一种便携大流量高富集的生物气溶胶液相采集方法与流程

本发明涉及一种便携大流量高富集的气溶胶液相采集方法，可以广泛应用于室内外环境气溶胶颗粒的采集检测，特别是病原微生物的快速筛查和监测。

背景技术：

当前空气污染日益受到世界范围的关注，严重威胁着居民健康。空气中除了存在大量化学污染物外，还有大量的生物气溶胶，如细菌、病毒、真菌颗粒等。研究表明诸多健康问题都与空气污染物有关，其中生物气溶胶暴露能造成诸多健康问题，如呼吸系统感染、过敏等，且生物气溶胶的产生、扩散、传播更能加重这一危害，(比如2003年sars，2009年h1n1，2013年h5n9以及2015年mers等重大疫情爆发)。因此对生物气溶胶的快速检测甚至实时监测以发现潜在危险就变得尤为重要。但是作为生物气溶胶快速检测甚至实时监测中的至关重要的第一步，空气样品的快速高效采集一直是一个难题。

以pcr为代表的基因扩增方法的兴起显著降低了生物样品检测的最小浓度，提高了微生物检测的效率，恒温扩增法的出现进一步缩短了反应时间，简化了反应过程；同时，一些基于电化学的生物传感器出现(如硅纳米线场效应晶体管)可以将微生物生物信号无延迟转化为电信号，从而使微生物的自动在线监测变为可能。但是，这些生化技术的使用都需要液体的反应介质，这就要求直接将样品采集到液体并减少后续样品处理工作；同时，空气中致病菌的浓度有时会很低，尤其对于一些高致病病原体，需要采样工作在短时间内采集大量的空气样品。另外，在一些特殊环境(如户外或未知危险因素存在)要求采样器便携、易使用。综合以上，便携、大流量、高富集的液相采集方法对生物气溶胶的研究具有重要意义。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种超高富集率的生物气溶胶采集方法，在尽可能短的时间内将更多的气溶胶颗粒富集到微量的液体中，以便后续分析检测。

本发明的技术方案如下：

一种高富集率的生物气溶胶液相采集方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)在无菌操作台内将无菌的铝箔在培养皿底座中铺平；

b)加入微量的生化试验用矿物油，使用灭菌玻璃棒将矿物油均匀地涂抹在铝箔上使形成厚度至少为50μm的油膜(如使用90mm直径的标准微生物培养皿，则加入至少300μl矿物油，矿物油用量可视采样时间延长而适量增加)，作为采样单元；矿物油是一种来源于矿物的无色，无味的烷烃混合物，通常在分子生物学实验中用作惰性覆盖物减少溶液蒸发。

c)将上述采样单元放入到生物气溶胶采样器中进行采样；

d)采集完毕后，将铝箔用镊子卷成圆筒状(采集面朝内)放入到适当大小的离心管中(如使用90mm直径的标准微生物培养皿及铝箔，则可以使用50ml离心管)；

e)将装有铝箔的离心管放置于离心机中，4000-7000转每分钟，离心1-5分钟；

f)在离心的作用下，矿物油充分与铝箔分离，矿物油连同颗粒物将富集于离心管底部，采样完成。

作为优选实现，其特征在于，在步骤a)中，所述培养皿是与所用生物气溶胶采样器匹配的商业化培养皿。

作为优选实现，其特征在于，在步骤b)中，所述无菌矿物油也可为其他种类，特征为密度小于水，无菌、无热原质，对微生物生长及生化实验无影响。

作为优选实现，其特征在于，在步骤c)中，所述生物气溶胶采样器是指使用琼脂培养基平板的撞击式采样器。

作为优选实现，其特征在于，在步骤e)中，如最终需要的样品环境为无菌水或某种溶液，则在离心前，向离心管中加入所需体积的由目标液体配制成的0.5％吐温20，振荡一分钟后，放入离心机进行离心。

本发明的有益效果：本发明提供的采样方法利用矿物油，实现高富集率的生物气溶胶液相采集，主要特点是：

1)使用矿物油作为采样用液体介质，不易挥发，可以有效避免撞击采样时的二次气溶胶化和减小对微生物的撞击损伤；

2)矿物油粘度大，在各种材料表面铺展开成巨大面积的油膜只需要微量的矿物油，有助于高倍浓缩富集；

3)矿物油对样品的分析检测无任何影响，富集的样品可与生物分析方法来检测微生物，也可以用于过渡金属等化学成分的分析，如有需要也可以根据后续检测的需要通过简单的离心操作将气溶胶颗粒转移到水或缓冲液环境。

附图说明

图1大流量高富集生物气溶胶液相采集方法示意图；

图2大流量高富集生物气溶胶液相采集方法采集样品的qpcr扩增曲线。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例进一步详细描述本发明。

装置设计：所使用的采样方法中使用的采样器为生物气溶胶采样器是指使用琼脂培养基平板的撞击式采样器，如申请人发明的大流量便携式采样器，已申请发明专利(申请号：201611149701.7)。图1中所示的采样器便是该便携式大流量空气采样器；使用的培养皿为与国际标准撞击式采样器匹配的无菌培养皿，直径为90mm。

关键技术：所使用的便携式大流量采样器采样流量大(大于1m³/min)，采集效率高(理论切割直径为1.73μm)，可以短时间内采集大量的空气样品，而所使用的矿物油用量极微(300-600μl)，实现了从大体积空气到微量液体的高富集率采集。除此之外，所使用的的矿物油难挥发、粘滞性高，当环境生物气溶胶颗粒被捕集到矿物油膜表面时，油膜可以减轻由于较高的撞击速度对生物气溶胶颗粒造成的撞击损伤和二次气溶胶化而造成的损失。

使用说明：采样方法的示意图如图1所示，首先将无菌的铝箔铺设在培养皿底座中，用无菌移液器将300μl生化试验用矿物油滴加到铝箔上，使用灭菌玻璃棒将矿物油涂抹均匀，形成一层矿物油膜。之后，将制备好的矿物油膜采样单元放入大流量采样器中进行采样。采样结束后，将铝箔用灭菌的镊子取出后向内卷折，放入50ml离心管。在4000转每分钟条件下进行离心一分钟。在离心的作用下，矿物油充分与铝箔分离，矿物油连同颗粒物将富集于离心管底部。用无菌移液器将管底的矿物油吸出转移到1.5ml离心管中，待后续分析检测使用，如环介导恒温扩增(lamp)和荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)。若后续检测分析要求为水环境，则在将铝箔放入50ml离心管后，向管中加入1ml无菌水或无菌0.5％的吐温20溶液，振荡一分钟后，再放入离心机离心。4000转每分钟，离心一分钟后，液体分层，下层液体为水溶液(样品)，上层为矿物油。使用无菌移液器将下层液体吸出转移到1.5ml离心管中待后续检测使用。

图2显示了使用qpcr方法对在室外环境使用该方法采集样品中的细菌总量进行检测的结果，从结果可以看出该采样方法得到的样品可以被qpcr直接检测，且结果稳定，10min和20min采集到了10⁵-10⁶个细菌，富集率高达10⁷。同时，与直接用无菌水采样相比，长时间采集时矿物油可以明显减少二次气溶胶化而带来的损失。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。