一种光透明化生物组织的树脂包埋方法与流程

本发明属于生物医学光学成像技术领域，具体设计一种能够将鼠脑组织进行包埋，同时在单体发生聚合(包埋)后，组织保持一定透明度的光透明化生物组织的树脂包埋方法。

背景技术：

随着生物医学光子学学科的蓬勃发展，现代光学技术在脑以及组织里神经网络结构的解析已经进入了飞速发展的阶段。在脑成像技术中，通过逐层切削成像能够获得极高的分辨率，同时人们已经获得了极其精细的鼠脑3D全脑神经分布图。然而由于脑组织不透明，光穿透深度不足，z轴切削厚度较小，导致成像速度过慢的缺点。研究脑神经网络结构的终极目的即为了得到灵长类动物的脑神经的精细结构图，进而对脑相关的神经疾病、大脑的活动等领域提供指导。当前，研究课题从鼠脑过渡到灵长类猴脑的过程中产生了一系列新的技术难题。其中，由鼠脑(体积约为1cm³)过渡到灵长类(体积约为10³cm³)直观体积上的变化导致成像的总量以及相应信息量的急剧增加。完整的鼠脑成像需要超过一年的时间，因此如果仍然沿用鼠脑的成像技术，那么成像的时间必将变得过长，而失去意义。提高逐层切削技术成像的速度变得极其迫切。

通过对组织进行一定的处理，可以得到光透明的生物样本，使得光的穿透能力大大的加强，进而极大地缩短成像所需要的时间。然而，这些组织光透明技术几乎无一例外的全部都集中在溶液介质中，因此无法用于逐层切削成像系统中。而传统的组织包埋技术，包埋的介质与组织之间往往因为折射率不匹配而不透明，使得其z轴成像深度较小，单次成像的切削的厚度偏小，进而使得成像时间过长。借助于组织透明技术能够有效的减少光在组织中的光散射，可以增加z轴成像的深度，进而缩短成像所需要的时间。如果能够将组织在包埋之后，仍然保持一定的透明度，那么将增加切削成像的深度与切削的厚度，进而直接地缩短组织成像所需要的时间，为体积较大的灵长类猴脑的成像起到关键性的技术作用。同时，当前组织的树脂包埋技术所使用的温度多数都在50℃以上才能有效地引发单体聚合。而荧光蛋白在较高的温度下，往往会发生变性而使荧光减弱甚至完全猝灭，不利于成像。因此，如何降低组织在包埋过程中的聚合温度亦将更好的保护荧光蛋白，从而提高成像的质量是组织树脂包埋需要关心的另一个问题。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种光透明化生物组织的树脂包埋方法，其目的在于通过选择采用和组织本身具有相匹配的折射率的包埋介质对组织进行包埋，从而得到具有一定透明度的树脂包埋组织，由此解决现有技术的组织透明手段只能在溶液介质中进行，无法适用于切削成像；而传统的组织包埋技术能够适用于切削成像，但是由于包埋后组织不透明，使得切削成像时Z轴成像深度较小，成像时间过长的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种光透明化生物组织的树脂包埋方法，采用包埋介质进行生物组织的树脂包埋，所述生物组织的折射率与所述包埋介质的折射率相匹配，从而实现光透明化的生物组织的树脂包埋，所述包埋介质为引发剂引发聚合单体聚合而形成的聚合物。

优选地，所述聚合单体为甲基丙烯酸苄酯、2-丙烯酸-2-甲基-2-苯氧基乙基酯和/或2-丙烯酸-2-羟基-3-苯氧基丙酯的一种或多种。

优选地，所述引发剂为偶氮二异庚腈。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的树脂包埋方法，包括如下步骤：

(1)将采用化学方法固定后的生物组织进行脱脂化处理，得到脱脂后的生物组织；

(2)将步骤(1)获得的脱脂后的生物组织浸泡于聚合单体中，然后加入引发剂，混合使所述引发剂充分溶解，然后在避光条件下在-20～0℃渗透12～24小时，得到渗透后的生物组织；

(3)将步骤(2)获得的渗透后的生物组织在35～45℃下反应12～48小时，得到光透明化的生物组织树脂。

优选地，步骤(1)所述化学方法固定为采用甲醛溶液进行固定。

优选地，步骤(1)所述的脱脂化处理的具体步骤为：在不同梯度的四氢呋喃-水混合液中进行脱脂处理。

优选地，步骤(2)所述聚合单体与所述引发剂的用量比为1毫升:1～6毫克。

优选地，步骤(3)所述反应温度为40℃。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。

(1)本发明提供了一种能够对生物组织进行光透明化的树脂包埋方法，它在保证树脂本身提供固态支撑的基础上，对生物组织提供一定程度的光透明，使组织在进行切削成像的时候，样品成像的深度增加，z轴切削的厚度加大，进而大大缩短组织成像所需要的时间。

(2)本发明通过选择具有特定折射率的聚合单体和具有特定引发聚合温度的引发剂配合使用，选择的引发剂聚合温度较低，对生物组织进行低温渗透，然后较低温度下引发聚合，聚合后的包埋介质具有与生物组织相匹配的折射率，从而实现了生物组织的透明化包埋，同时由于聚合温度较低，荧光蛋白的荧光保持良好，因此，本发明的生物组织透明化树脂包埋方法不仅能够实现生物组织的透明化，而且还能够保证在聚合反应过程中生物组织的荧光蛋白的荧光保持良好，不淬灭，为荧光成像创造了良好条件。

(3)本发明的透明化树脂包埋方法通过精心选择聚合单体、引发剂以及优选包埋条件，最终得到了一套生物组织树脂包埋并透明化的整体技术方案，各参数协同配合，最终实现了生物组织的透明化树脂包埋，生物组织荧光保持良好，透明化的生物组织应用于切削成像增加切削厚度，缩短全脑成像所需要的时间。

附图说明

图1是鼠脑在不同梯度的四氢呋喃-水混合溶液以及二氯甲烷处理前(a)与处理后(b)的对比图；

图2是普通鼠脑置于(a)PBS溶液中以及(b)使用甲基丙烯酸苄酯单体包埋(聚合)后的效果图；

图3是普通鼠脑置于(a)PBS溶液中以及(b)使用2-丙烯酸-2-羟基-3-苯氧基丙烯酸单体包埋(聚合)后的效果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

针对现有技术的组织透明手段只能在溶液介质中进行，无法适用于切削成像；而传统的组织包埋技术能够适用于切削成像，但是由于包埋组织不透明，使得切削成像时Z轴成像深度小、成像时间长的技术问题，本发明创造性地提供了一种光透明化鼠脑组织的树脂包埋方法，采用包埋介质进行生物组织的树脂包埋，生物组织的折射率与所述包埋介质的折射率相匹配，从而实现光透明化的生物组织的树脂包埋。

聚合单体的选择是本发明的关键点，满足要求的聚合单体需要具备的条件为：该聚合单体在引发剂的引发下，在生物组织存在的体系中，发生聚合反应以后形成的聚合物的折射率必须与生物组织的折射率相匹配。本发明的申请人在大量的基础实验和创造性劳动之后，得出甲基丙烯酸苄酯、2-丙烯酸-2-甲基-2-苯氧基乙基酯和/或2-丙烯酸-2-羟基-3-苯氧基丙酯为满足本发明要求的可行的聚合单体。引发剂为可以在较低的温度下即可引发聚合的引发剂，比如偶氮二异庚腈。

本发明提供的光透明化鼠脑组织的树脂包埋方法，具体包括如下步骤：

(1)将采用化学方法固定后的生物组织进行脱脂化处理，得到脱脂后的生物组织；化学方法固定可以为采用甲醛溶液进行固定；脱脂化处理可以在不同梯度的四氢呋喃-水混合液中进行。

(2)将步骤(1)获得的脱脂后的生物组织浸泡于聚合单体中，然后加入引发剂，混合使所述引发剂充分溶解，然后在避光条件下在-20～0℃渗透处理12～24小时，得到渗透后的生物组织；

其中，聚合单体优选为甲基丙烯酸苄酯、2-丙烯酸-2-甲基-2-苯氧基乙基酯和/或2-丙烯酸-2-羟基-3-苯氧基丙酯中的一种或多种；引发剂优选为偶氮二异庚腈；聚合单体与所述引发剂的用量比为1毫升:1～6毫克，即每毫升所述聚合单体1～6毫克所述引发剂。

(3)将步骤(2)获得的渗透后的生物组织在35～45℃下进行聚合反应12～48小时，使得聚合单体在引发剂的引发下进行聚合形成聚合物，其中引发剂引发聚合单体聚合后的聚合物的折射率与所述生物组织的折射率相匹配，这样就得到不同硬度的光透明化的生物组织。

一般情况下，聚合反应温度越高，聚合速率越快，聚合程度越高，但实际应用还要考虑过高的温度对组织中荧光蛋白造成的不可逆破坏。现有技术进行生物组织的树脂包埋一般选择聚合温度在50～70℃，温度较高，容易对荧光蛋白照成不可逆的破坏而使荧光降低或者猝灭，不利于荧光成像。针对这一问题，本发明选择了偶氮二异庚腈作为引发剂，而该引发剂在较低的温度(35～45℃)即有效地引发单体进行聚合。因此本发明的树脂包埋方法不仅能够实现生物组织的透明化，而且还能够保证在聚合反应过程中生物组织的荧光蛋白的荧光性能保持良好，不淬灭或者减少猝灭。

本发明的关键技术在于包埋介质与组织本身的折射率相匹配。树脂的折射率过高或者过低都会导致包埋的生物组织不透明，包埋介质为引发剂引发聚合单体进行聚合而形成的聚合物。现有技术通常在溶液介质中进行生物组织的光透明化处理，只需寻找与生物组织折射率相匹配的化学试剂即可实现生物组织的透明化。然而，溶液介质无法用于切削荧光成像中。而本发明并非在溶液介质中透明化生物组织，而是针对切削成像的特点，寻找一种光透明化生物组织的树脂包埋方法，以便于荧光切削成像，为了实现树脂包埋后的生物组织的光透明化，如果选用与生物组织折射率相匹配的试剂作为聚合单体，由于聚合单体在引发剂的引发下聚合以后折射率会发生变化，因此按照现有技术的思路来寻找聚合单体和引发剂是行不通的，本发明选用的聚合单体和引发剂能够保证在聚合以后形成的包埋介质与生物组织本身的折射率相匹配，因此最终保证生物组织的透明化包埋处理，应用于切削荧光成像，切削厚度增加，成像时间相对于现有技术大大增加。

以下为实施例：

实施例1

一种光透明化鼠脑组织的树脂包埋方法，包括如下步骤：

(1)将甲醛溶液固定后的鼠脑，置于四氢呋喃-水混合液中(四氢呋喃含量为50％)12小时；然后将溶液替换为四氢呋喃比例为80％的混合溶液中1小时；继续更换至纯THF中1小时，两次。然后将处理后的鼠脑置于二氯甲烷中半小时(如图1)；

(2)将单体甲基丙烯酸苄酯滴加在事先准备好碱性氧化铝(200-300目)柱层析柱子上，在气泵的加压下流出，除去其中的阻聚剂；

(3)在容积为10ml的血清瓶中，将处理后的鼠脑侵泡于甲基丙烯酸苄酯单体(2ml)(聚合单体)中，然后加入引发剂偶氮二异庚腈(4mg)，使之充分溶解。然后将瓶子用锡箔纸包裹遮光，置于-10℃中保存24小时进行渗透处理，转移到40℃烘箱中加热聚合1天，可以看到单体发生聚合而变为固体，组织和包埋介质的折射率相匹配的时候，组织即变得透明化。

图1是鼠脑在不同梯度的四氢呋喃-水混合溶液以及二氯甲烷处理前(a)与处理后(b)的对比图；从图1可以看出鼠脑在不同梯度的四氢呋喃-水以及二氯甲烷处理之后，鼠脑体积上存在明显的变化。

图2是处理后的鼠脑浸泡于甲基丙烯酸苄酯单体中聚合前和聚合后的对比图。从图2可以看出鼠脑在为处理前光无法穿透；包埋后，树脂中的鼠脑对光有着极好的透过率。该实施例制备得到的透明化鼠脑能够极大的提高成像的深度，增加切削的厚度，进而缩短全脑成像所需要的时间。

实施例2

使用2-丙烯酸-2-羟基-3-苯氧基丙烯酸作为单体进行透明包埋。

(1)将甲醛溶液固定后的鼠脑，置于四氢呋喃-水混合液中(四氢呋喃含量为50％)12小时；然后将溶液替换为四氢呋喃比例为80％的混合溶液中1小时；继续更换至纯THF中1小时，两次。然后将处理后的鼠脑置于二氯甲烷中半小时(如图1)；

(2)将单体2-丙烯酸-2-羟基-3-苯氧基丙烯酸滴加在事先准备好碱性氧化铝(200-300目)柱层析柱子上，在气泵的加压下流出，除去其中的阻聚剂；

(3)透明处理后的鼠脑，置于容量为10ml的血清瓶中。将处理后的鼠脑侵泡于2-丙烯酸-2-羟基-3-苯氧基丙烯酸单体(2ml)(聚合单体)中，然后加入引发剂偶氮二异庚腈(4mg)，使之充分溶解。然后将瓶子用锡箔纸包裹遮光，置于-10℃中保存24小时进行渗透处理。水浴条件下，从20℃逐渐升温(升温幅度为5℃)，分步加热至25,30,35,40℃，每阶段维持恒温6h，之后在40℃条件下继续加热6h。由此可以看到单体发生聚合而变为固体，组织和包埋介质的折射率相匹配的时候，组织即变得透明化，同时鼠脑从聚合前的乳白状的不透明变为透明，如图3所示。

鼠脑的透明包埋技术中，其关键在于使得包埋的介质与组织本身的折射率相匹配。树脂的折射率过高或者过低都会导致包埋的鼠脑不透明。折射率相匹配指折射率相同或接近，二者的折射率越接近，透明程度越高。因此，凡是本发明的设计结构和思路做的一些简单的变化或者更改的设计都将落入本发明的保护范围。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。