一种检测茶叶中GABA含量的方法与流程

本发明属于食品检测
技术领域：
，涉及一种对茶叶中gaba含量检测一种方法。
背景技术：
：γ-氨基丁酸(简称gaba)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，具有极其重要的生理功能，它能促进脑的活化性，健脑益智，抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能。每日补充微量的γ-氨基丁酸有利于心脑血压的缓解，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。γ-氨基丁酸(gaba)是一种天然活性成分，广泛分布于动植物体内。茶叶具有gaba合成的生物合成基础，是gaba的天然来源，同时，茶叶也是一种天然的健康的植物饮料，其具有生津止渴、清心明目、利尿清热、清除疲劳等功效，长期饮用能够预防心脑血管疾病、抗癌、减肥等。因此建立通过提取获得γ-氨基丁酸的方法，使用lc-ms-ms分析方法对茶叶中γ-氨基丁酸的含量进行定量，对茶叶价值的开发具有很好的应用效果。现有的茶叶中gaba的检测方法有：放射性免疫法[ria],纸上电泳法，酶联荧光法[elisa]，纸层析法，氨基酸分析仪法，薄层扫描法，高效液相色谱法，气相色谱法。其中的高效液相色谱法因其灵敏度高、精密度好，准确性高而被广泛应用。由于gaba是一种有机酸，极性强，因而一般要经过衍生，有柱前衍生和柱后衍生，多用柱前衍生，该方法较繁琐费时。技术实现要素：本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种高效、快速、准确测定茶叶中gaba含量的检测方法，为茶叶的价值利用提供了保障。本发明的技术方案：一种检测茶叶中gaba含量的方法，该方法采用液质联用，对gaba进行定量检测。一种检测茶叶中gaba含量的方法，依次包括以下步骤：样品处理，uplc-ms/ms分析，外标法定量。所述样品处理方法为：茶叶的提取：称取一定量的茶叶，以1:10的比例加入水浸泡，并于超声仪中超声1-4h后取上清，经滤膜过滤后进样即可。更优选的，茶叶的提取：称取2-4g的茶叶，以1:10的比例加入20-40ml水浸泡，并于超声仪中超声2h后取上清，经滤膜过滤后进样即可。标线的样品处理：精密称取1.84mg的gaba标准品，加水溶解配制成2mg/ml的母液，接着用水逐级稀释为500、200、100、50、20ng/ml的系列溶液后进样分析即可。所述uplc-ms/ms分析：将处理后的样品使用三重四级杆液质联用仪，在以下条件下进行分析：液相方法液相色谱柱：acquityuplcbehhilic,2.1*100mm,1.7μm柱温：35℃流动相：a：水(含0.1％甲酸，v/v)，b：乙腈；流速：0.3ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl；梯度洗脱，洗脱条件见表1。表1液相梯度time/min01.5355.017a％101090901010质谱方法：待测成分的质谱参数如下：表2mrm模式检测质谱参数targetcompoundmodechanreactioncone(volts)collision(volts)gabaesi+103.88>86.671513所述外标法定量，以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积为纵坐标，求得的直线方程，即为工作曲线:y＝217.375x-693.954，r＝0.999,标准曲线见图1。使用标准曲线计算出茶叶样品提取液中的gaba浓度。一种检测茶叶中gaba含量的方法，线性范围均为20～500ng/ml，定量下限为20ng/ml，检出限为1.5ng/ml，在20～500ng/ml范围内线性关系良好。检查方法对gaba的回收率为94.4％，满足茶叶中gaba浓度检测分析的要求。本发明具有的优点和积极效果是：uplc-ms/ms检测方法检测茶叶中gaba的含量，简单快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，为衡量茶叶的价值提供了可靠依据。附图说明图1gaba标准曲线。图2空白溶剂色谱图。图3定量限20ng/mlgaba标准溶液色谱图。图4浓度为500ng/mlgaba标准溶液色谱图。图5实施例3中检测样品1的色谱图。具体实施方式下面结合具体实施例并结合附图对本发明做进一步阐述，但不限制本发明。实施例1检测茶叶中gaba含量的方法1.1样品处理茶叶的提取：称取适量的茶叶，以1:10的比例加入水浸泡，并于超声仪中超声1-4h后取上，经滤膜过滤后于4℃保存待用。标线的处理：精密称取1.84mg的gaba标准品，加水溶解配制成2mg/ml的母液，接着用水逐级稀释为500、200、100、50、20ng/ml的系列溶液后于4℃保存待用。1.2uplc-ms/ms分析1.2.1液相方法液相色谱柱：acquityuplcbehhilic,2.1*100mm,1.7μm流动相：a：水(含0.1％甲酸，v/v)，b：乙腈流速：0.35ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl梯度洗脱，洗脱条件见下表time/min01.023.53.515a％1010909010101.2.2质谱方法：待测成分的质谱参数如下：mrm模式检测质谱参数targetcompoundmodechanreactioncone(volts)collision(volts)r-aminobutyricacidesi+103.88>86.671513本实施例中所用仪器：watersuplc-quattropremierxe三重四级杆液质联用仪(含binarysolventmanager，samplemanager，quattropremierxems，masslynxv4.1色谱工作站)；涡旋混合器，型号：mx-s，美国scilogex公司生产；超声清洗机，宁波新芝生物科技公司生产，型号：hba-m-090601-99。本实施例中所用试剂与标品：甲酸:色谱纯cnw批号:l401k140；乙腈:色谱纯fisher批号:071757；水:milliq；gaba：色谱纯chromadex批号：00001674-5qo，纯度：99.0％，室温保存。实施例2方法学验证实验2.1选择性考察选择性是指在样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物的能力，该实验方法的选择性效果较好，结果如图2空白溶剂色谱图，图320ng/mlgaba标准溶液色谱图，图5样品1色谱图所示，表明基质对目标化合物gaba的检测无任何干扰，该方法选择性好。2.2检出限考察对gaba检测限的确定是根据信噪比法来确定的。把已知浓度的贮备液稀释至低浓度的试样，测出的信号与空白处的信号(基线噪音)进行比较，算出可能被可靠的检测出的最低浓度或百分比。要求：检出限信噪比不低于3。检出限试验：取gaba适量，精密称定，分别用水稀释制成每1ml中含gaba20ng的溶液，精密量取该溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以基线噪音的3倍计算出最低检出限约为1ng/ml，将标准溶液分别稀释至0.5、1、1.5、2ng/ml后注入液相色谱仪，记录色谱图，计算信噪比，浓度为1.5ng/ml即符合信噪比大于等于3的要求。结论：即gaba的检出限为1.5ng/ml。2.3定量限考察对gaba定量限的确定是根据信噪比法来确定的。把已知浓度的贮备液稀释至低浓度的试样，测出的信号与空白处的信号(基线噪音)进行比较，要求：定量限信噪比不低于10，测定6次峰保留时间的相对标准差应不大于2.0％，峰面积的相对标准差应不大于5.0％。定量限试验：取gaba适量，精密称定，分别用水稀释制成每1ml中含gaba20ng的溶液，精密量取该溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，平行测定6次。结果如表3。表3定量限检测结果序号123456meanrsd保留时间(min)2.372.362.372.362.362.372.370.232峰面积47034789466748054687476547361.22结论：重复测定6次，gaba保留时间rsd为0.232％，峰面积的rsd为1.22％。符合验证方案要求(峰保留时间rsd不得大于2.0％；峰面积rsd不得大于5.0％)2.4系统精密度试验取同一份供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6针，6次测定结果要具有良好的重复性；对照品溶液6次测定结果的峰面积的rsd不得过5.0％，保留时间的rsd不得过2.0％，来证实系统具有良好的精密度。按上述样品处理方法处理茶叶样品是两年，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，重复进样6次。分别计算各峰面积和保留时间的rsd，结果见表3。表4精密度检测结果序号123456meanrsd保留时间(min)2.332.372.362.362.362.332.350.732峰面积215712040120793209002134321682211152.36结论：系统精密度：重复测定6次，gaba保留时间rsd为0.732％，峰面积的rsd为2.36％。说明系统精密度良好，符合验证方案要求。2.5线性试验用稀释液水配制成浓度为20、50、100、200、500ng/ml的gaba系列标准溶液进行研究。线性关系以测得的响应信号(峰面积)为纵坐标(y)，以各被分析物浓度为横坐标(x)，进行线性回归分析。要求回归方程的相关系数r的值不得小于0.990。将gaba标准品1.84mg，加水溶解为2mg/ml的储备液，接着用水逐级稀释为500、200、100、50、20ng/ml的系列标准溶液，结果见表5。表5标准曲线结论：线性：gaba在20～500ng/ml的浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，相关系数r>0.990。2.6回收率试验回收率是通过在已知供试品中加入指标的100％标准溶液，以测得值减去供试品值再除以加入量所测得结果即为回收率值，以百分率％表示，要求回收率在80.0％～115.0％之间，rsd不高于5％，以证实方法具有良好的准确度。取茶叶样品2.89g，以1：10比例加入28.9ml纯水溶解提取，再精密称取gaba标准品2.38ug，混匀后于超声仪中超声2h，取上清，过滤膜，等待进样即可，结果见表6。表6回收率结果结论：茶叶中gaba的回收率93.3％～97.5％之间，平均回收率为94.3％，rsd为1.82，符合方法学验证要求，说明本方法准确度高。2.6重复性试验重复性试验是通过配制6个100％加样溶液，100％加样溶液每个溶液进样1针，100％加样溶液6次测得的测得量的rsd不得过5.0％，来证实方法具有良好的重复性。精密量取回收试验100％加样溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，照上述方法重复测定6次。结果如表7。表7重复性检测结果结论：gaba100％样品溶液保留时间rsd为0.566％，峰面积rsd为1.51％，符合方法学验证要求，重复性良好。2.7溶液稳定性试验取供试品溶液，处理后室温放置，并分别于0、0.5、2、4、6、8、12、24小时后进样，记录峰面积，考察化学物峰面积的变化情况，计算峰面积的rsd。要求：化合物的峰面积rsd应不大于5.0％。若符合验证方案要求，则说明对照品溶液在该时间段内放置是稳定的，为以后检测时测试溶液放置时间的期限提供依据。称取茶叶样品适量，精密称定，按样品处理方法进行处理，处理后分别于0、0.5、2、4、6、8、12、24小时依次量取溶液10μl进样，注入液相色谱仪，记录色谱图，实验结果见表8。表8稳定性检测结果结论：茶叶中gaba在24h内保留时间rsd为0.15％，峰面积rsd为3.64％，符合方法学验证要求，表明样品溶液在该段时间内放置稳定，为以后检测时测试溶液放置时间的期限提供依据。实施例3实际样品的测定于市面上分别购买不同类型的茶叶，并将它们命名为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6，本次实验分别针对这些茶叶样品进行定量检测：取样品1，3.01g，以1：10比例加30.1ml水溶解，混匀于超声仪中超声2h，吸取上清液，经滤膜过滤后，在上述色谱条件下，进样分析；取样品2，3.52g，以1：10比例加35.2ml水溶解，混匀于超声仪中超声2.5h，吸取上清液，经滤膜过滤后，在上述色谱条件下，进样分析；取样品3，2.04g，以1：10比例加20.4ml水溶解，混匀于超声仪中超声1h，吸取上清液，经滤膜过滤后，在上述色谱条件下，进样分析；取样品4，2.25g，以1：10比例加22.5ml水溶解，混匀于超声仪中超声1.5h，吸取上清液，经滤膜过滤后，在上述色谱条件下，进样分析；取样品5，3.33g，以1：10比例加33.3ml水溶解，混匀于超声仪中超声3.5h，吸取上清液，经滤膜过滤后，在上述色谱条件下，进样分析；取样品6，2.97g，以1：10比例加29.7ml水溶解，混匀于超声仪中超声4h，吸取上清液，经滤膜过滤后，在上述色谱条件下，进样分析；结果如下表9。表9样品检测结果以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。当前第1页12