一种SPR传感芯片、制备方法及其应用与流程

本发明属于光学生物传感领域，具体涉及一种spr传感芯片、制备方法及其应用。

背景技术：

目前市场上生物分子相互作用系统biocore系列的spr芯片只有ge公司可以买到，价格昂贵，cm5芯片约2000元/片。此外，目前有关制备spr芯片的研究几乎都是用50nm金作为金属膜(光学传感膜)，由于金的附着能力差，通常采用2-4nm铬作为过渡金属连接层。因此，制备spr芯片的成本高，国产化产品进度缓慢。

技术实现要素：

针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种成本低、性能好、制备方法简便的spr传感芯片。

为了达到以上目的，本发明的技术方案如下：

一种spr传感芯片，包括衬底材料，衬底材料表面向外依次为过渡金属连接层、金属膜和有机基质层；所述的过渡金属连接层的材料为钛，所述的金属膜为银。

优选的，所述的衬底材料为bk7玻璃。

优选的，所述的有机质层为羧甲基化葡聚糖。

优选的，所述钛层厚度为2～4nm；所述银膜厚度为50nm。

优选的，所述spr传感芯片的制备方法，步骤如下：

(1)镀膜

a.将bk7玻璃的上下表面抛光，超声清洗后用氮气吹干，放入镀膜真空室中；

b.先在bk7玻璃表面镀一层钛，然后再蒸镀银膜；

(2)镀膜后芯片表面基质修饰。

a.将镀银芯片取出后用去离子水洗净，氮气吹干，得到表面洁净的镀银芯片；

b.然后浸入十一琉基十一烷醇的乙醇溶液中，45℃孵育1h，取出后依次用80％乙醇、去离子水清洗，氮气吹干；

c.再将芯片浸入环氧氯丙烷溶液中，30℃孵育5h，取出后用去离子水冲洗，依次用80％乙醇、去离子水、0.1mnaoh冲洗；

d.将naoh冲洗后的芯片放入葡聚糖溶液中，30℃振荡孵育24h，取出后用50℃去离子水洗净，氮气吹干；

e.将上述芯片加入1m溴乙酸溶液中，30℃振荡孵育24h，取出后用去离子水洗净，氮气吹干；

(3)装片

将修饰完成的芯片对着光线通过边缘折射率的不同分辨正反面，将有银膜的一面用紫外胶粘贴固定于芯片塑料架上，即得到spr传感芯片。

优选的，所述钛层厚度为2～4nm；所述银膜厚度为50nm。

优选的，所述环氧氯丙烷溶液是由体积比为1：1的0.4mnaoh和二甘醇二甲醚溶液配制而成；所述葡聚糖溶液是由0.1mnaoh溶液配制而成，浓度为0.3g/ml。

优选的，所述的spr传感芯片应用于生物分子相互作用仪。

优选的，所述生物分子相互作用仪的型号为biacore4000，biacorea100，biacoret200，biacoret100，biacores51和biacores200。

一种检测生物分子间相互作用的方法：使用上述spr传感芯片，在其表面偶联目标抗体，通过抗原与抗体之间的相互作用，检测分子间的相互作用。

优选的，所述spr传感芯片表面可以偶联带有氨基、羧基、羟基、巯基或醛基的抗体分子。

本发明的有益效果是：本发明的spr传感芯片采用新的镀膜策略：2～4nm钛+50nm银；以银作为spr传感芯片的金属膜，其价格比金便宜，利于降低芯片成本，成本仅为ge芯片价格的10％；采用钛作为过渡金属连接层，其连接性能优于铬；此外，本发明的spr传感芯片，氮气包装后，存于4℃，两个月内使用芯片性能完好；使用本发明的spr传感芯片对分子进行动力学分析和亲和力测定时，数据拟合较好，结果可靠。

附图说明

图1spr传感芯片的镀膜策略示意图，其中1为有机基质层，2为50nm银，3为2-4nm钛，4为bk7玻璃；

图2spr传感芯片镀膜后原子力显微镜观察结果；

图3镀膜后薄膜的原子力显微镜3d立体形貌图像；

图4镀膜后薄膜的线扫描高低起伏图像；

图5spr传感芯片偶联bsa抗体结果图；

图6spr传感芯片结合值稳定性测量结果；

图7spr传感芯片bsa浓度测试标准曲线；

图8不同浓度下，癌胚抗原与鼠抗cea抗体的动力学分析。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例

一种spr传感芯片，是以2～4nm钛为过渡金属连接层，在衬底材料上镀厚度为50nm银膜后，基质修饰而成。其镀膜策略示意图如图1所示。

1.制备方法

(1)镀膜

镀膜方法为热蒸镀法，玻璃衬底的材料为bk7玻璃，尺寸为10mm×10mm×0.3mm。

玻璃衬底的上下表面经过严格抛光，超声清洗后用氮气吹干，放入镀膜真空室中。镀膜真空度为1×10^-4pa，金属蒸发速率约为0.1nm/s，首先在玻璃衬底表面镀一层2～4nm厚的钛层(增加银膜与玻璃衬底之间的粘附力)，然后再蒸镀银膜50nm。

(2)镀膜后芯片表面基质修饰。

镀膜后对银膜芯片进行表面基质的修饰，便于后续芯片表面的生物分子连接。

芯片表面修饰方法参考lofas等，并做出部分适当调整。制备过程如下：

将镀银芯片取出去离子水洗净，氮气吹干，得到表面洁净的镀银芯片。

加入十一琉基十一烷醇溶液(80％乙醇配制)45℃孵育1h，使银膜表面连上巯基烷醇。取出后用80％乙醇清洗、去离子水清洗，氮气吹干。

再将芯片加入环氧氯丙烷溶液中(体积比为1∶1的0.4mnaoh和二甘醇二甲醚溶液配制)30℃5h，使表面生成环氧基，便于后续葡聚糖的共价修饰。取出后大量去离子水冲洗，用80％乙醇清洗，去离子水冲洗，再用0.1mnaoh冲洗。

然后将芯片放入0.3g/ml葡聚糖溶液(0.1mnaoh溶液配制)，30℃振荡孵育24h，取出用50℃去离子水洗净，氮气吹干。将芯片加入1m溴乙酸溶液(2mnaoh溶液)配制，30℃振荡孵育24h，使葡聚糖羧基化。取出芯片用去离子水洗净，氮气吹干，芯片表面修饰即完成。

(3)装片

将修饰完成的芯片对着光线通过边缘折射率的不同分辨正反面，将有银膜的一面用紫外胶粘贴固定于芯片塑料架上(塑料架取自废弃的商品化芯片，将其浸泡于100％乙醇溶液12h后，用刀片将芯片与塑料架轻轻剥离从而获得芯片的塑料架)，即得到spr传感芯片。

2.性能检测

2.1原子力显微镜观察

将制备好的spr传感芯片置于原子力显微镜下，通过轻敲模式，进行面扫描观察结果如图2、图3所示；

由图2、图3可以看出：平均面粗糙度为1.05，芯片表面镀膜较为光滑平整，均一性较好，可用于后续芯片修饰，能满足biacore仪器普通分析测试的要求。

对图2、图3的扫描结果利用(afmagilent5400分析软件)均方根公式进行分析计算，得到sq平均面粗糙度为1.05，说明芯片表面镀膜较为光滑平整，均一性较好，可用于后续芯片修饰，能满足biacore仪器普通分析测试的要求。

表1芯片表面粗糙度情况参数

将制备好的spr传感芯片置于原子力显微镜下，通过轻敲模式，在图2平面上，任取一条线进行线扫描。扫描结果见图4。横坐标为样品线扫描的横向尺寸。纵坐标为样品在z轴的高度值分布情况图。结果表明，样品表面轮廓起伏较小，所镀膜较为均匀。

上述检测结果表明，本发明的spr传感芯片可用于生物分子相互作用仪，所述生物分子相互作用仪的型号为biacore4000，biacorea100，biacoret200，biacoret100，biacores51和biacores200。

2.2剥落试验

目前已发表文献中一般采用铬。在镀膜过程中发现，实际上作为过渡金属，钛比铬更能增强银膜与基底之间的附着力。

对薄膜附着力的检测采用了剥落实验，用scotch3m胶带覆在薄膜上，观察剥离后薄膜是残留在基片上还是从基片上被剥落，由此推断附着力的大小。实验发现，2nm钛+50nm银(需经过约180次以上剥落)比2nm铬+50nm银(需经过约110次以上剥落)有更高的附着力。

2.3偶联bsa抗体

本发明方法制备的spr芯片包装后，置于4℃，两月后取出，用氨基偶联法偶联bsa抗体。通过预富集实验确定偶联实验中合适的配体浓度和ph条件。偶联配体为20μg/ml的bsa抗体，预富集ph为4.5。应用biocoret200控制软件中的向导功能，设置偶联量为1000ru，完成偶联。结果如图5所示，本发明的spr芯片4℃保存两月后，仍能与bsa抗体偶联成功，证明该芯片表面修饰成功，功能化羧基修饰成功，在特定条件下存放两个月性能完好。

2.4稳定性检测

本发明方法制备的spr芯片包装后，置于4℃两月后取出，偶联bsa抗体后，连续10次进样与再生，进样液为同种样品bsa溶液，再生液为ph为2.0甘氨酸盐酸溶液，结果如图6所示，本发明方法制备的spr芯片的10次上样的结合值上下浮动在9.8％以内，平均值为54.80，标准差为1.64。

本发明方法制备的spr芯片的结合值上下浮动值在10％以内，表明本发明方法制备的spr芯片经多次上样再生后结合分析物稳定性较好，芯片性能较稳定，其品质可以达到biacore仪器要求。

2.5标准曲线

本发明方法制备的spr芯片4℃两月后取出，偶联bsa抗体后，使用1～100μg/ml一系列不同浓度的bsa测试液进样。进样浓度分别为：100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml的bsa溶液，测量不同浓度分析物在稳定状态下的结合值。依此结果绘制bsa浓度—结合值的标准曲线。结果如图7所示，在芯片结合值饱和范围内，检测分析物的浓度与结合响应值呈正相关。

利用制备的标准曲线，分析测定四组bsa样品(实际配制溶液浓度为30μg/ml、50μg/ml、70μg/ml、80μg/ml)的浓度为27.52、48.46、67.71、76.33μg/ml)，发现与bsa样品实际浓度一致。说明本发明方法制备的spr芯片可以稳定偶联样品，并用于分析物浓度测试。

3.动力学分析和亲和力的测定

利用本发明方法制备的spr芯片，以癌胚抗原(carcino-embryonicantigen，cea)与鼠抗cea抗体(单抗)为标靶，进行多循环动力学分析和亲和力的测定应用。

具体方法如下：

(1)利用本发明方法制备的spr芯片偶联鼠抗抗体cea(单抗)，偶联量100ru。

(2)利用生物分子相互作用仪biacoret100(生产厂商：ge公司)仪器的向导程序assay—kinetics/affinity，在sample中，cotecttime设为180s，flowrate设为30μl/min，dissolutiontime设为300s；在regeneration中，solution设为glycine-hcl2.5，cotecttime设为30s，flowrate设为30μl/min.在sample对话框中，设置分析物浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、40μg/ml。

(3)程序结束后利用biacoret100evaluationsoftware分析软件进行动力学分析。

结果发现，动力学分析的数据拟合结果较好，见图8。测定的cea与鼠抗cea抗体(单抗)的亲和力值(kd＝7.236×10^-9m)与已知样品实际亲和力值数量级10^-9一致，由此可知证明本发明方法制备的spr芯片可应用于动力学分析和亲和力的测定，结果准确可靠。