量控制。
本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。