背景技术：
马兜铃酸类化合物具有明显的肾毒性，是当前市售含马兜铃中药及复方的重点监测指标成分，例如2015版中国药典中规定天仙藤药材中马兜铃酸I的含量不得超过0.01％，细辛药材中马兜铃酸I的含量不得超过0.001％，而对于含马兜铃酸复方中该类成分的检测尚未有法定标准，推测原因可能为该类复方药味众多、基质复杂且存在诸多辅料的干扰，检测难度较大。发展一种高效的预处理方法，能够有效富集尤其是从复杂的复方基质中富集马兜铃酸类化合物，组合现有的分析技术，有望是解决该问题的有效途径。
目前，富集该类化合物的方法主要包括液液萃取(Zhang,J.,et al.,J.Pharmceut.Biomed.,2010,52(4):446-451)、双水相萃取(L.Vaclavik,et al.,Food Addit.Contam.A-Chemistry Analysis Control Exposure&Risk Assessment,2014,31:784-791)、商品阴离子交换树脂柱(K.Yamasaki,et al.,J.Nat.Med.,2009,63:451-458)等预处理方法，上述各种方法均能较好地解决马兜铃酸的富集问题，但存在预处理流程繁琐，通量不足或价格昂贵等缺点。为建立一种更方便且价廉的预处理方法，我们采用自制大孔吸附树脂萃取柱富集马兜铃酸，通过与以上各方法平行对比试验，研究结果表明，我们自制的萃取柱回收率更高、稳定性更好，可作为一种新的预处理方法，用于马兜铃药材及含马兜铃复方中马兜铃酸的高灵敏测定。
技术实现要素：
本发明提供了一种用于富集马兜铃酸的预处理新方法，该方法采用自制价廉的大孔吸附树脂萃取柱，可高效富集马兜铃酸类化合物，相较传统液液萃取、双水相萃取及商品阴离子交换树脂柱萃取技术，本发明报道的富集方法，回收率更高，稳定性更好，可作为一种新的预处理方法，用于马兜铃药材及含马兜铃复方中马兜铃酸的高灵敏测定。
具体内容为：采用自制价廉的大孔吸附树脂萃取柱，大孔吸附树脂填料为HPD-100,Diaion及AB-8中的任意一种，填料装填体积保持为上样溶液体积的2～5倍。以不高于40％的甲醇或乙醇溶液除去杂质，以70％-100％的甲醇或乙醇溶液洗脱富集马兜铃酸类化合物。其中除去杂质的醇洗脱液浓度优选为10％-30％；而富集马兜铃的洗脱醇溶液优选为80％-90％。
以本发明所报道的采用自制大孔吸附树脂柱萃取马兜铃酸，相较文献具有如下优点和进步：
1)本发明报道的预处理方法，相较文献报道的液液萃取、双水相萃取及C18固相萃取，回收率更高，稳定性更好，更适宜微量马兜铃酸的富集和高灵敏测定。
2)本发明报道的预处理方法，采用大孔吸附树脂作为萃取柱的填料，具有价格低廉、可重复利用等优点，同时自制萃取柱不受商品萃取小柱规格所限，可按需装填任意尺寸，具有较大的灵活性。
附图说明
图1几种萃取方法的相对回收率比较。
具体实施方式
现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1几种预处理方法相对回收率的比较
提取：马兜铃果皮10g,加水200mL，浸泡30min后，水浴回流提取2次，第一次20min，第二次15min。合并两次提取液，保温过滤，滤液减压浓缩后定容于25mL容量瓶备用。
四种预处理方法比较：取上述提取液各1mL，用水1:1稀释后，分别采用以下4种预处理方法进行处理，收集目标流份后，N2吹干后用1.5mL甲醇溶解，过膜后UPLC-TOF/MS分析，以马兜铃酸I的含量为指标，比较几种预处理方法的相对回收率。几种预处理流程如下：
1)乙酸乙酯液液萃取：乙酸乙酯萃取3次，1mL*3次，合并3次提取液，N2吹干。
2)乙腈-MgSO4-NaCl双水相萃取：加入2mL乙腈及0.8g MgSO4和0.2g NaCl后，摇匀后超声使完全溶解，静置分层，取上清液，N2吹干。
3)C18SPE：200g C18，先用1.2mL甲醇活化，1.2mL水平衡，上样，先用2.4mL水洗脱除杂，之后采用2.4mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱流份，N2吹干。
4)自制HPD-100SPE：HPD-100填料约2mL，上样，先用3mL水洗脱除杂，之后采用3mL 80％甲醇洗脱，收集80％甲醇洗脱流份，N2吹干。
结果如图1所示，从相对回收率来看，自制HPD-SPE相对回收率最高。
实施例2几种预处理方法相对回收率的比较
提取：同实施例1。
四种预处理方法比较：取上述提取液各1.5mL，用水1:4稀释后，分别采用以下4种预处理方法进行处理，收集目标流份后，N2吹干后用1.5mL甲醇溶解，过膜后UPLC-TOF/MS分析，以马兜铃酸I的含量为指标，比较几种预处理方法的相对回收率。几种预处理流程如下：
2)乙酸乙酯液液萃取：乙酸乙酯萃取3次，1mL*3次，合并3次提取液，N2吹干。
2)乙腈-MgSO4-NaCl双水相萃取：加入2mL乙腈及0.8g MgSO4和0.2g NaCl后，摇匀后超声使完全溶解，静置分层，取上清液，N2吹干。
3)C18SPE：200g C18，先用2mL甲醇活化，2mL水平衡，上样，先用2.4mL水洗脱除杂，之后采用2.4mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱流份，N2吹干。
4)自制AB-8SPE：AB-8填料约2mL，上样，先用6mL水洗脱除杂，之后采用6mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱流份，N2吹干。
结果如图1所示，从相对回收率来看，自制SPE相对回收率最高，而其它3种预处理方法相对回收率较低，且不太稳定。
实施例3几种预处理方法相对回收率的比较
提取：同实施例1。
四种预处理方法比较：取上述提取液各1.5mL，用水1:4稀释后，分别采用以下4种预处理方法进行处理，收集目标流份后，N2吹干后用1.5mL甲醇溶解，过膜后UPLC-TOF/MS分析，以马兜铃酸I的含量为指标，比较几种预处理方法的相对回收率。几种预处理流程如下：
3)乙酸乙酯液液萃取：乙酸乙酯萃取3次，1mL*3次，合并3次提取液，N2吹干。
2)乙腈-MgSO4-NaCl双水相萃取：加入2mL乙腈及0.8g MgSO4和0.2g NaCl后，摇匀后超声使完全溶解，静置分层，取上清液，N2吹干。
3)C18SPE：200g C18，先用2mL甲醇活化，2mL水平衡，上样，先用2.4mL水洗脱除杂，之后采用2.4mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱流份，N2吹干。
4)自制Diaion SPE：Diaion填料约2mL，上样，先用6mL水洗脱除杂，之后采用6mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱流份，N2吹干。
结果如图1所示，从相对回收率来看，自制SPE相对回收率最高，而其它3种预处理方法相对回收率较低，且不太稳定。