一种基于DTNB标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素超灵敏检测方法与流程

本发明涉及到方法适用于食品安全、环境监测等技术领域，尤其涉及到一种基于dtnb标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素超灵敏检测方法。

背景技术：

真菌毒素是玉米、花生等谷物食品中常见的微生物毒素，是真菌在食品或饲料里生长所产生的有毒次级代谢产物，具有潜在的致肝癌、胃癌、肾癌、肠癌的可能性。目前常规的用于真菌毒素的检测方法，主要有生物鉴定法，但此方法只能用于定性检测，专一性不强，灵敏度低；化学分析法(薄层层析法)，精密度差，难以在实际中应用；仪器法(气相色谱法、液相色谱法、气质联用法、液质联用法)，但前处理复杂，仪器昂贵；免疫分析法(酶联免疫吸附法，免疫荧光技术，放射免疫测定法等)，但此方法存在一定的假阳性。所以急需建立一种灵敏度高、稳定性强、操作简单的真菌毒素定量检测方法。

当一束光入射到一个物体时，会产生入射光、透射光和反射光，反射光又分为弹性散射和非弹性散射，其中频率发生改变的非弹性散射即为拉曼散射，而表面增强拉曼散射是拉曼散射的延伸和发展。能够产生表面增强拉曼光谱效应的有单金属增强基底金、银、铜和一些过渡金属，其中以金和银的增强效果最为显著，近年来一些课题组将单金属与二氧化硅、四氧化三铁、石墨烯等组装在一起，组成具有特定化学特性和拉曼特性的核壳形增强基底。表面增强拉曼效应的强弱与增强基底的种类、形貌和结构都有很大的关系。因此，构建形状、尺寸合适的增强基底和检测体系对实现真菌毒素的快速、灵敏检测非常重要。

与单金属增强基底相比，核壳形的双金属增强基底表面增强拉曼光谱效应更显著。金纳米棒和其它形貌的金纳米颗粒相比具有更好的等离子增强效应，银具有最好的等离子增强效应，作为金纳米棒的外壳，显著提高纳米棒的拉曼增强效果。dtnb作为一种没有荧光干扰和具有大散射截面的分子，作为拉曼信号分子标记于金银纳米棒壳层中间，能显著提高拉曼信号的稳定性。适配体的特异性和磁性材料的分离聚集作用可以拉近增强基底和待测物距离，提高拉曼信号。因此本专利制备了真菌毒素适配体互补链修饰的dtnb标记的金@dtnb@银核壳纳米棒和真菌毒素适配体修饰的壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁珠，构建了三明治结构的检测体系，大大提高了拉曼信号的强度和稳定性，成功应用于真菌毒素的超灵敏定量检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于dtnb标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素超灵敏检测方法，该方法对真菌毒素的检测稳定性好，灵敏度高。

为了实现上述目的，本发明的技术方案包括：真菌毒素适配体互补链修饰的金@dtnb@银核壳纳米棒的制备，真菌毒素适配体修饰的壳聚糖四氧化三铁的磁珠的制备，真菌毒素表面增强拉曼光谱检测体系的构建及标准曲线的建立；该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。

上述的一种基于dtnb标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素超灵敏检测方法，在合成的金纳米棒@dtnb外包覆银壳层，通过优化加入硝酸银的量，最终根据金@dtnb@银核壳纳米棒的拉曼信号的强度确定最佳的硝酸银加入量，当每6ml金纳米棒的ctab溶液中加入30μl，10mm的硝酸银时获得最强的拉曼信号。

上述的一种基于dtnb标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素超灵敏检测方法，所述标记分子为dtnb，将具有大散射截面的拉曼信号分子dtnb标记于金银壳层之间，dtnb具有明显的拉曼信号峰且没有荧光干扰，在银壳层的保护下，避免了外界环境的干扰，拉曼信号更加稳定。

上述的一种基于dtnb标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素超灵敏检测方法，所述磁性材料为壳聚糖四氧化三铁磁珠，采用一步法合成壳聚糖四氧化三铁，因壳聚糖所带的氨基基团，避免了磁性材料复杂的表面修饰，使适配体的连接更加简单。

上述的一种基于dtnb标记的金@银核壳纳米棒的真菌毒素超灵敏检测方法，该方法包括如下具体步骤：

步骤1)金@dtnb@银核壳纳米棒的制备：首先采用金种子生长法合成金纳米棒，离心浓缩2倍去除过量的ctab，重新分散在去离子水中，每10ml金纳米棒溶液加入10μl，10mm的dtnb乙醇溶液，室温下磁力搅拌2h，离心去除未连接的dtnb，重新分散到相同体积的去离子水中；2ml上述合成的金@dtnb纳米棒强烈搅拌下加入4ml，0.04mm的ctab溶液中，混和均匀后依次加入150ml，0.1m的抗坏血酸，不同体积的10mm的硝酸银，250ml，0.1m的氢氧化钠，混合均匀。

步骤2)真菌毒素适配体互补链修饰的金@dtnb@银核壳纳米棒的制备：上述合成的金@dtnb@银核壳纳米棒，离心清洗两次，最终分散到2ml，ph＝7.4的pbs缓冲溶液中。用磷酸三氯乙酯(tcep)的tris-hcl溶液活化巯基修饰的真菌毒素适配体互补链上的巯基，将上述活化的适配体加入金@dtnb@银核壳纳米棒溶液中，室温下孵育12h，加入牛血清蛋白(bsa)溶液，封闭纳米棒上未被适配体连接的活性位点，最后离心分离，重新分散到相同体积的pbs缓冲溶液中，待用。

步骤3)壳聚糖四氧化三铁磁珠的制备：0.82g三氯化铁强烈搅拌下溶于40ml乙二醇中直至溶液变澄清，3.6g无水醋酸钠和0.5g壳聚糖，在连续搅拌条件下加入上述溶液，搅拌持续30min，反应结束后溶液转移到50ml聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，发应釜放在200℃恒温箱里反应12h，反应结束，冷却到室温，磁分离，乙醇清洗三次，60℃恒温箱干燥5h，产物密封放在4℃冰箱备用。

步骤4)真菌毒素适配体修饰的壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁珠的制备：2mg上述合成的壳聚糖四氧化三铁磁性材料超声分散在1ml，5％的戊二醛溶液中，1ml，5μm的氨基修饰的真菌毒素适配体链的pbs溶液加入上述混合溶液，室温孵育4h，加入牛血清蛋白(bsa)溶液封闭磁性材料上未连接的活性位点，上述溶液用2ml水和2ml，tris-hcl缓冲溶液清洗，最终分散在2ml，tris-hcl缓冲溶液中，备用。

步骤5)表面增强拉曼检测体系的构建及标准曲线的建立。将上述合成的真菌毒素适配体互补链修饰的金@dtnb@银核壳纳米棒溶液200μl，与壳聚糖四氧化三铁溶液100ul混合，室温下孵育6h，磁分离去除上清液，沉淀重新分散到100ul的tris-hcl缓冲溶液中，构建真菌毒素检测的拉曼检测体系。在上述构建的体系中加入100μl不同浓度的真菌毒素(0.0,0.001,0.01,0.1,1.0,10.0,100,1000ng/ml)，室温下孵育1h，相应的壳聚糖四氧化三铁磁珠的真菌毒素核酸适配体和目标分子识别，使原来与磁性材料连接的真菌毒素适配体互补链修饰的金@dtnb@银核壳纳米棒从磁性纳米粒子表面脱落，通过磁分离，去除脱落的真菌毒素适配体互补链修饰的金@dtnb@银核壳纳米棒，将沉淀重悬浮在100μl的tris-hcl缓冲溶液中，采用拉曼光谱仪进行扫描表征。此时组装体的拉曼信号改变，从而建立组装体系拉曼信号强度和对应真菌毒素浓度间的标准曲线。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明制备的金@dtnb@银核壳纳米棒，通过优化加入硝酸银的量，最终根据金@dtnb@银核壳纳米棒的拉曼信号的强度确定最佳的硝酸银加入量为每6ml金纳米棒的ctab溶液中加入30μl，10mm的硝酸银，制备的加入不同硝酸银量的金@dtnb@银核壳纳米棒增强基底，通过紫外荧光光谱和表面增强拉曼光谱进行表征。

2.本发明制备的dtnb标记的金@银核壳纳米棒增强基底，其标记分子为dtnb，具有大散射截面和明显的拉曼信号峰且没有荧光干扰，在银壳层的保护下，避免了外界环境的干扰，拉曼信号更加稳定。

3.本发明制备的磁性材料为壳聚糖包覆的四氧化三铁磁珠，采用一步法合成壳聚糖包覆的四氧化三铁磁性材料，因壳聚糖所带的氨基基团，制备的磁性材料表面含有大量氨基基团，避免了磁性材料表面复杂的修饰过程，使适配体的连接更加简单。

4.本发明制备的的检测方法用于食品中各种真菌毒素的检测，其检测灵敏度高，检测速度快，检测范围广，在食品安全、环境监测等技术领域广泛应用。

【附图说明】

图1为金纳米棒(a)，金@dtnb@银核壳纳米棒(b)和壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁性材料(c、d)透射电镜表征图；

图2为优化硝酸银加入量的紫外图(a)和对应加入量下的表面增强拉曼图谱(b)；

图3为本发明实施例中黄曲霉毒素b1标准曲线检测的拉曼光图谱；

图4为本发明实施例中黄曲霉毒素b1浓度与拉曼强度的关系图(a)和标准曲线(b)。

具体实施方式

实施实例1

为了进一步验证本发明所制备的检测方法对食品中真菌毒素的检测作用，本发明实例，以黄曲霉毒素b1(afb1)为例，具体操作步骤如下：

步骤1)金@dtnb@银核壳纳米棒的制备：首先采用金种子生长法合成金纳米棒，离心浓缩2倍去除过量的ctab，重新分散在去离子水中，每10ml金纳米棒溶液加入10μl，10mm的dtnb乙醇溶液，室温下磁力搅拌2h，离心去除未连接的dtnb，重新分散到相同体积的去离子水中；2ml上述合成的金@dtnb纳米棒强烈搅拌下加入4ml，0.04mm的ctab溶液中，混和均匀后依次加入150ml，0.1m的抗坏血酸，不同体积的10mm的硝酸银，250ml，0.1m的氢氧化钠，混合均匀。图1为金纳米棒(a)，金@dtnb@银核壳纳米棒(b)的透射电镜表征图；图2为优化硝酸银加入量的紫外图(a)和对应加入量下的表面增强拉曼图谱(b)；

步骤2)afb1适配体互补链修饰的金@dtnb@银核壳纳米棒的制备：将上述步骤1)合成的金@dtnb@银核壳纳米棒，离心清洗两次，最终分散到2ml，ph＝7.4的pbs缓冲溶液中。用磷酸三氯乙酯(tcep)的tris-hcl溶液活化巯基修饰的afb1适配体互补链上的巯基，将上述活化的适配体加入金@dtnb@银核壳纳米棒溶液中，室温下孵育12h，加入牛血清蛋白(bsa)溶液，封闭纳米棒上未被适配体连接的活性位点，最后离心分离，重新分散到相同体积的pbs缓冲溶液中，待用。

巯基修饰的afb1适配体互补链：5’-sh-gggcctagcgaa-3’；

步骤3)cs-fe3o4磁珠的制备：0.82g三氯化铁强烈搅拌下溶于40ml乙二醇中直至溶液变澄清，3.6g无水醋酸钠和0.5g壳聚糖，在连续搅拌条件下加入上述溶液，搅拌持续30min，反应结束后溶液转移到50ml聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，发应釜放在200℃恒温箱里反应12h，反应结束，冷却到室温，磁分离，乙醇清洗三次，60℃恒温箱干燥5h，产物密封放在4℃冰箱备用。图1为壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁性材料(c、d)的透射电镜表征图。

步骤4)afb1适配体修饰的壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁珠的制备：2mg上述合成的cs-fe3o4磁性材料超声分散在1ml，5％的戊二醛溶液中，1ml，5μm的氨基修饰的afb1适配体链的pbs溶液加入上述混合溶液，室温孵育4h，加入牛血清蛋白(bsa)溶液封闭磁性材料上未连接的活性位点，上述溶液用2ml水和2ml，tris-hcl缓冲溶液清洗，最终分散在2ml，tris-hcl缓冲溶液中，备用。

氨基修饰的afb1适配体链：5’-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggccc-nh2-3’；

步骤5)表面增强拉曼检测体系的构建及标准曲线的建立。将上述合成的afb1适配体互补链修饰的金@dtnb@银核壳纳米棒溶液200μl，与壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)溶液100μl混合，室温下孵育6h，磁分离去除上清液，沉淀重新分散到100μl的tris-hcl缓冲溶液中，构建成afb1检测的拉曼传感体系。在上述构建的体系中加入100μl不同浓度的afb1(0.0,0.001,0.01,0.1,1.0,10.0,100,1000ng/ml)，室温下孵育1h，相应的壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁性材料表面的afb1核酸适配体和目标分子识别，使原来与磁性材料连接的真菌毒素适配体互补链修饰的金@dtnb@银核壳纳米棒从磁性纳米粒子表面脱落，通过磁分离，去除脱落的真菌毒素适配体互补链修饰的金@dtnb@银核壳纳米棒，将沉淀重悬浮在100μl的tris-hcl缓冲溶液中，采用拉曼光谱仪进行扫描表征。此时组装体的拉曼信号改变，从而建立组装体系拉曼信号强度和对应afb1浓度间的标准曲线，如图3为对应黄曲霉毒素b1标准曲线检测的拉曼光图谱(a)和标准曲线(b)。

综上，制备的食品中真菌毒素检测方法，通过标记dtnb信号分子于金@银核壳纳米棒壳层中间，增强拉曼信号强度和稳定性，利用金银纳米棒的强拉曼增强效果，以及适配体的特异性识别作用，磁性材料的分离富集作用，构建了真菌毒素定量检测的表面增强拉曼检测体系，实现了真菌毒素的定量检测的超灵敏检测；该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

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