一种ASE‑HPLC法测定红参中人参皂苷的方法与流程

本发明涉及化学检测领域，尤其是一种ase-hplc法测定红参中人参皂苷的方法。

背景技术：

红参是中药的一种，属伞形目、五加科植物。红参是人参的熟用品，有大补元气，复脉固脱，益气摄血功效。红参用于体虚欲脱，肢冷脉微，气不摄血，崩漏下血；心力衰竭，心原性休克。红参是参的熟用品，有大补元气，复脉固脱，益气摄血功效。人参皂苷是红参的主要药效成分，人参皂苷具有增强记忆力，提高免疫力，改善心血管，调节内分泌，延缓衰老和抗肿瘤等功能，人参皂苷的含量测定已经成为国内外研究的热点。

随着社会的发展，对于药品质量控制的要求也越来越高，因此建立同时、多种、快捷、方便、可靠的人参皂苷检测方法对人参及其制剂的质量控制具有重要意义。

技术实现要素：

针对上述不足，本发明旨在提供一种线性范围广、方法准确、重现性好、快捷简便、稳定可靠的ase-hplc法测定红参中人参皂苷的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：一种ase-hplc法测定红参中的人参皂苷的方法，依次包括下述步骤：

步骤1：采用ase萃取方法萃取粉碎过的红参样品并制备甲醇萃取液；

步骤2：采用hplc法检测甲醇萃取液中的人参皂苷的含量。

进一步的，所述的步骤1包括下述子步骤：

步骤s1：将红参样品粉粹，过四号筛，取过筛后的粉末1g；

步骤s2：将1g红参粉末与1g硅藻土混合，装于放有纤维滤膜的10mlase萃取池中，加硅藻土至与池口平行；

步骤s3：用甲醇萃取，蒸干，加甲醇溶解，并用甲醇定容至10ml；

步骤s4：取1ml步骤3所得溶液加入至已装有100mgpsa的2ml离心管中离心，过滤，得到甲醇萃取液。

进一步的，所述的步骤s3中，萃取参数为：萃取温度为120℃，萃取时间为8min，循环次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60s。

进一步的，所述的ase萃取方法采用美国dionex公司的ase350快速溶剂萃取仪。

进一步的，步骤2所述的hplc法的检测参数为：色谱柱：thermosyncronisdim.(mm)aq；柱温：40℃；流速：0.3ml/min；流动相：乙腈-水；检测波长：203nm。

进一步的，所述的流动相：乙腈-水的体积比为18～30：70～82；

第0分钟，流动相中乙腈-水的体积比为18：82；

第10分钟，流动相中乙腈-水的体积比为20：80；

第18-24分钟，流动相中乙腈-水的体积比为30：70；

第25-28分钟，流动相中乙腈-水的体积比为18：82。

进一步的，所述的hplc法检测所使用的仪器为thermou3000uhplc液相色谱仪。

进一步的，所述的色谱柱的规格为1.7μm，50×2.1mm。

本发明的有益效果如下：

本发明曾对甲醇、正己烷饱和的甲醇、50％乙醇等提取溶剂进行考察，结果显示采用正己烷饱和的甲醇提取样品杂质最少，但人参皂苷含量偏低，而采用50％乙醇和甲醇提取人参皂苷含量与使用药典方法提取的含量较一致，但50％乙醇提取后杂质峰比使用甲醇高很多，故采用操作简单的、成本低的甲醇作为提取溶剂。

本发明曾对净化条件进行考察，包括在萃取池底部加入适量的中性氧化铝和硅胶作为净化剂，结果发现在萃取池中添加净化剂提取出的杂质与未添加无明显差别，实验中还考察了在提取完样品后，使用提取液添加适量的c18、psa、gcb进行净化再上机，结果发现psa和c18净化对样品的含量基本无影响而gcb会对皂苷有吸附，而psa净化效果最好，故采用psa进行净化。

本发明所提供的测定方法在人参皂苷单体在0.5μl～3.0μl范围内呈现良好的线性关系。

附图说明

图1为人参皂苷rg1以浓度(mg)-峰面积进行线性回归图；

图2为人参皂苷re以浓度(mg)-峰面积进行线性回归图；

图3为人参皂苷rb1以浓度(mg)-峰面积进行线性回归图。

具体实施方法

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

1.对照品溶液的制备：

取人参皂苷rg1对照品、人参皂苷re对照品及人参皂苷rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中含人参皂苷rg10.5mg、人参皂苷re0.3mg、人参皂苷rb1、0.5mg的混合溶液，即得。

2.供试品溶液的制备

2.1《中国药典》2015年版一部制备供试品方法：

供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷适量，加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250w，频率50khz)30分钟，滤过。精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2快速溶剂萃取法(ase)制备供试品方法：

样品经粉碎机粉碎，过四号筛，取1g，精密称定，与约1g硅藻土混合均匀，待用，移入到预先放好纤维滤膜的ase10ml萃取池中再加入适量硅藻土，轻轻振摇使之与池口在同一水平线上，拧紧萃取池上盖，放入快速萃取仪中进行萃取。萃取结束后，把萃取液转移至置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取1ml加入至已装有100mgpsa的2ml离心管中净化，离心，滤过，取续滤液，即得。

2.3ase萃取条件

萃取参数为：萃取温度为120℃，萃取时间为8min，循环次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60s。

2.4色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水为流动相,梯度洗脱；检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷rg1峰计算应不低于6000。

第0分钟，流动相中乙腈-水的体积比为18：82；

第10分钟，流动相中乙腈-水的体积比为20：80；

第18分钟，流动相中乙腈-水的体积比为30：70；

第24分钟，流动相中乙腈-水的体积比为30：70；

第25分钟，流动相中乙腈-水的体积比为18：82；

第28分钟，流动相中乙腈-水的体积比为18：82。

2.5测定法

按照高效液相色谱法(通则0512)测定。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.6标准限值要求

本品按干燥品计算，含人参皂苷rg1(c42h72o14)和人参皂苷re(c48h82o18)的总量不得少于0.25％，人参皂苷rb1(c54h92o23)不得少于0.20％。

2.7计算(外标法)

式中cr—对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/l)；

ax—供试品的峰面积；

ar—对照品峰面积。

注意：

1)使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；

2)萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；

3)萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；

4)开机前检查气瓶气压是否达到1mpa；

5)使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。

3结果

3.1色谱条件及系统适用性

仪器：thermo双三元液相(u-3000)；色谱柱：thermosyncronisdim.(mm)aq1.7μm50×2.1mm；柱温：40℃；流速：0.3ml/min；流动相：：乙腈-水；检测波长：203nm。3.2线性关系

取人参皂苷rg1对照品、人参皂苷re对照品及人参皂苷rb1对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml约含0.2mg的溶液，即得，然后分别精密吸取该溶液0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、3.0μl进入lc测定，并依照上述方法测定。

人参皂苷rg1线性试验结果见表1，以浓度(mg)-峰面积进行线性回归，详见图1；

人参皂苷re线性试验结果见表2，以浓度(mg)-峰面积进行线性回归，详见图2；

人参皂苷rb1线性试验结果见表3，以浓度(mg)-峰面积进行线性回归，详见图3；

均呈良好的线性关系。

表1

表2

表3

3.3精密度试验

取人参皂苷rg1(浓度：0.1822mg/ml)、人参皂苷re(浓度：0.2026mg/ml)及人参皂苷rb1(浓度：0.1735mg/ml)对照品混合溶液，连续进样6次，记录峰面积，人参皂苷rg1、人参皂苷re及人参皂苷rb1峰面积rsd分别为0.5％，1.1％，0.5％表明仪器精密度良好。

3.4重复性试验

取相同批号的样品1g，共3份，精密称定，按2.2ase提取方法提取供试品溶液，进样量为1μl，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中人参皂苷的含量见表4，rg1、re和rb1的rsd分别为0.3％、1.5％和1.0％。试验表明ase提取方法重复性良好。

表4

3.5样品不同仪器提取结果及与药典方法结果比较(2批)

样品通过不同仪器提取的结果见表5,样品通过ase方法提取与通过药典方法提取的结果比较见表6：

表5

表6

4讨论：

4.1ase提取溶剂的选择：

试验中曾对甲醇、正己烷饱和的甲醇、50％乙醇等提取溶剂进行考察，结果显示采用正己烷饱和的甲醇提取样品杂质最少，但人参皂苷含量偏低，而采用50％乙醇和甲醇提取人参皂苷含量与使用药典方法提取的含量较一致，但50％乙醇提取后杂质峰比使用甲醇高很多，故采用操作简单的、成本低的甲醇作为提取溶剂。

4.2ase净化步骤的选择：

实验中曾对净化条件进行考察，包括在萃取池底部加入适量的中性氧化铝和硅胶作为净化剂，结果发现在萃取池中添加净化剂提取出的杂质与未添加无明显差别，实验中还考察了在提取完样品后，使用提取液添加适量的c18、psa、gcb进行净化再上机，结果发现psa和c18净化对样品的含量基本无影响而gcb会对皂苷有吸附，而psa净化效果最好，故采用psa进行净化。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。