本发明属于烟用材料中有害物质残留的理化检验技术领域，主要涉及偶氮染料释放的致癌芳香胺的测定技术，具体说是偶氮染料在柠檬酸缓冲溶液中被连二亚硫酸钠还原成芳香胺，然后经固相萃取净化后，氮吹浓缩，用合相色谱串联质谱联用仪进行测定，内标法定量。
背景技术：
偶氮染料是指分子结构中含有偶氮基-n=n-的染料。通常研究认为，偶氮染料其结构本身通常不会对人体产生有害影响，但有一些用“芳胺类中间体”合成的偶氮染料，因其与人体皮肤长期接触之后，会因人表面皮肤的弱酸环境，极易发生还原反应并使偶氮基断裂，生成大量芳胺类化合物。其反应式如下：
而这类化合物往往存在着严重致癌性，极易使人体细胞诱发病变，对人体皮肤甚至膀胱、输尿管等器官会产生极其严重的致癌损害，是应该被明令禁止的。这种违禁的偶氮染料，也被称为“致癌芳香胺染料”。
目前，禁用偶氮染料的检测是基于检测样品经还原分解后，是否存在有害的芳香胺，继而反推样品是否使用了禁用的偶氮染料。禁用偶氮染料的检测通常需经历以下四步：(1)样品预处理；(2)还原分解，在此过程中偶氮染料与还原剂发生反应；(3)萃取和浓缩，即将还原生成的芳香胺萃取到有机溶剂中，并经浓缩后定容；(4)用先进分析仪器进行检测。
芳香胺的测定方法主要有气相色谱法（gc）[胡庆兰，郑平，段连生.顶空固相萃取-气相色谱法测定水中芳香胺类化合物[j].华中师范大学学报，2012，46(4):452-455.]、气相色谱质谱联用法（gc-ms）[洪小燕，温裕云，林芳，等.土壤及沉积物中25种芳香胺的固-液-液萃取及气相色谱-质谱测定方法初步研究[j].分析测试学报，2010,29(1):31-34.]、液相色谱法（hplc）[王卉卉，牛增元，叶曦雯，等.染色纺织品与皮革制品中23种禁用偶氮染料的高效液相色谱法测定[j].分析测试学报，2009,28(8):944-948.]和液相色谱质谱联用法（lc-ms）[孙银峰，牛增元，叶曦雯，等.液相色谱/质谱法测定电气产品塑料部件中的初级芳香胺[j].分析化学，2009,37(6):861－866.]。但这些方法均存在一定的局限性，gc和hplc通常灵敏度和定性能力较差，因此可能出现假阳性结果。gc-ms和hplc-ms灵敏度较高，具有一定的选择性，但在复杂基质体系中也容易受到基质的干扰，定性能力不如串联质谱。中国专利（201410041729.3）公开了《一种烟用纸张中禁用偶氮染料的测定方法》，其中涉及到芳香胺检测，该专利结合液液萃取和液相色谱串联质谱技术，大大提高了分析灵敏度和检测效率，但是由于这些芳香胺结构相似，且大多数都有同分异构体的现象，所以采用普通的液相色谱并不能将这些芳香胺很好的分离，且偶尔会有假阳性的结果出现，比如2，4-二甲基苯胺和2，6-二甲基苯胺属于同分异构体，普通的液相色谱不能很好的分离。本专利申请采用的超高效合相色谱（ultraperformanceconvergencechromatography,upc2）技术是近年来提出的一种分离技术。该技术基于超临界流体色谱技术原理，其流动相以超临界co2为主要组成，辅助少量的有机溶剂，具有黏度低、传质性能好、分离效率高、绿色环保的优势；同时，该系统基于超高效液相色谱技术平台，以及亚2μm的色谱柱技术，使得仪器的可操控性能、重现性、精密度等方面有较大的进步，特别适合于异构体的分离检测。
技术实现要素：
本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种烟用纸张中偶氮染料释放出的芳香胺残留量的测定方法，即在弱酸性条件下，加入还原液进行还原分解，然后进行固相萃取、氮吹浓缩后直接以合相色谱-串联质谱测定样品中芳香胺，该方法能快速、准确检测烟用纸张中芳香胺，测定结果准确，基质干扰少。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种烟用纸张中偶氮染料释放出的芳香胺残留量的测定方法，具体包括以下步骤：
a、样品的提取：将样品剪成5mm×5mm左右的碎片，混合均匀；称取1.0g样品，将样品置于50ml具塞离心管中，加入15ml预热至70±2℃的柠檬酸缓冲液，猛烈摇动，使液体浸透样品，于70±2℃水浴中放置30min；加入200mg/ml连二亚硫酸钠水溶液3ml，保持70±2℃，反应30min，然后将离心管置于冰水浴中于2min内冷却至室温；
b、样品净化：往离心管中分别加入0.5ml的质量分数为40%的氢氧化钠溶液和100µl内标工作溶液，之后将离心管中的上层液体全部倒入提取柱中，任其吸附10～20min，然后用4*20ml叔丁基甲醚分4次洗提离心管中的下层样品，每次均需混匀叔丁基甲醚和样品，然后将叔丁基甲醚洗液倒入该提取柱中，收集叔丁基甲醚洗脱液于三角瓶中，往三角瓶中加入5～8g的无水硫酸钠；
c、样品浓缩：移取8ml的洗脱液于带刻度的10ml氮吹管中，氮吹至近干，加入1ml的甲醇复溶，进upc2-ms/ms分析；
d、准备标准工作溶液：称取0.01g各芳香胺的标准品到同一个10ml容量瓶中，用甲醇稀释并最终配制成具有浓度梯度的标准工作溶液；
e、合相色谱-串联质谱测定:吸取配制好的不同浓度的标准工作溶液，注入合相色谱-串联质谱仪进行测定；
f、芳香胺残留量测定结果的计算
以内标法进行残留量的定量分析，即以目标物和内标的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.99，对提取后的样品进行测定，测得检出分析物和内标的定量离子对峰面积比，代入标准曲线，求得样品中各种芳香胺的残留量。
本发明所述内标为d9-4-氨基联苯，内标工作溶液的配制方法如下：称取0.01gd9-4-氨基联苯标准品到10ml容量瓶中，用甲醇稀释得到浓度为10μg/ml的内标工作溶液。
所述提取柱为迪马科技的proelutazo固相萃取小柱。
在本发明中，标准工作溶液的配制方式如下：称取10mg标准品到10ml容量瓶中，精确至0.0001g，用甲醇定容，配制成浓度为1.0mg/ml的混合标准储备液；移取该混合标准储备液100μl于10ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，得到浓度约为10μg/ml的工作溶液；分别移取一定体积的工作溶液于10ml容量瓶中，并加入100μl内标工作溶液，用甲醇稀释定容，即配制成不同浓度的标准工作溶液，系列标准工作溶液中各芳香胺的含量分别为：0.5µg，1.0µg，2.0µg，5.0µg和10µg。
合相色谱-串联质谱条件具体如下：色谱柱：规格100mm×3.0mm，1.7µm的upc2fluoro-phenyl柱；流动相：超临界co2/甲醇，流速：2ml/min；梯度洗脱条件如表1；柱温：50℃；背压：1800psi；进样量：2µl；离子源：电喷雾离子源(esi)；扫描方式：正离子扫描；毛细管电压：2.6kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气体流速：800l/h；锥孔气体流速：50l/h；补偿溶剂：0.1%甲酸甲醇溶液，流速为0.2ml/min；检测方式：多离子反应监测（mrm）；mrm参数见表2。
表2质谱条件
本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟用纸张样品优化了样品前处理方法和仪器检测条件。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：
（1）本发明萃取液经过固相萃取，减少了基质的干扰。
（2）本发明方法利用内标法测定烟用纸张中芳香胺的含量，避免了基质效应，抵消了体积变化对定量的影响，而且同时进行定量和定性分析，无需再使用其他仪器进行定性分析。
（3）本发明的标准曲线采用芳香胺的绝对质量作为横坐标，省去了定量过程繁杂的计算过程。
（4）由于芳香胺的结构相近、异构体众多，本发明方法采用合相色谱对芳香胺进行分离，可以降低结构相近的物质对目标物的干扰，使得该方法具有操作准确、回收率高、快速简便及灵敏度高等优点。合相色谱技术是基于超临界流体色谱技术原理，其流动相以超临界co2为主要组成，辅助少量的有机溶剂，具有黏度低、传质性能好、分离效率高、绿色环保的优势，特别适合于异构体的分离检测；采用固相萃取和内标法相结合，洗脱液部分浓缩，大大缩短了浓缩时间，也减少了干扰物的影响。
①本发明方法的检测限：
将不同浓度的标准工作溶液注入upc2－ms/ms，以3倍信噪比（s/n=3）计算检测限（lod），以10倍信噪比（s/n=10）计算检测限（loq），见表3。
②本发明方法的重复性和加标回收率见表3：
在空白样品中加入芳香胺的标准溶液，然后分别按本发明的方法进行前处理和upc2－ms/ms分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表3。由表3可以看出方法稳定性良好，平均相对标准偏差（rsd）小于6%，说明本发明重复性好。
附图说明
图1为本发明的测定方法流程图（该图作为摘要附图）。
具体实施方式
本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
实例1：
1．仪器与试剂：
叔丁基甲醚、甲醇均为色谱级试剂，氢氧化钠，硫酸钠均为分析纯试剂；蒸馏水，符合gb/t6682中一级水的要求。
upc2-ms/ms四极杆串联质谱仪；水浴恒温振荡器；瑞士mettlerae163电子天平（感量：0.0001g）。
2．样品处理：
称取1.0g样品（精确至0.0001g）；将碎片置于50ml具塞三角瓶中，将样品置于50ml具塞离心管中，加入15ml预热至70±2℃的柠檬酸缓冲液，猛烈摇动，使液体浸透样品，于70±2℃水浴中放置30min；加入200mg/ml连二亚硫酸钠水溶液3ml，保持70±2℃，反应30min，然后将离心管置于冰水浴中于2min内冷却至室温；
往离心管中分别加入0.5ml的质量分数为40%的氢氧化钠溶液和100µl内标工作溶液，之后将离心管中的上层液体全部倒入偶氮专用提取柱（即迪马科技的proelutazo固相萃取小柱）中，任其吸附15min，用4*20ml叔丁基甲醚分4次洗提离心管中的下层纸张样品，每次均需混匀叔丁基甲醚和试样，然后将叔丁基甲醚洗液倒入该提取柱中，收集叔丁基甲醚洗脱液于三角瓶中，往三角瓶中加入5～8g的无水硫酸钠，移取8ml的洗脱液于带刻度的10ml氮吹管中，氮吹至1.0ml，进upc2-ms/ms分析；
3.准备标准工作溶液：称取10mg标准品到10ml容量瓶中，精确至0.0001g，用甲醇定容，配制成浓度为1.0mg/ml的标准储备液；移取标准储备液100μl于10ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，得到浓度约为10μg/ml的工作溶液；分别移取一定体积的工作溶液于10ml容量瓶中，并加入100μl内标工作溶液。用甲醇稀释定容，即配制成不同浓度的标准工作溶液，系列标准工作溶液中各芳香胺的含量分别为：0.5µg，1.0µg，2.0µg，5.0µg和10µg；
4.测定方法:以内标法进行残留量的定量分析，即以分析物和内标的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.999，对提取后的样品进行测定，测得检出分析物和内标的定量离子对峰面积比，代入标准曲线，求得样品中的各芳香胺的残留量。求得样品中邻甲苯胺的含量分别是1.52mg/kg。
实例2：
如实施例1所述的测定方法，选择另一烟用纸张样品，样品中对氯苯胺含量为2.25mg/kg。