一种ASE‑HPLC测定罗汉果中罗汉果皂苷V含量的方法与流程

本发明公开了一种罗汉果皂苷v含量的测定方法，具体地说，是一种ase-hplc测定罗汉果中罗汉果皂苷v含量的方法，属于化学检测技术领域。

背景技术：

罗汉果是我国广西特产中药，《岭南采药录》记载：“果实味甘，理痰火咳嗽，和精肉汤服之。”民间用于清肺止咳、凉血润肠。目前已从罗汉果果实中分离并鉴定了11种葫芦烷三萜苷类化合物，该类化合物是罗汉果果实中主要活性物质，有报道采用香草醛一高氯酸试剂与三萜皂苷显色后进行比色分析测定了罗汉果中三萜皂苷的含量。

其中罗汉果皂苷v为罗汉果果实中含量和甜度均较高的成分，且目前中国药典只有对罗汉果浸出物的测定项，因此对罗汉果皂苷v含量的测定有利于完善罗汉果的质量控制标准。

技术实现要素：

针对上述不足，本发明的目的在于提供一种分析效率高，检测结果重现好的ase-hplc测定罗汉果中罗汉果皂苷v含量的方法。

为了实现上述技术效果，本发明提供的技术方案是这样的：一种ase-hplc测定罗汉果中罗汉果皂苷v含量的方法，依次包括下述步骤：

步骤1：采用ase萃取方法萃取粉碎过的罗汉果并制备甲醇萃取液；

步骤2：采用hplc法检测萃取液中的罗汉果皂苷v含量。

进一步的，所述的步骤1包括下述子步骤：

步骤s1：将罗汉果粉粹，过四号筛，取过筛后的粉末0.5g与1g硅藻土混合均匀；

步骤s2：在放有纤维滤膜的10mlase萃取池中加2g硅胶，再加入上述混合均匀的样品，加硅藻土至与池口平行；

步骤s3：用甲醇萃取，收集并采用甲醇定容至25ml，过滤，得到甲醇萃取液。

进一步的，步骤s3所述的萃取参数为：萃取温度为100℃，静态萃取时间为5min，萃取次数为1次，冲洗体积为100％，吹扫时间为60s，压力位1500psi。

进一步的，步骤2所述的hplc法进行分析时参数设置如下：

流动相：体积比为23:77的乙腈-水；流速：0.3ml/min；柱温：40℃；色谱柱：thermosyncronisc18柱；检测波长：203nm。

进一步的，所述的色谱柱的规格为3μm，3mm*100mm。

进一步的，所述的萃取所使用的仪器为：美国dionex公司的ase350快速溶剂萃取仪。

进一步的，所述的hplc所使用的仪器为thermou3000uhplc液相色谱仪。

进一步的，所述的色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂

进一步的，使用下述公式进行计算：

式中cr—对照品溶液浓度，单位为微克每升；ax—供试品的峰面积；ar—对照品峰面积。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

《中国药典》2015年版中使用大孔吸附树脂柱ab-8作为净化剂，考虑到罗汉果中糖类杂质较多，我们使用了psa、中性氧化铝、硅胶作为净化剂，发现在萃取罐底层加入2g硅胶能有效的除去糖类杂质而不影响罗汉果皂苷的含量，故采用硅胶作为净化剂；

萃取温度，我们采用80、100、120℃作为萃取温度，结果表明100和120效果最好且几乎相等，故采用100℃作为萃取温度；

提取时间我们采用3、5、8min，发现5min提取效果良好，时间较长对结果影响不大，而提取次数影响结果不明显；

本发明所提供的ase-hplc测定罗汉果中罗汉果皂苷v含量的方法分析效率高，检测结果重现好。

附图说明

图1为罗汉果皂苷v的化学结构式图；

图2为罗汉果皂苷v的浓度(μg/ml)-峰面积进行线性回归图；

图3为罗汉果皂苷v对照品的色谱图；

图4为根据药典方法萃取所得的罗汉果皂苷v的色谱图；

图5为根据ase方法萃取所得的罗汉果皂苷v的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

1.仪器设备及试剂

电子分析天平(xa205du)、ase350快速溶剂萃取仪(美国dionex公司)、thermou3000uhplc液相色谱仪；

试剂：

甲醇(色谱纯)；甲醇(分析纯)；大孔吸附树脂柱ab-8；乙醇(分析纯)；硅藻土(粒径约2mm)；硅胶。

罗汉果皂苷v的化学结构式如图1所示。

2.方法

2.1对照品溶液的制备：

取罗汉果皂苷v对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；

2.2供试品溶液的制备：

步骤s1：将样品经粉碎机粉碎，过三号筛，取0.5g与1g硅藻土混合均匀，得样品1；

步骤s2：将滤膜放入10ml萃取池中，依次加入2g硅胶和步骤s1所得的样品1，加入硅藻土至其与池口水平；

步骤s3：用甲醇对步骤s2所得的样品进行萃取，所述的萃取温度为100℃，静态萃取时间为5min，萃取次数为1次，冲洗体积为100％，即得。

2.3测定：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，图3为罗汉果皂苷v对照品的色谱图，图4为根据药典方法萃取所得的罗汉果皂苷v的色谱图，图5为根据ase方法萃取所得的罗汉果皂苷v的色谱图。

按外标法：

计算，即得，式中cr—对照品溶液浓度，单位为微克每升；ax—供试品的峰面积；ar—对照品峰面积；

2.4高效液相色谱法进行分析时参数设置如下：

流动相：体积比为23:77的乙腈-水，

流速：0.3ml/min，

柱温：40℃，

色谱柱：thermosyncronisc18柱，3μm，3mm*100mm，

检测波长：203nm。

3.测定及结果

3.1线性关系

取罗汉果皂苷v对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加流动相制成每1ml含罗汉果皂苷v880.4μg的溶液，然后分别精密吸取该溶液0.1μl、0.2μl、0.5μl、0.8μl、1.0μl进入lc测定，并依照上述方法测定，结果详见表1：

表1

以浓度(μg/ml)-峰面积进行线性回归，求得回归方程：y＝0.83977x-22.351，r²＝0.99967。罗汉果皂苷v在88～880μg/ml范围内呈良好的线性关系，详见图2。

3.2重现性试验

取相同批号的样品(批号：1510180)0.5g，共6份，精密称定，按ase提取方法提取供试品溶液，进样量为1μl，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中罗汉果皂苷v的含量见表2，rsd为1.5％，试验表明ase提取方法重复性良好：

表2

3.3精密度和稳定性试验

取罗汉果皂苷v对照品溶液(0.8804mg/ml)，连续进样6次，记录峰面积，峰面积rsd为1.5％，表明仪器精密度良好。

取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0，1，3，6，12h依法测定。

结果罗汉果皂苷v峰面积的rsd为1.6％，表明供试品溶液在12h内稳定。

样品(3批，批号分别为1508166，1510180，150723)不同仪器提取结果及与药典方法结果比较见表3：

表3

4.结果讨论：

4.1ase提取溶剂的选择：

试验中，曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》2015年版使用甲醇提取罗汉果皂苷v相对含量较高，故对使用甲醇、乙腈和乙醇进行了溶剂考察，结果显示甲醇提取罗汉果皂苷v与中国药典方法含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂。

4.2ase提取条件的优化：

《中国药典》2015年版中使用大孔吸附树脂柱ab-8作为净化剂，考虑到罗汉果中糖类杂质较多，我们使用了psa、中性氧化铝、硅胶作为净化剂，发现在萃取罐底层加入2g硅胶能有效的除去糖类杂质而不影响罗汉果皂苷的含量，故采用硅胶作为净化剂。

萃取温度，我们采用80、100、120℃作为萃取温度，结果表明100和120效果最好且几乎相等，故采用100℃作为萃取温度；提取时间我们采用3、5、8min，发5min提取效果良好，时间较长对结果影响不大，而提取次数影响结果不明显。

最终确定条件为提取溶液为甲醇、萃取温度100℃、萃取时间5min，循环次数1次。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。