一种鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法与流程

本发明属于昆虫种群区分领域，用于室内和田间辅助鉴定二化螟不同寄主种群的新方法。

背景技术：

昆虫的触角和口器上集中分布的各类感器(刺形、锥形、栓锥形、板形等)是对各种外界刺激产生反应的构造，与神经系统一起调控昆虫的行为。感器与昆虫生理行为紧密联系，在判别食物、寄主选择、求偶等行为中发挥着非常重要的作用。不同种类昆虫的感器类型、数目、分布和功能不尽相同,这为超微形态分类提供了新思路。昆虫感器在属级及以上阶元差异比较明显，在部分昆虫的不同发育阶段、雌雄性、不同生态型等之间也存在差异。

二化螟chilosuppressaliswalker俗称钻心虫，隶属鳞翅目(lepidoptera)草螟科(crambidae)，是水稻、茭白上重要的钻蛀性害虫。该种害虫以4-6龄幼虫在稻蔸滞育越冬，平均每年发生2-4代。二化螟幼虫在水稻苗期为害造成枯鞘、枯心，孕穗期和穗期为害造成枯孕穗、白穗和虫伤株等症状，严重影响水稻的产量和质量。作为二化螟的重要寄主，茭白和水稻同属禾本科作物，所需生态环境十分接近，且在生物学和形态学上也有不少相似地方。近年来，随着农业产业结构的调整和经济效益的刺激，茭白种植面积逐年扩大，许多稻区出现水稻、茭白插花种植，这种种植模式导致二化螟的发生为害更加复杂化，使二化螟逐渐分化为两个不同的寄主种群，即茭白种群和水稻种群。

有关二化螟两种群形态差异涉及7篇文献：其一，proceedingsofkyushuplantprotectionsociety,1969，15(3):121–122页，二化螟发生预测：取食茭白的二化螟幼虫的生长发育研究，abey、miyaharak提到茭白二化螟的成虫个体显著大于水稻二化螟。其二，bulletinofibarakiagricultureexperimentalstation,1970，11(2):53–56页，灯诱捕获的二化螟成虫头壳宽度差异研究，takaia提到收集自茭白的二化螟幼虫、成虫个体大于收集自水稻的二化螟个体。其三，中国水稻科学，2002，16(3):257–260页，水稻和茭白二化螟蛹形态特征的数值分析，辛文、张志涛、赖凤香提到水稻二化螟、茭白二化螟蛹形态的几个指标存在差异，但其不能截然分开。其四，生态学报，2002，22(3):341–345页，水稻田和茭白田二化螟的比较研究，俞晓平、徐红星、吕仲贤、陈建明、郑许松、陶林勇，提到茭白田和水稻田二化螟越冬代成虫、蛹存在明显的个体差异，茭白田二化螟的蛹重、成虫前翅长度均显著大于水稻田二化螟。其五，浙江农业学报,2003，15(3):139–143页，二化螟取食茭白和水稻后生物学特征表现的比较，陈建明、俞晓平、郑许松、徐红星、吕仲贤、张珏锋提到取食茭白的二化螟蛹和成虫显著大于取食水稻的个体。其六，appliedentomologyandzoology，2006，41(3):29–535页，二化螟水稻和茭白种群形态学差异研究，matsukurak、hoshizakis、ishikaway、tatsukis提到二化螟两个种群的外生殖器特征存在差异。其七，appliedentomologyandzoology，2013，48(2):147–153页，水稻田和茭白田二化螟越冬幼虫生物学比较，dingn、dakubp、zhuq、maw、zhuf、wangx提到茭白田二化螟幼虫的平均体重、蛹重显著大于水稻田二化螟的重量。

然而，以上研究中还存在诸多问题。目前，仍缺乏对二化螟两寄主种群快速准确的鉴定方法。因寄主植物自身的差异，所以二化螟水稻种群和茭白种群个体大小并不能作为种群的可靠鉴定标准。同时，以上技术需要通过大样本量、长期观察鉴定种群，所以难于广泛应用。此外，以上技术中二化螟不同种群的鉴定工作繁冗复杂，不仅耗费大量时间，而且在检测过程中出现的诸多外界不确定性因素容易造成一定的无法排除的实验误差。因此，亟需解决二化螟不同寄主种群鉴定过程中出现的问题，以便进行田间针对性地进行害虫的有效防治。

技术实现要素：

为解决二化螟种群鉴定的问题、提高田间防治的高效性，申请人发明一种利用触角、口器上的感器快速、简便、高效辅助鉴定二化螟不同寄主种群的新方法。利用该方法申请人已经成功地实现辅助鉴定二化螟水稻种群和茭白种群，极大地减少了人工投入，提高了鉴定二化螟不同寄主种群的效率。

本发明目的是，针对上述存在缺点，提供一种低成本、快速、简便、高效辅助鉴定二化螟不同种群的新方法。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法，所述方法包括以下步骤：

取待鉴别二化螟幼虫，切取头部，经前期处理后用扫描电子显微镜观察、拍照，统计头部触角和口器上的各类感器数目和长度，按照以下规则鉴定二化螟的种群：

(1)茭白种群触角鞭节具1个栓锥感器和2个锥形感器，水稻种群触角鞭节具1个栓锥感器和1个锥形感器；茭白种群下颚须具5个锥形感器和3个柱形感器，而水稻种群下颚须具4个锥形感器和4个柱形感器。

所述栓锥感器较为粗大，基部隆起，隆起部分的顶端有小腔，腔内有1个锥状突起；隆起部分与锥形突起长度不同，基部隆起部分的半径大于锥形突起的半径；

所述锥形感器形似三角锥状，底端较粗，底端到顶端半径逐渐缩小，但较短粗，顶端为较钝的尖头状，着生于臼状窝内；

所述柱形感器形似圆柱状，底端较粗，底端到顶端半径一致，顶端为圆头状；

刺形感器形似细长尖刺状，底端较细，顶端为尖刺。

所述触角鞭节是指触角的第三节，一般即为最顶端的一节。触角的梗节是触角的第二节,鞭节位于梗节之上。

进一步，所述二化螟的种群鉴定规则还包括：(2)茭白种群下颚须的锥形感器的长度显著长于水稻种群的下颚须的锥形感器的长度。

另外，一般来说，比较感器长度的时候是以同龄期幼虫来进行比较，一个优选的鉴定规则是：茭白种群下颚须的锥形感器的长度显著长于同龄期的水稻种群的下颚须的锥形感器的长度。

本申请在统计感器长度时，将下颚须的不同锥形感器进行了编号，下颚须的锥形感器的数目编号规则如下：以与指形感器距离最近的锥形感器为第一锥形感器，记为b1，然后沿远离指形感器的方向顺时针或逆时针依次编号。

在进行数据统计时，主要以同龄期同编号位置的下颚须锥形感器的长度来进行比较，一个优选的鉴定规则是：茭白种群下颚须的锥形感器的长度显著长于同龄期同编号位置的水稻种群的下颚须的锥形感器的长度

所述指形感器是较为宽大，形似拇指，紧密贴附于下颚须的感器，茭白种群和水稻种群的下颚须各具一指形感器

由于茭白种群下颚须具5个锥形感器，水稻种群下颚须具4个锥形感器，另一个较为简便的鉴定方法是:茭白种群下颚须的锥形感器的长度之和显著长于水稻种群的下颚须的锥形感器的长度之和。

进一步，所述二化螟的种群鉴定规则还包括：(3)茭白种群1-3龄幼虫下颚须第二柱形感器的长度(记为cs2)显著短于同龄期的水稻种群的第二柱形感器。所述第二柱形感器是与下颚须指形感器距离最近的柱形感器。

进一步，所述前期处理包括固定、乙醇逐级脱水、置换、冷冻干燥、喷金，均为扫描电子显微镜(sem)的生物样品预处理常规手段。

本发明的有益效果是：

(1)上述辅助鉴定二化螟化不同寄主种群的方法较为可靠、简便，操作简单，节省时间。感器特征因较为稳定，近年来已被广泛应用于不同阶元的分类。本发明可在较短时间内通过简单的触角口器的感器数量统计即可鉴定区别二化螟的不同种群，方法简单快速可靠。

(2)因触角感器骨化程度很高，感器构造保守，所以不易变形，因而避免了实验过程中人工假象的产生，实验结果可靠。

(3)取样时间、地点灵活。在各个龄期的取好保存在戊二醛固定液后，可统一进行后续制样和电镜观察，不影响实验结果。

附图说明

图1为水稻二化螟触角梗节、鞭节扫描电镜图，图中，c1–c2为刺形感器；b1–b4为锥形感器；st为栓锥感器，其中c1、c2、b1、b2、b3位于梗节处，st和b4位于鞭节处。

图2为水稻二化螟口器下颚须扫描电镜图，图中，b1–b4为锥形感器；cs1–cs4为柱形感器；d为指形感器。

图3为茭白二化螟触角梗节、鞭节扫描电镜图，图中，c1–c2为刺形感器；b1–b5为锥形感器；st为栓锥感器，其中c1、c2、b1、b2、b3位于梗节处，st和b4、b5位于鞭节处。

图4为茭白二化螟口器下颚须扫描电镜图，图中，b1–b5为锥形感器；cs1–cs3为柱形感器；d为指形感器，指形感器较为宽大，形似拇指，紧密贴附于下颚须。

具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

试验时间：2015年7月15日至2016年7月31日

试验地点：浙江省杭州市，浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所植保工程实验室。

试验虫数：300头。

试验结果：利用此方法辅助鉴定二化螟茭白种群和水稻种群。

二化螟水稻、茭白种群幼虫采集、样品处理及观察按以下方法进行：

2015年5月从浙江省水稻主产区(余姚市三七镇)、茭白主产区(缙云县新建镇)分别采集二化螟越冬幼虫，带回实验室饲养。室内以空调控制温度为28±1℃，光周期为16h光照、8h黑暗(用定时器控制)，相对湿度90％左右。选取1至6龄健康幼虫为试验材料。

在nikonsmz1500型光学解剖镜下用镊子和刀片切下二化螟幼虫头部，并放入2.5％戊二醛(0.1m酸缓冲液，ph7.2)固定，用0.1m磷酸缓冲液(ph7.2)漂洗数次，用不同浓度的乙醇(30％，50％，70％，80％，90％，100％)进行逐级脱水。然后用无水乙醇和叔丁醇分别以一定比例混合置换酒精15分钟。用纯叔丁醇置换30–40分钟，将样品放入滴有纯叔丁醇的样品仓中冷冻干燥约3h。干燥后的样品利用双面导电胶粘到样品台上，置入真空喷涂仪内进行喷金，在s-3400n型电子显微镜(加速电压5-15kv)下观察并拍照。各龄幼虫各类感器均观察15～20个重复。

经统计鞭节和下颚须感器数量和长度，感器照片如图1～4所示，数目和长度统计如表1～6所示，发现茭白种群和水稻种群的显著区别如下：

图1、3所示，茭白种群触角鞭节具1个栓锥感器(st和2个锥形感器(b4,b5)，水稻种群的触角鞭节则具1个栓锥感器(st)和1个锥形感器(b4)；茭白种群下颚须具5个锥形感器(b1-b5)和3个柱形感器(cs1-cs3)，而水稻种群具4个锥形感器(b1-b4)和4个柱形感器(cs1-cs4)(图2、4)。

两种群的感器长度也存在显著(或极显著)差异。

茭白种群下颚须的锥形感器的长度显著长于同龄期的水稻种群的下颚须的锥形感器的长度。

下颚须的锥形感器的数目编号规则如下：以与指形感器距离最近的锥形感器为第一锥形感器，记为b1，然后沿远离指形感器的方向顺时针或逆时针依次编号。

因此，茭白种群下颚须的锥形感器的长度显著长于同龄期同编号位置的水稻种群的下颚须的锥形感器的长度

所述指形感器是较为宽大，形似拇指，紧密贴附于下颚须的感器，茭白种群和水稻种群的下颚须各具一指形感器

由于茭白种群下颚须具5个锥形感器，水稻种群下颚须具4个锥形感器，另一个较为简便的鉴定方法是:茭白种群下颚须的锥形感器的长度之和显著长于水稻种群的下颚须的锥形感器的长度之和。

进一步，茭白种群1-3龄幼虫下颚须柱形感器(cs2)显著短于同龄期的水稻种群的相应感器。所述cs2是与下颚须指形感器距离最近的柱形感器。

表1二化螟茭白、水稻种群的感器数目比较

表2二化螟茭白、水稻种群1-3龄幼虫口器上的感器长度比较

注：测值按平均数±标准差的形式表现；同一龄期同一行不同小写字母和大写字母分别表示两个种群在p＝0.05和p＝0.01水平上差异显著。

表3二化螟茭白、水稻种群4-6龄幼虫触角和口器上的感器长度比较

注：测值按平均数±标准差的形式表现；同一龄期同一行不同小写字母和大写字母分别表示两个种群在p＝0.05和p＝0.01水平上差异显著。

表4二化螟茭白、水稻种群1-6龄幼虫口器上的感器比较

注：测值按平均数±标准差的形式表现；同一龄期同一行不同小写字母和大写字母分别表示两个种群在p＝0.05和p＝0.01水平上差异显著。

茭白种群部分龄期幼虫的部分刺形感器(分布于梗节、轴节、茎节)、锥形感器(分布于梗节、下颚须、外颚叶)、栓锥感器(分布于鞭节、外颚叶)显著长于水稻种群的相应感器。茭白种群(1-5龄)的部分柱形感器(分布于下颚须)、3-5龄幼虫部分刺形感器(分布于外颚叶)显著短于水稻种群的相应感器(表2～6)。茭白种群1-3龄幼虫下颚须第二柱形感器的长度(cs2)显著短于水稻种群的第二柱形感器。所述第二柱形感器是最靠近下颚须指形感器的柱形感器，所述指形感器是较为宽大，形似拇指，紧密贴附于下颚须的感器，茭白种群和水稻种群的下颚须各具一指形感器。

表5二化螟茭白、水稻种群1-3龄幼虫触角和口器感器比较

注：测值按平均数±标准差的形式表现；同一龄期同一行不同小写字母和大写字母分别表示两个种群在p＝0.05和p＝0.01水平上差异显著。b1-b5,锥形感器；c1-c2,刺形感器；cs1-cs4,柱形感器；st,st1-st2,栓锥感器.

表6二化螟茭白、水稻种群4-6龄幼虫触角和口器感器比较

注：测值按平均数±标准差的形式表现；同一龄期同一行不同小写字母和大写字母分别表示两个种群在p＝0.05和p＝0.01水平上差异显著。b1-b5,锥形感器；c1-c2,刺形感器；cs1-cs4,柱形感器；st,st1-st2,栓锥感器。