一种ASE‑HPLC法测定银杏叶中总黄酮含量的方法与流程

本发明属于化学检测领域，尤其是一种ase-hplc法测定银杏叶中总黄酮含量的方法。
背景技术：
：银杏叶，为银杏科植物银杏ginkgobilobal.的干燥叶。秋季叶尚绿时采收，及时干燥。一般为人工栽培。栽培地区北至辽宁，南达广东，东起浙江，西达陕西、甘肃、西南到四川、贵州、云南等地。具有活血化瘀，通络止痛，敛肺平喘，化浊降脂的功效；用于瘀血阻络，胸痹心痛，中风偏瘫，肺虚咳喘，高脂血症。银杏叶主要的药理作用的有效成分为黄酮类化合物，且含量较高。此类化合物具有防止心血管疾病的功能。但现如今还未有对银杏叶中的总黄酮的含量测定有系统的报道。技术实现要素：针对上述不足，本发明旨在提供一种重现性好、干扰因素少、方便快捷的测定银杏叶中总黄酮含量的ase-hplc法。为了实现上述技术效果，本发明提供的技术方案是这样的：一种ase-hplc法测定银杏叶中总黄酮含量的方法，依次包括下述步骤：步骤1：采用ase萃取法分别用正己烷和甲醇萃取粉碎后的银杏叶，并收集甲醇提取液后经盐酸处理得甲醇萃取液；步骤2：采用hplc法测定甲醇萃取液中总黄酮的含量。进一步的，所述的步骤1包括下述子步骤：步骤s1：将银杏叶粉碎，取1g与1g硅藻土混合，并将其装于放有纤维滤膜的ase萃取池中，并加硅藻土至与池口平行；步骤s2：用正己烷萃取，收集药渣；步骤s3：用20ml甲醇对药渣进行萃取，收集萃取液；步骤s4：用甲醇将萃取液定容至25ml，作为备用液；步骤s5：取20ml备用液与5ml25％盐酸溶液混合，加热回流30min；步骤s6：冷却后，用甲醇将其定容至50ml，得甲醇萃取液。进一步的，步骤s2所述的萃取参数为：萃取温度为80℃，萃取时间为5min，萃取次数为1次，冲洗体积为100％，吹扫时间为100s。进一步的，步骤s3所述的萃取参数为：萃取温度为120℃，萃取时间为5min，萃取次数为2次，冲洗体积为100％，吹扫时间为100s。进一步的，步骤2所述的hplc法的检测参数为：色谱柱为ace,ultracoresuperc18；柱温为40℃；流速为0.3ml/min；流动相为甲醇-0.4％磷酸溶液；检测波长为360nm。进一步的，所述的色谱柱的规格为：2.1*75mm，2.5μm。进一步的，流动相所述的甲醇-0.4％磷酸溶液的体积比为40：60。与传统方法相比，本发明具有以下优势：1.本发明参考药典方法，先用正己烷除杂，再用甲醇提取，获得良好的实验结果。2.本发明采用对一个样品进行多次萃取，并且萃取液收集到不同的收集瓶中以考察静态循环次数(1次、2次、3次)。此外，采用单因素考察方式，考察了萃取温度(80℃、100℃、120℃)、静态萃取时间(5min、8min、10min)等条件下的萃取效果，结果在提取温度120℃，提取时间5min，静态循环次数2次的条件下，获得最优结果。3.本发明提高了温度降低溶剂的黏度，减少溶剂进入样品基体的阻止，增加了溶剂进入样品基体的扩散，降低溶剂和样品基体之间的表面张力，使溶剂溶解待测物的容量增加。4.由于液体对溶质的溶解能力远大于气体对溶质的溶解能力，萃取液体的沸点随压力升高而提高，从而使溶剂在高温高压下仍保持在液态。附图说明图1为表1为槲皮素的浓度(μg)-峰面积的线性回归图；图2为山奈素浓度(μg)-峰面积的线性回归图；图3为异鼠李素浓度(μg)-峰面积的线性回归图；图4为槲皮素对照品、山柰素对照品、异鼠李素对照品的总色谱图；图5为快速溶剂萃取法提取样品的色谱图；图6为药典方法提取样品的色谱图。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。实施例11仪器设备及试剂1.1仪器：电子分析天平(xa205du)、ase350快速溶剂萃取仪(美国dionex公司)、thermou3000uhplc液相色谱仪1.2试剂：除特别注明外，本实验所用试剂均为分析纯水：符合gb/t6682规定的一级水；甲醇(ch4o)：色谱纯(液相色谱用)。2方法2.1对照品溶液的制备：取槲皮素对照品、山柰素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含槲皮素30μg、山柰素30μg、异鼠李素20μg的混合溶液，即得。2.2供试品溶液的制备2.2.1《中国药典》2015年版一部制备供试品方法：本品中粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取2小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干，加甲醇回流提取4小时，提取液蒸干，残渣加甲醇-25％盐酸溶液(4:1)混合溶液25ml，加热回流30分钟，放冷，转移至50ml量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，即得。2.2.2快速溶剂萃取法(ase)制备供试品方法：步骤s1：将银杏叶粉碎，取1g与1g硅藻土混合，并将其装于放有纤维滤膜的ase萃取池中，并加硅藻土至与池口平行；步骤s2：用正己烷萃取，收集药渣；步骤s3：用甲醇对药渣进行萃取，收集萃取液；步骤s4：用甲醇将萃取液定容至25ml，作为备用液；步骤s5：取20ml备用液与5ml25％盐酸溶液混合，加热回流30min；步骤s6：冷却后，用甲醇将其定容至50ml，得甲醇萃取液。2.3ase萃取条件步骤s2所述的萃取参数为：萃取温度为80℃，萃取时间为5min，萃取次数为1次，冲洗体积为100％，吹扫时间为100s。步骤s3所述的萃取参数为：萃取温度为120℃，萃取时间为5min，萃取次数为2次，冲洗体积为100％，吹扫时间为100s。2.4色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(40:60)为流动相；检测波长为360nm，理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。2.5测定法按照高效液相色谱法(通则0512)测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量。总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51检测参数为：色谱柱为ace,ultracoresuperc18，2.1*75mm，2.5μm；柱温为40℃；流速为0.3ml/min；流动相为体积比为40：60的甲醇-0.4％磷酸溶液；检测波长为360nm。2.6标准限值要求本品按干燥品计算，含总黄酮醇苷不得少于0.40％。2.7计算(外标法)式中cr——对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/l)；ax——供试品的峰面积；ar——对照品峰面积。注意：使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；开机前检查气瓶气压是否达到1mpa；使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。3结果3.1线性关系取槲皮素(浓度：0.03943mg/ml)、山奈素(浓度：0.03469mg/ml)及异鼠李素(浓度：0.02142mg/ml)对照品混合溶液分别精密吸取该溶液0.1μl、0.2μl、0.5μl、1.0μl、2μl进入lc测定，并依照上述方法测定，结果见表1-表3。其中表1为槲皮素线性实验结果；表2为山奈素线性实验结果；表3为异鼠李素线性实验结果。表1表2表3浓度(μg)第一针峰面积第二针峰面积平均峰面积0.0021435.4339738.0901436.762060.0042861.8157859.5854960.700640.01071146.92665147.56679147.246720.02142296.80853298.47849297.643510.04284591.17731574.95355583.06543以浓度(μg)-峰面积进行线性回归，详见图1至图3。其中图1为表1为槲皮素的浓度(μg)-峰面积的线性回归图；图2为山奈素浓度(μg)-峰面积的线性回归图；图3为异鼠李素浓度(μg)-峰面积的线性回归图。结果槲皮素、山奈素及异鼠李素均呈良好的线性关系。3.2精密度试验取槲皮素(浓度：0.03943mg/ml)、山奈素(浓度：0.03469mg/ml)及异鼠李素(浓度：0.02142mg/ml)对照品混合溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果槲皮素、山奈素和异鼠李素的峰面积rsd分别为0.3％，0.6％，0.4％表明仪器精密度良好。3.3重现性试验取相同批号(玉林产)的样品1g，共4份，精密称定，按上述ase提取方法提取供试品溶液，进样量为1μl，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中人参皂苷的含量见表4，槲皮素、山奈素和异鼠李素的rsd分别为0.8％、1.1％和1.4％。试验表明ase提取方法重复性良好。表4槲皮素含量(％)山奈素含量(％)异鼠李素含量(％)重复性10.07960.06230.0292重复性20.07970.06270.0294重复性30.07980.06240.0293重复性40.08120.06400.0301平均含量(％)0.08000.06300.0290rsd(％)0.81.11.43.4样品不同仪器提取结果及与药典方法结果比较(2批)使用不同ase仪提取的样品结果比较见表5：表5使用ase法与使用药典法提取的样品结果比较见表6：表64讨论：ase提取溶剂的选择：本发明参考药典方法，先用正己烷除杂，再用甲醇提取，获得良好的实验结果。ase提取条件的优化：本发明采用对一个样品进行多次萃取，并且萃取液收集到不同的收集瓶中以考察静态循环次数(1次、2次、3次)。此外，采用单因素考察方式，考察了萃取温度(80℃、100℃、120℃)、静态萃取时间(5min、8min、10min)等条件下的萃取效果，结果在提取温度120℃，提取时间5min，静态循环次数2次的条件下，获得最优结果。以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12