一种ASE‑HPLC法测定人参中人参皂苷Rg1和Re含量的方法与流程

本发明属于化学检测领域，尤其是一种ase-hplc法测定人参中人参皂苷rg1和re含量的方法。
背景技术：
：人参是我国地道药材中应用最广泛的代表，人参皂苷是人参的主要药效成分，人参皂苷具有增强记忆力，提高免疫力，改善心血管，调节内分泌，延缓衰老和抗肿瘤等功能，人参皂苷的含量测定已经成为国内外研究的热点。但是在测定过程中，由于样品中的色素杂质过多，从而造成测定结果不准确，因此建立有效除杂并测定准确的人参皂苷检测方法对人参及其制剂的质量控制具有重要意义。技术实现要素：针对上述不足，本发明旨在将ase(快速溶剂萃取法)、gcb(石墨化炭黑)和hplc(高效液相色谱法)三者有效结合，从而提高测定的准确率以及稳定性，提高方法的重复性的一种ase-hplc法测定人参中人参皂苷含量的方法，且该方法可同时测定人参中的人参皂苷rg1和re。为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：一种ase-hplc法测定人参叶中人参皂苷rg1和re含量的方法，依次包括下述步骤：步骤1：采用ase对粉碎后的人参进行甲醇萃取，取1ml萃取液与75mg石墨化炭黑混合，过滤，得甲醇萃取液；步骤2：采用hplc法检测甲醇萃取液中人参皂苷rg1和re的含量。进一步的，所述的步骤1包括下述子步骤：步骤s1：将样品粉碎，过三号筛，取过筛后的粉末0.2g；步骤s2：将0.2g的人参粉末与1g硅藻土混合，装于放有过滤膜的5mlase萃取池中，加硅藻土至与池口平行；步骤s3：用甲醇萃取，蒸干，加甲醇溶解，并用甲醇定容至10ml；步骤s4：取1ml步骤s3所得溶液与75mggcb混合，漩涡振荡1min，离心，取上清液过0.22微米滤膜后得甲醇萃取液。进一步的，步骤s3所述的萃取，参数如下：萃取温度为110℃，萃取时间为7min，萃取次数为3次，冲洗体积为80％，吹扫时间为60s。进一步的，步骤2所述的hplc法的检测参数为：色谱柱为thermosyncronisdim.aq，1.7μm，50×2.1mm；柱温为40℃；流速为0.3ml/min；流动相为体积比等于18:82的乙腈-水；检测波长：203nm。进一步的，步骤s4所述的离心参数为：速度为10000r/min，时间为4min。进一步的，步骤1所述的萃取所采用的仪器为美国dionex公司的ase350快速溶剂萃取仪；步骤2所述的hplc法检测所采用的仪器为agilent1290高效液相色谱仪。本发明与传统方法相比，具有以下优点：1.本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，使用过正己烷饱和的甲醇和甲醇两种溶剂进行提取，结果显示甲醇提取和药典方法的含量一致且杂质峰基本相同，正己烷饱和的甲醇提取的样品含量偏低，故采用与药典一致的提取溶剂；2.本发明曾对提取并定容后的样品进行净化，分别取定容后的样品1.00ml分别加入到装有25mg、50mg、75mg、100mg的gcb的2ml离心管涡旋1min，10000r/min离心4min后吸取上清液过滤上机测定。结果表明gcb能优先吸附色素使样品中的杂质明显降低，但当色素被吸附完全后样品中待测成分就有可能gcb吸附，故选择75mg的gcb添加量。3.本发明将ase(快速溶剂萃取法)、gcb(石墨化炭黑)和hplc(高效液相色谱法)三者有效结合，从而提高测定的准确率以及稳定性，提高方法的重复性的方法，且该方法可同时测定人参中的人参皂苷rg1和re。附图说明图1为人参皂苷rg1以浓度(mg)-峰面积进行线性回归图；图2为人参皂苷re以浓度(mg)-峰面积进行线性回归图；图3为人参皂苷rg1和re对照品图谱图；图4为ase法萃取的样品图谱图；图5为药典方法提取的样品图谱；图6为使用不同量的gcb对样品杂质的影响图。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。实施例11.仪器设备及试剂1.1仪器：电子分析天平(xa205du)、ase350快速溶剂萃取仪(美国dionex公司)、agilent1290高效液相色谱仪1.2试剂(除特别注明外，本实验所用试剂均为分析纯)：水：符合gb/t6682规定的一级水；甲醇(ch3oh)：色谱纯(液相色谱用)。2方法2.1对照品溶液的制备：取人参皂苷rg1对照品、人参皂苷re对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含人参皂苷rg10.2mg、人参皂苷re0.2mg的溶液。2.2供试品溶液的制备2.2.1《中国药典》2015年版一部制备供试品方法：取本品粉末约0.2g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷30ml，加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇30ml，加热回流3小时，提取液低温蒸干，加水10ml使溶解，加石油醚(30～60℃)提取2次，每次10ml，弃去醚液，水液通过d101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱长为15cm)，以水50ml洗脱，弃去水液。再用20％乙醇50ml洗脱，弃去20％乙醇洗脱液，继用80％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液70ml，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.2.2快速溶剂萃取法(ase)制备供试品方法：样品经粉碎机粉碎，过三号筛，约0.2g，精密称定，与1g硅藻土混合均匀，待用，移入到预先放好过滤膜的ase5ml萃取池中再加入适量硅藻土，轻轻振摇使之与池口在同一水平线上，拧紧萃取池上盖。萃取结束后，把萃取液转移至蒸发皿中蒸干后用甲醇溶解并定容至10ml容量瓶，再吸取1ml至装有75mggcb的2ml离心管中，漩涡振荡1min，离心，滤过，滤液过0.22微米滤膜后进入hplc测定。2.3ase萃取条件萃取温度为110℃，萃取时间为7min，萃取次数为3次，冲洗体积为80％，吹扫时间为60s。2.4色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(18:82)为流动相梯度洗脱；检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷re峰计算应不低于1500。2.5测定法照高效液相色谱法(通则0512)测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。hplc法的检测参数为：色谱柱为thermosyncronisdim.aq，1.7μm，50×2.1mm；柱温为40℃；流速为0.3ml/min；流动相为体积比等于18:82的乙腈-水；检测波长：203nm。2.6标准限值要求本品含人参皂苷rg1(c42h72o14)和人参皂苷re(c48h82o18)的总量不得少于2.25％。2.7计算式中cr——对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/l)；ax——供试品的峰面积；ar——对照品峰面积。注意：1.使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；2.萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；3.萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；4.开机前检查气瓶气压是否达到1mpa；5.使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。3结果3.1线性关系取人参皂苷rg1对照品、人参皂苷re对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml约含0.2mg的混合溶液，即得，然后分别精密吸取该溶液0.5μl、1μl、1.5μl、2μl、3μl进入lc测定，并依照上述方法测定，人参皂苷rg1线性试验结果见表1，人参皂苷re线性试验结果见表2。以浓度(mg)-峰面积进行线性回归，求得人参皂苷rg1的回归方程：y＝1264.2x+7.6763，r2＝0.99979,在0.0911～0.5466mg范围内呈良好的线性关系；详见图1。以浓度(mg)-峰面积进行线性回归，求得人参皂苷re的回归方程：y＝1148.8x-0.96132，r2＝0.99998，在0.1013～0.6078mg范围内呈良好的线性关系；详见图2。表1表23.2重复性试验取相同批号的样品(批号：15071601)0.2g，共3份，精密称定，按2.2.2ase提取方法提取供试品溶液，进样量为1μl，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中人参皂苷rg1和re的总含量见表3，rsd为0.5％，试验表明ase提取方法重复性良好。表33.3精密度和稳定性试验取人参皂苷rg1对照品溶液(0.1822mg/ml)，和人参皂苷re对照品溶液(0.2026mg/ml)，连续进样6次，记录峰面积，峰面积rsd人参皂苷rg1为1.1％，人参皂苷re为0.5％，表明仪器精密度良好，详见图3，其中人参皂苷rg1(tr：9.443)和re(tr：10.021)。取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0，2，8，12h依法测定。记录峰面积，峰面积rsd人参皂苷rg1为0.6％，人参皂苷re为0.9％，表明供试品溶液在12h内稳定。3.4样品不同仪器提取结果及与药典方法结果比较(3批)样品不同ase仪器提取结果详见表4，图谱详见图4；使用ase法提取与使用药典方法提取结果的比较结果详见表5，药典方法提取样品的图谱详见图5。表4样品批号ase1方法测得含量(％)ase2方法测得含量(％)rad(％)150716013.453.272.7％1203033.203.121.3％14072211.901.851.3％表5样品批号ase1方法测得含量(％)药典方法测得含量(％)rad(％)150716013.453.430.3％1203033.203.131.1％14072211.901.930.8％4讨论：4.1ase提取溶剂的选择：试验中，曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，使用过正己烷饱和的甲醇和甲醇两种溶剂进行提取，结果显示甲醇提取和药典方法的含量一致且杂质峰基本相同，正己烷饱和的甲醇提取的样品含量偏低，故采用与药典一致的提取溶剂。4.2ase提取净化试验中，曾对提取并定容后的样品进行净化，分别取定容后的样品1.00ml分别加入到装有25mg、50mg、75mg、100mg的gcb的2ml离心管涡旋1min，10000r/min离心4min后吸取上清液过滤上机测定。结果表明gcb能优先吸附色素使样品中的杂质明显降低，但当色素被吸附完全后样品中待测成分就有可能gcb吸附，故选择75mg的gcb添加量。使用不同量的gcb对样品杂质的影响图详见图6。以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12