本发明涉及药物分析领域，具体涉及PEG修饰蛋白的PEG结合数检测方法。
背景技术：
：药用蛋白和多肽普遍存在生物稳定性差、体内半衰期短和具免疫原性等缺点，通常采用基因工程改造和化学修饰等手段对其进行改造修饰以克服上述缺点。聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG已经被广泛地应用于蛋白多肽类药物的修饰研究，蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性、改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一。由于蛋白质上可以发生PEG修饰的位点较多，因此，反映PEG对蛋白质修饰程度的平均修饰率或PEG结合数，对该类药物构效关系研究与质量控制具有重要意义。修饰蛋白药物的PEG结合数的检测方法有：三硝基苯磺酸法(TNBS法)、荧光胺法、核磁共振、毛细管电泳(CE)、基质辅助激光扫描系统(MALDI-MS)，傅里叶变换红外光谱(FTIR)、拉曼散射光谱等。根据方法的简单和易操作性，其中三硝基苯磺酸法(TNBS法)和荧光胺法较常用，它们的原理都是通过检测游离氨基数来反推蛋白的PEG结合数。但对于立体结构复杂、分子量庞大，空间位阻较大的PEG，TNBS法和荧光胺法很难结合到包裹在蛋白高级结构内部的游离氨基，从而不能准确分析检测PEG结合数。技术实现要素：为克服上述技术问题，本发明提供可以准确检测聚乙二醇修饰蛋白中PEG结合数的方法。本发明的PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，该方法直接检测PEG修饰蛋白中PEG的量来确定PEG结合数，包括以下步骤：待测样品处理的步骤、对处理后的样品测算游离PEG含量的步骤、根据游离PEG含量推算出PEG修饰蛋白中PEG结合数的步骤。所述的待测样品处理步骤是将PEG修饰蛋白药物中的PEG完全从蛋白药物分子上释放出来。释放出来的PEG可以不带任何多肽或氨基酸，也可以连接有多肽或氨基酸。优选的，所述的待测样品处理步骤是采用了蛋白酶解方法将蛋白药物水解成多肽或氨基酸，所述的蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶，并不限于实施例使用的胰蛋白酶。更优选的，所述的待测样品处理步骤是先用高温破坏PEG修饰蛋白的高级结构，然后用蛋白酶水解蛋白质成多肽或是氨基酸，释放出与蛋白结合的PEG。发明人还尝试了其他方法，如酸碱水解、加热等亦能达到使PEG完全从蛋白分子上释放出来的目的。本发明的样品处理也不限于上述方法，只要是本领域技术人员公知的能够实现将PEG完全从蛋白分子上释放出来的方法都可用于本发明的样品处理。优选的，所述的对处理后的样品测算游离PEG含量的步骤，可以是硫氰铁铵-氯仿两相体系法，中国药典第四部通则3202聚乙二醇残留量测定法，或者是SDS-PAGE电泳法。上述的SDS-PAGE电泳法，是将处理后的样品和PEG对照品梯度溶液，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后染色；使用定量分析系统对染色泳道进行定量测算灰度值；据此确定PEG对照品梯度溶液的浓度与灰度值的标准曲线，并将处理后的样品的染色泳道定量测算灰度值数据代入标准曲线，换算出处理后的样品中游离PEG的含量。优选的，本发明染色方法优选碘染方法，由于钡离子与聚乙二醇分子结合形成可溶性的氧鎓离子复合物，然后该复合物与碘离子结合形成不溶性沉淀而使条带染色。但本发明SDS-PAGE电泳后的染色方法并不局限于此，只要能够使PEG显色的方法都可用于本发明，例如在硫氰酸铁胺显色，还有碘液中加入硼酸显色法等。优选的，本发明采用QuantityOne软件进行染色泳道定量分析处理，但本发明的定量方法不局限于此，其他SDS-PAGE电泳条带定量分析方法均可用于本发明，如凝胶成像仪等等。优选的，本发明的PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，具体步骤如下：供试品溶液的制备：取一定量的已知PEG修饰蛋白含量的供试品溶液，高温处理后，加入胰酶溶液，于水浴酶解，备用。PEG标准品梯度溶液的制备：精密称取与待测样品相同的PEG粉末，加水定溶解，制成含量既定的PEG标准品溶液，混匀，放置。分别取间隔一定数值的不同体积的PEG标准品溶液加入纯化水中配制成终体积相同的梯度浓度溶液，混匀，即得标准品梯度溶液。样品的制备和上样：分别取上述标准品梯度溶液和供试品溶液，进行SDS-PAGE电泳实验，并以碘染色法进行显色后，即可拍照。数据测定与计算：将照片使用QuantityOne4.4.0软件对各染色泳道进行定量测算灰度值；并根据PEG标准品梯度溶液的染色泳道的灰度值对应其相应的浓度，绘制PEG标准品的浓度与灰度值的标准曲线；将供试品溶液的对应染色泳道的灰度值代入标准曲线，计算得到供试品溶液中的所有游离PEG含量。上述的硫氰铁铵-氯仿两相体系法，是将处理后的样品和PEG对照品梯度溶液，加入到硫氰铁铵-氯仿两相体系中；测定氯仿相溶液在510nm波长处的吸光度值；据此确定PEG对照品梯度溶液的浓度与吸光度值的标准曲线，并将处理后的样品的吸光度值代入标准曲线，换算出处理后的样品中游离PEG的含量。上述中国药典第四部通则3202聚乙二醇残留量测定法，是将处理后的样品和PEG对照品梯度溶液中，依次加入髙氯酸溶液、氯化钡溶液和碘溶液；混匀反应一定时间后，在波长535nm处测定吸光度值；据此确定PEG对照品梯度溶液的浓度与吸光度值的标准曲线，并将处理后的样品的吸光度值代入标准曲线，换算出处理后的样品中游离PEG的含量。PEG结合数计算：根据以上结果计算PEG结合数，计算公式如下：本发明方法适用于不同的蛋白类型及不同PEG修饰剂类型，尤其是由立体结构复杂、分子量庞大，空间位阻较大的PEG修饰的蛋白，其用其他现有方法难以准确分析PEG结合数。并且，本发明方法操作简单、重复性好、能准确分析PEG修饰蛋白PEG结合数。附图说明图1比较例3PEG含量-吸光度标准曲线图2实施例1方法检测不同批次PEG定点修饰的门冬酰胺酶PEG结合数，序号1-6为标准梯度溶液，7-9分别为三个不同批次的PEG-ASP双修样品溶液，序号10为空白图3实施例2方法检测不同批次PEG随机修饰门冬酰胺酶的PEG结合数图4实施例3方法检测PEG-ADI的PEG结合数具体实施方式本发明使用的术语解释如下：PEG定点修饰的门冬酰胺酶：制备方法参见专利申请号201410837456.3实施例1制备例1。每个门冬酰胺酶分子上可结合一个、两个或三个聚乙二醇，分别命名为PEG-ASP单修、PEG-ASP双修、PEG-ASP三修。采用的PEG修饰剂为Y-PALD-40K(购自厦门赛诺邦格科技有限公司)：分子量为40KD，是由两个直链的甲氧基聚乙二醇衍生物连接在中心核构成，其化学结构式为：PEG随机修饰的门冬酰胺酶：制备方法参见专利申请号201410837460.X实施例1制备例1。PEG随机修饰门冬酰胺酶的PEG结合数理论值在17-25个之间。采用的PEG修饰剂为M-SPA-5000(购自北京键凯科技有限公司)。PEG定点修饰的精氨酸脱亚胺酶：PEG-ADI，每个精氨酸脱亚胺酶分子上可结合两个聚乙二醇，命名PEG-ADI双修。制备方法：1、修饰反应：将纯化好的ADI蛋白样品浓缩、置换修饰缓冲液(配比：100mM乙酸-乙酸钠，pH5.0)，浓度约为5mg/ml左右；按照ADI:PEG：还原剂摩尔比1:4：600称取PEG，还原剂。修饰反应在4℃下进行，反应时间12-20小时。选用Novel-2-arm-40K(购自厦门赛诺邦格科技有限公司)作为修饰剂，还原剂使用氢基硼氢化钠(购自sigma)；2、修饰样品纯化色谱法条件：流动相A为20mMPB(pH7.2)，流动相B为20mMPB含1MNaCl(pH7.2)。上样：上述修饰反应产物用A液稀释10倍后用双蒸水稀释5倍，10ml/min上样，结合至阴离子交换柱(购自GE公司，QsepharoseHP)；平衡，上样结束后，用A液冲洗3～5个柱体积；洗脱，0-25％B液洗脱，洗脱体积为20个柱体积，收集样品。比较例1：荧光胺法检测PEG定点修饰的门冬酰胺酶的PEG结合数实验步骤：1相关溶液配制1.10.3％荧光胺丙酮溶液配制称取6mg荧光胺溶解于20mL丙酮中，避光保存。1.2反应缓冲液取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液5.3mL，0.2mol/L磷酸氢二钠94.7mL，用水定容至1L，调节pH至8.0，过滤后备用。2BCA法测定蛋白含量2.1工作液的配制根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂(50:1)配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混均后就会消失)。BCA工作液室温24小时内稳定。2.2标准品的稀释取10μLBCA标准品用PBS稀释至100μL(样品一般可用PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/mL。2.3BCA测定法将标准品按0μL、2μL、4μL、6μL、8μL、12μL、16μL、20μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS20μL、18μL、16μL、14μL、12μL、8μL、4μL、0μL。将样品作适当稀释(最好多做几个梯度，入作2倍、4倍、8倍稀释)，加20μL到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置20分钟。用酶标仪测定A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。2.4从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得3氨基修饰度测定3.1未修饰蛋白标准储备液的配制根据BCA法测得的蛋白浓度，用反应缓冲液将未修饰蛋白稀释至100μg/mL，为未修饰蛋白标准储备液。3.2修饰蛋白标准储备液的配制根据BCA法测得的蛋白浓度，用反应缓冲液将修饰蛋白稀释至100μg/mL，为修饰蛋白标准储备液。3.3未修饰蛋白标准曲线测定移取未修饰蛋白标准储备液(100μg/mL)20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl至4mL离心管中，分别用磷酸缓冲液定容至1.5mL，得到未修饰蛋白标准梯度溶液；分别加入0.5mL0.3％荧光胺丙酮溶液，在震荡混合器上剧烈震荡混合，室温放置8分钟后，测定荧光值(激发波长为380nm，发射波长为475nm),得到荧光值与蛋白浓度的标准曲线。3.4供试品标准曲线测定移取修饰后蛋白标准储备液(100μg/mL)20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl至4mL离心管中，同3.3步骤进行测定。3.5计算公式PEG结合数＝[1-(供试品溶液标准曲线斜率/未修饰蛋白标准曲线斜率)]×修饰位点数PEG结合数检测结果如下表1所示：表1上述结果表明PEG结合数目的多少与检测结果之间并无明显的对应关系，且检测所得的PEG结合数远远高于实际的PEG结合数。原因在于所用的PEG修饰剂(Y-PALD-40K)空间位阻比较大，会阻碍游离氨基位点的暴露，故荧光胺法检测会使PEG检测结果偏高。比较例2：采用中国药典第四部通则3202聚乙二醇残留量测定法的原理检测PEG定点修饰的门冬酰胺酶的PEG结合数该方法通过检测样品中的总的PEG含量，从而计算出PEG结合数。实验步骤：1.溶液配制：氯化钡溶液：称取氯化钡5g，加水溶解至l00mL，混匀，即得。0.lmol/L碘溶液：称取碘化钾2.0g,加少量水溶解，然后加碘1.3g，再加水至50mL，摇匀，即得。YPALD-40K溶液：精密称取5mgYPALD-40K粉末，加水定溶解容至50mL，制成每1mL含聚乙二醇100μg的溶液，即为聚乙二醇对照品贮备液，混匀，放置。2.具体过程：取供试品适量，用水稀释，使蛋白质浓度不高于1％，即为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL，加入0.5mol/L髙氯酸溶液5.0mL，混匀，室温放置15分钟，以每分钟4000转离心10分钟。取上清液4mL，加入氯化钡溶液l.0mL和0.lmol/L碘溶液0.5mL，混匀，室温反应15分钟，在波长535nm处测定吸光度；同时以lmL水代替供试品溶液，同法操作，即为空白对照。3.标准曲线的制备：取聚乙二醇对照品贮备液，用水稀释制备成的每lmL含10、20、30、40、50μg的聚乙二醇对照品溶液1.0mL，加人0.5mol/L髙氯酸溶液5.0mL，混匀，自“室温放置15分钟”起，同上法操作。4.计算：以聚乙二醇对照品溶液的浓度(μg/mL)对其相应的吸光度作直线回归，将供试品溶液吸光度代入直线回归方程，计算出供试品溶液中聚乙二醇含量(μg/mL)。PEG结合数检测结果如表2所示：表2PEG结合数ASP+PEGPEG-ASP双修酶解后样品PEG-ASP双修+PEG第一次1.700.840.723.2第二次2.802.132.033.98(备注：ASP+PEG：将ASP与PEG(Y-PALD-40K)的摩尔数按照1:2配制的样品溶液；酶解后样品：处理后的PEG-ASP双修样品，处理方法同实施例1“1、操作过程”中“样品溶液的制备”；PEG-ASP双修+PEG：将PEG-ASP双修样品与PEG(Y-PALD-40K)的摩尔数按照1:2，配制的样品溶液。)由以上结果可知，2次结果的平行性不佳，实际检测结果与理论值存在较大差异。此方法仅适于测定微量聚乙二醇的残留值，若用于测定从蛋白上酶解下来的PEG总量，受限因素较多。比较例3硫氰铁铵-氯仿两相体系法检测PEG定点修饰的门冬酰胺酶的PEG结合数该方法的作用原理是利用PEG的两性作用，被PEG溶剂化的硫氰铁铵在两相中进行分配而进入氯仿层相中，且在510nm波长下吸光度值同PEG的量成正比，从而直接分析检测PEG的含量，直接计算出PEG结合数。PEG定点修饰的门冬酰胺酶PEG结合数检测的具体步骤如下：1、样品的预处理：取已知蛋白含量的PEG定点修饰的门冬酰胺酶溶液100μL样品100℃放置15min后，加入4μL胰酶(购自amresco,货号：0458-250G)，37℃酶解20h，备用。2、硫氰铁铵溶液：称取六水合三氯化铁7.2g，硫氰铵6.88g，加水定容至200mL，备用。3、Y-PALD-40KPEG溶液：精密称取10mgY-PALD-40KPEG粉末，加水定容溶解至4mL，制成每lmL含聚乙二醇2.5mg的溶液，即为聚乙二醇对照品贮备液，混匀，放置，备用。4、取1mL配制的硫氰铁铵溶液和1mL氯仿溶液组成两相体系溶液。5、标准曲线的制备：分别取5μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL的精确配制的Y-PALD-40KPEG溶液(2.5mg/mL)的水溶液，加入到硫氰铁铵-氯仿两相体系中，30℃～37℃振荡2～3h后，离心2min，测定氯仿相溶液在510nm波长处的吸光度值。6、测定样品吸光度值：将预处理后的样品溶液加入到硫氰铁铵-氯仿两相体系中，30℃～37℃振荡2～3h后，离心2min，测定氯仿相溶液在510nm波长处的吸光度值。7、以聚乙二醇对照品溶液的浓度(μg)对其相应的吸光度作直线回归，将供试品溶液吸光度代入直线回归方程，计算出供试品溶液中聚乙二醇含量(μg)，再计算出聚乙二醇结合数。该方法法需要对步骤5、6中的温度、时间等进行摸索，上述“30℃～37℃振荡2～3h后”是经过大量实验确立的最合适的温度与时间。在不控温的情况下，吸光度值的变化如表3所示，PEG含量和吸光度值不呈明显的线性关系。表3PEG(μg)12.52550100150200250吸光度值0.0930.0780.1110.1060.0650.1160.064虽然经过大量实验确立“37℃振荡3h”这个较为适宜的条件，PEG含量和吸光度值也呈明显的线性关系(见表4、图1)，但是对20151101S、20151102S、20151201S三个不同批次PEG-ASP双修样品在不同时间多次检测PEG结合数时数值波动性较大，重复性、准确度较差(见表5)。表4PEG(μg)空白12.52550100150200250吸光度值0.1320.1130.1590.1820.3940.5070.640.749差值---0.0190.0270.050.2620.3750.5080.617表5实施例1PEG释放+SDS-PAGE电泳法检测PEG定点修饰的门冬酰胺酶PEG结合数1、操作过程以下以酶解进行样品处理、SDS-PAGE电泳后碘染、QuantityOne软件定量为例说明PEG释放+SDS-PAGE电泳法检测PEG修饰蛋白PEG结合数完整的操作过程：胰酶溶液的配制：准确称取胰酶粉末2.5g，加入100mLPBS溶解，混匀，避免出现泡沫，损坏蛋白，过滤除菌，即可用，4℃放置。样品溶液的制备：取已知蛋白含量的供试品溶液500μl，高温放置15min后，加入40μL的胰酶溶液，于37℃水浴酶解20h，备用。配制pH8.8的Tris-HCl缓冲液：9.08gTris溶解在40mL纯化水中，用4mol/L盐酸调节pH值8.8，再用纯化水加至50mL，4℃保存。配制pH6.8的Tris-HCl缓冲液：6.06gTris溶解在40mL纯化水中，用4mol/L盐酸调节pH值6.8，再用纯化水加至50mL，4℃保存。10％十二烷基硫酸钠(SDS)：10gSDS，用纯化水溶解并定容至100mL，室温保存。5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：在900mL纯化水中溶解15.1gTris和94g甘氨酸(电泳级)(pH8.0)，然后加入50mL10％SDS(电泳级)或5gSDS，用纯化水补至1000mL。5×非还原的上样缓冲液：量取1MTris-HCL1.25mL(称取1MTris，量取200mL的双蒸水溶解，用HCl调节pH＝6.8，备用)；称取BPB25mg和量取甘油2.5mL置于10mL的塑料离心管中；加去离子水溶解后定容至5mL；将定容好的溶液分装每份500μL，于室温保存。配制SDS-PAGE胶的比例如下：12％SDS-PAGE分离胶的配制：H2O(1.6mL)，30％丙烯酰胺(2.0mL)，1.5MTris-HCl(pH8.0)(1.3mL)，10％SDS(0.05mL)，10％过硫酸铵(0.05mL)TEMED(0.002mL)12％SDS-PAGE浓缩胶的配制：H2O(1.4mL)，30％丙烯酰胺(0.33mL)，1.5MTris-HCl(pH6.8)(0.25mL)，10％SDS(0.2mL)，10％过硫酸铵(0.2mL)TEMED(0.002mL)按每块胶板需要5mL量的分离胶配制，加入胶板模具中，再加入异丙醇填满容器，将分离胶压平整，约需要放置30～60分钟(室温不同，聚合时间不同，需要达到分离胶凝固)；然后，将上层的异丙醇倒掉，每块胶板加入浓缩胶2mL的量，加满后立即插入梳齿，放置一段时间(室温不同，聚合时间不同，需要达到浓缩胶凝固)，即可使用。Y-PALD-40KPEG溶液的配制：精密称取10mgY-PALD-40K粉末，加水定溶解容至4mL，制成每lmL含Y-PALC-40KPEG2.5mg的溶液，即为聚乙二醇贮备液，混匀，放置。标准梯度溶液的配制：分别取5μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL的Y-PALD-40KPEG溶液(2.5mg/mL)加入纯化水中配制成终体积为100μL的梯度溶液，混匀，即得标准梯度溶液。样品的制备和上样：分别取上述标准梯度溶液和供试品溶液100μL，加入5×非还原的上样缓冲液25μL，混匀，离心，上样量均为8μL。加样时间要尽量短，避免样品扩散及边缘效应。电泳过程：按照顺序依次上样，加样完毕，盖好垂直电泳仪的盖子，链接电泳仪电源，打开电泳仪电源开关后初始电压调至80V，时间约30～40min；当进入分离胶的时候将电压调至120V～150V，时间约1.5～2.0h；当溴酚蓝迁移至胶底时，停止跑样，将蛋白胶拿出，按照下述方法进行碘染色法进行显色：10％高氯酸溶液的配制：用量筒量取100mL的高氯酸慢慢加入到900mL水中，混匀，即得。碘染液配制：准确称取BaCl2粉末17.5g、KI粉末6g、I2粉末3.9g溶于500mL的双蒸水中，避光保存。碘染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将胶片做好标记后放在染色盒内，先用10％高氯酸溶液固定10min，用水洗3遍后，再用碘染液覆盖胶片染色，1min左右就能显色，再立即用水脱色3～4遍后，即可拍照。数据处理：将照片导出相机于电脑中，使用QuantityOne4.4.0软件进行定量功能处理。一些参数：如在一定范围内电泳电压、电流的调整、标准梯度溶液的制备、上样量的调整等均对实验的结果无明显的影响。酶解条件如上述胰酶在pH值7.5～8.5，温度为37℃，酶解效力最强，这些特定酶的最佳酶解条件也是本领域技术人员公知的常识。另外SDS-PAGE电泳所采用的胶组分、含量、及其配置方法等也均为常规技术手段，可以根据待检样品分子量确定胶的组分及含量等。2、检测结果：2.1按照“1、操作过程”的方法检测三个不同批次的PEG-ASP双修样品，结果如下见表2：序号1-6Std1-6为标准梯度溶液，7-9U1-U3分别为三个不同批次的PEG-ASP双修样品溶液，序号10B1为空白。根据以上结果计算PEG结合数，计算公式如下：(备注：PEG摩尔数＝PEG质量/PEG分子量(40KD)；蛋白摩尔数＝蛋白浓度×样品体积(0.1mL)/蛋白分子(136KD)；将上述数据带入计算即得出系数34)表6上述结果表明，采用本发明方法测得的PEG结合数与理论值符合，且批间精密度较好。2.2按照“1、操作过程”的方法检测20150902S批次的PEG-ASP双修样品不同上样量时PEG结合数，结果如下：表7根据以上结果计算结合数：表8(备注：20150902S浓度为1.8mg/mL)该结果表明上样量的调整对实验结果基本无影响。2.3：为了验证方法的重复性和准确性，按照“1、操作过程”的方法检测20150902S批次的PEG-ASP双修样品PEG结合数，重复检测4次，结果如下表：表9表10上述结果表明，采用本发明方法检测PEG修饰蛋白药物的PEG结合数重复性和准确度均较好。实施例2PEG释放+SDS-PAGE电泳法检测PEG随机修饰门冬酰胺酶的PEG平均结合数检测方法均参照实施例1“1、操作过程”，但是在酶解时间上适当延长，至少水浴酶解48h，以保证样品中的PEG必须完全释放，其PEG结合数检测结果见图3、表11、表12：(备注：PEG摩尔数＝PEG质量/PEG分子量(5KD)；蛋白摩尔数＝蛋白浓度×样品体积(0.1mL)/蛋白分子(136KD)；将上述数据带入计算即得出系数272)表11表12PEG随机修饰门冬酰胺酶PEG结合数理论值在17-25个之间，以上结果证明PEG随机修饰门冬酰胺酶的PEG结合数可以使用本方法进行检测。并且同时说明本发明方法不局限于具体的PEG修饰剂类型。实施例3PEG释放+SDS-PAGE电泳法检测PEG-ADI的PEG结合数标准溶液的配置：Novel-2-arm-40KPEG溶液的配制：精密称取10mgNovel-2-arm-40K粉末，加水定溶解容至4mL，制成每lmL含Novel-2-arm-40KPEG2.5mg的溶液，即为聚乙二醇贮备液，混匀，放置。标准梯度溶液的配制：分别取2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、15μL的Novel-2-arm-40KPEG标准溶液(2.5mg/mL)加入纯化水中配制成终体积为100μL的梯度溶液，混匀，即得标准梯度溶液。样品的制备和上样：分别取上述标准梯度溶液和供试品溶液100μL，加入5×非还原的上样缓冲液25μL，混匀，离心，上样量均为8μL。加样时间要尽量短，避免样品扩散及边缘效应。除以上步骤外，其余步骤参数均参照实施例1“1、操作过程”：PEG结合数检测结果如图4、表13、表14：表13根据以上结果计算PEG结合数，计算公式如下：(备注：PEG摩尔数＝PEG质量/PEG分子量(40KD)；蛋白摩尔数＝蛋白浓度×样品体积(0.1mL)/蛋白分子(96KD)；将上述数据带入计算即得出系数24)表14上述结果表明PEG修饰ADI样品PEG结合数可以使用本发明的方法进行检测，证明本发明方法不局限于门冬酰胺酶这类原蛋白，亦不局限于具体的PEG修饰剂类型。当前第1页1 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