一种基于三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极速测硫化物的方法与流程

本发明属于电分析与传感检测技术领域，涉及一种基于三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极速测硫化物的方法，用于水溶液和血液中硫化物（s2o3^2-、半胱氨酸、sx^2-、s^2-）的速测。

背景技术：

硫化物广泛存在于环境污水中和人体内，其不仅是重要的污染指标，还在生理系统中扮演着至关重要的角色。例如，硫化氢（h2s）不仅是一种来自于工业生产中的有毒、有害气体，研究发现在老鼠、牛以及人的体内存在相对较高浓度的内源性硫化氢，表明硫化氢在生物体内可能有很重要的生理作用,被认为是继一氧化氮（no）和二氧化氮（no2）之后的第三类气体信号分子。h2s在消化系统、心血管系统、泌尿系统、神经系统都有较重要的生理作用，且参与了某些疾病的病理过程。研究表明，硫化氢的含量与唐氏综合症和阿尔兹海默症等疾病相关。近年来研究发现，肿瘤细胞也能产生内源性h2s，并且肿瘤细胞依赖其生存生长。如在结肠癌和卵巢癌等肿瘤细胞中，内源h2s则发挥促进细胞增殖的效应，从而促进肿瘤细胞的生存及生长。此外，含硫醇的化合物，如半胱氨酸也在人体蛋白质合成中扮演着重要的角色，可以作为生物标记物，与多种疾病相关。例如，体内半胱氨酸水平异常可能表明机体出现肝损伤和心血管疾病。而且，据报道，sx^2-可由半胱氨酸代谢产生，因此可作为直接介质与多种疾病相关，如炎症和器官损伤。除此之外，硫代硫酸盐广泛存在与工业废水中，检测硫代硫酸盐成为探索工业污染一个重要部分。因此，硫化物含量对人体健康和环境均具有十分重要的意义。

目前国内外检测硫化氢等硫化物的方法很多，如:经典滴定法、毛细管电泳法、分光光度法、色谱法、质谱法、荧光分析法等。但有些方法存在定量分析效果不好、操作繁琐、准确度不高、耗费时间和成本高等问题，且硫化氢的分解代谢很快，浓度不断波动，以至于很难准确分析。因此，需要一个能快速有效的检测硫化氢等硫化物的新方法。而电化学分析法具有灵敏度高、时间短、高效、进样量小、操作简便和成本低等诸多优点。所以使用电化学方法检测硫化物在未来的研究领域内具有广阔的发展前景。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的上述不足，一种基于三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极速测硫化物的方法，通过导电纳米材料的制备，采用三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极，并将其应用到血液中硫化物的直接速测分析。本发明检测方法为在含较高浓度氯离子的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中，利用复合材料中纳米银与氯离子作用生成氯化银，电极获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，借助加入硫化物后氯化银被置换成硫化银，引起其相应的电信号峰值的大幅度降低，通过对比硫化物使其电流信号减弱的程度，直接判断水溶液和血液中硫化物（s^2-、半胱氨酸、sx^2-、s2o3^2-）的含量，具有用量少、成本低、快速、灵敏等特点，克服了现有技术在硫化物的测定方面存在的诸多缺点。

本发明技术方案如下：

一种基于三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极速测硫化物的方法：首先通过三聚氰胺与硝酸银反应制备具有高导电性的三聚氰胺纳米银复合材料，然后加入全氟磺酸溶液（nafion），利用其成膜特性，将三聚氰胺纳米银复合材料固定于玻碳电极表面；在氯离子浓度为20～180mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs）底液中，固定于玻碳电极表面的三聚氰胺纳米银复合材料中的纳米银与氯离子作用生成氯化银，玻碳电极获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，氯化银被待测样品的硫化物置换成硫化银，引起其相应的电信号峰值的大幅度降低，从而实现对硫化物的快速测定。

优选地，所述的硫化物为半胱氨酸或者含有s^2-、sx^2-、s2o3^2--离子的硫化物。

上述基于三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极速测硫化物的方法，具体包括以下步骤：

1）制备三聚氰胺纳米银复合材料

将三聚氰胺加入到水中，加热溶解为10～60mm的水溶液，冷却至室温，搅拌下加入浓度为10～60mm硝酸银水溶液，混匀，静置，离心，超纯水和乙醇各洗涤3次，烘干,制得三聚氰胺纳米银复合材料；

优选地，步骤1）中，三聚氰胺在水中的加热溶解温度为70℃，所述的静置时间为1～2h；所述的烘干温度为40℃。

优选地，步骤1）中，三聚氰胺水溶液和硝酸银水溶液体积比为1:1；

优选地，步骤1）中，三聚氰胺水溶液浓度为40mm，硝酸银水溶液浓度为20mm。当三聚氰胺的用量多于硝酸银时，sem图显示其形貌为线状，当三聚氰胺的用量少于硝酸银时，sem图显示其形貌为棒状。经电化学线性扫描发现形貌为线状时，其在pbs中的电化学稳定性较好。

2）修饰电极

将制得的三聚氰胺纳米银复合材料分散到超纯水中得三聚氰胺纳米银复合材料水分散液，然后加入全氟磺酸溶液，混匀后，用移液枪移取并修饰到电极表面，自然晾干，得三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极；

优选地，步骤2）中，三聚氰胺纳米银复合材料在超纯水中的分散浓度为1.0～8.0mg/ml，最优选浓度为5.0mg/ml；

优选地，步骤2）中，全氟磺酸溶液与三聚氰胺纳米银复合材料水分散液体积比为1:50，所述的全氟磺酸溶液为5%nafion溶液；

优选地，步骤2）中，修饰到电极表面上的三聚氰胺纳米银复合材料的体积为2.5μl；

优选地，步骤2）中，所述的电极为玻碳电极。

3）测定待测样品中硫化物含量

ⅰ）溶液配制

配制浓度梯度含待测硫离子的标准溶液：待测硫离子标准品溶液加入到pbs缓冲溶液中，逐级稀释为硫离子的浓度范围为0.5～512μm的标准溶液；

配制浓度梯度含硫离子的待测样品溶液：取5毫升血浆样品，加入edta后在离心管中3000rpm离心15分钟，收集上清液，取500微升上清液，加入稀盐酸，以三苯基膦为催化剂，加入乙腈，存在于样品中的蛋白质产生沉淀，用离心机6000rpm离心20min后除去蛋白质沉淀，收集上清液；用体积比1:1的水/乙腈溶液稀释至2ml后加入到pbs缓冲溶液中，逐级稀释为0.5～512μm的浓度梯度含硫离子的待测样品溶液溶液；

ⅱ）建立标准曲线

将步骤2）中制得的三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极通过三电极体系在含氯离子浓度为20～180mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中进行线性扫描，通过三聚氰胺纳米银复合材料中纳米银与氯离子作用生成氯化银，电极获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，然后加入配制的浓度梯度含待测硫离子的标准溶液，将氯化银置换成硫化银，引起其相应的电信号峰值的大幅度降低，进而通过对比两组电信号峰的差值，得到硫离子浓度-峰电流差值的标准曲线；

ⅲ）待测样品中硫离子含量的测定

将步骤2）中制得的三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极通过三电极体系在氯离子浓度为20～180mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中进行线性扫描，通过三聚氰胺纳米银复合材料中纳米银与氯离子作用生成氯化银，电极获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，然后加入配制的浓度梯度含硫离子的待测样品溶液，通过对比两组电信号峰的差值，根据硫离子浓度-峰电流差值的标准曲线，确定硫离子含量。

优选地，步骤3）中，所述pbs缓冲溶液ph为2～12，最优选ph为4～8；

优选地，步骤3）中，磷酸盐缓冲溶液中氯离子浓度为140mm。

步骤3）中，检测电位范围为-0.2～0.8v，扫描速度为100mv/s。

本发明方法中，若无特别指出，步骤1）、2）中的溶液，溶剂均为超纯水；步骤3）中的溶液，溶剂均为ph2～12的pbs缓冲液。

基于三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极速测硫化物的方法,优选用于水溶液和血液中硫化物的速测。

本发明基于三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极速测硫化物的方法，并应用于硫化物的速测，其基本原理：

纳米材料具有不同于其他材料的特殊性能，被广泛应用于分析领域。不同种类的纳米材料，如：金属、金属氧化物、半导体纳米材料以及碳纳米材料已经被用于电化学传感及生物传感的制备。金属纳米材料能较好的克服电化学传感中修饰电极的一些问题，如：灵敏度低、重现性差、电子转移慢等。银在所有的金属中展现出较高的电导率，因此，对比其他的金属纳米材料，银纳米材料能较好的促进电子转移，提高效率。

三聚氰胺（melamine），其分子中存在三个自由氨基同时在芳香环上还另外含有三个带有孤对电子的氮原子。基于芳香胺聚合物上的自由氨基对银离子的高效氧化还原作用以及络合作用选取价廉易得的三聚氰胺化合物作为基本原料合成三聚氰胺纳米银复合材料。

将三聚氰胺纳米银复合材料修饰于电极表面，进而利用三聚氰胺纳米银复合材料对硫化物的特异识别反应引起的电信号线性变化，建立一种直接、快速的定量检测硫化物的方法，即：通过三聚氰胺与硝酸银反应制备具有高导电性的三聚氰胺纳米银复合材料，进而利用全氟磺酸溶液（nafion）的成膜特性，将该纳米复合材料固定于玻碳电极表面，在含较高浓度氯离子的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中，利用复合材料中纳米银与氯离子作用生成氯化银，电极获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，借助加入硫化物后氯化银被置换成硫化银，引起其相应的电信号峰值的大幅度降低，从而实现对废水和血液中硫化物（s^2-、半胱氨酸、sx^2-、s2o3^2-）的快速测定。基于此，本发明提出了一种三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极速测硫化物的方法，并应用于快速准确的检测水溶液和血液中硫化物（s2o3^2-、半胱氨酸、sx^2-、s^2-）。

本发明基于三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极快速检测硫化物的方法，与现有大型经典仪器分析技术相比，其有益效果在于：

（1）本发明快速检测方法通过在玻碳电极上修饰具有高导电性的三聚氰胺纳米银复合材料，然后通过该复合材料中纳米银与氯离子作用生成氯化银，电极获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，借助加入硫化物后氯化银被置换成硫化银，引起其相应的电信号峰值的大幅度降低，从而实现对硫化物的定量分析，操作简单，不涉及复杂的操作和大型仪器的使用，且通过引入固相agcl信号，增强了选择性和灵敏度；

（2）本发明中用于检测硫化物的三聚氰胺纳米银复合材料具有合成方法简单、原料廉价、易得、比表面积大等优点；

（3）本发明采用的三电极体系具有廉价、便携的特点，既是检测器，又是功能识别分子的固定化载体；其定量方式直观、快捷，通过扫描得出的电信号峰的高度变化来直接定量待测液中硫化物浓度，进而通过对比电信号峰的差值得出定量结果；其检测结果与其它大型仪器的经典检测方法的定量结果相一致；

（4）本发明操作简单、检测时间短、灵敏度高，且具有较高的选择性，并适于对血液等复杂样品中硫化物（s^2-、半胱氨酸、sx^2-、s2o3^2--）含量的快速、灵敏、微量化以及可现场应用的速测。

附图说明

图1为本发明基于三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极快速检测硫化物的方法的原理和过程示意图，（其中a为原理图，b为过程图）；

图2为不同材料的扫描电镜（sem）表征图：(a)ag-ma(1:1)纳米棒、(b)ag-ma(1:2)纳米线（nws）、(c)ag-manws-cl^-、(d)ag-manws-cl^--s^2-；

图3为血液样品中硫离子浓度-峰电流差值标准曲线；

图4为血液样品中多硫化物浓度-峰电流差值标准曲线；

图5为血液样品中半胱氨酸浓度-峰电流差值标准曲线；

图6为废水样品中硫代硫酸根浓度-峰电流差值标准曲线。

图7为修饰电极制备的伏安图（a为不同修饰电极在磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安图，b为硫化物存在时不同修饰电极在磷酸盐缓冲溶液中的线性伏安图）；

图8为ma-agnps修饰电极在不同浓度氯离子含量的磷酸盐缓冲溶液中的响应考察（a为电位变化的线性扫描图，b为电流变化趋势）；

图9为三聚氰胺纳米银复合材料对不同干扰物质响应的峰电流差值的考察（a为阴离子，b为阳离子，c为氨基酸，d为硫化物）。

具体实施方式

通过结合具体实施例描述本发明，在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。

实施例1：血液中硫离子含量的速测

1）制备三聚氰胺纳米银复合材料

准确称取0.0504g三聚氰胺于10ml超纯水中，70℃下加热溶解，得到浓度为40mm的三聚氰胺水溶液，冷却至室温后，搅拌下加入10ml20mm的硝酸银水溶液，混匀，静置1h，离心，超纯水和乙醇各洗涤3次，40℃下烘干。

2）修饰电极

取制得的三聚氰胺纳米银复合材料5mg分散到1ml超纯水中，并加入20μl5%的全氟磺酸溶液（市售含量为5%），混匀，用移液枪移取2.5μl，将其修饰到电极表面，自然晾干，得三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极。

3)溶液配制

配制浓度梯度含待测硫离子的标准溶液：待测硫离子标准品溶液加入到pbs缓冲溶液中，逐级稀释为硫离子的浓度范围为0.5～512μm的标准溶液；

配制浓度梯度含硫离子的待测样品溶液：参考现有方法：取人血浆样品（5毫升），加入edta后在离心管中3000rpm离心15分钟。收集上清液（血浆）并用作进一步研究。收集的上清液（血浆）取500微升加入稀盐酸后，以三苯基膦为催化剂，加入乙腈，存在于样品中的蛋白质产生沉淀，用离心机（6000rpm）离心20min后除去蛋白质沉淀，收集上清液。用体积比1:1的水/乙腈溶液稀释至2ml后加入到pbs缓冲溶液中，逐级稀释为0.5～512μm的浓度梯度含硫离子的待测样品溶液溶液。

4）测定待测样品中硫化物含量

ⅰ）标准曲线

用处理过的血浆样品配制浓度梯度含待测硫离子的标准溶液：待测硫离子标准品溶液加入到pbs缓冲溶液中，逐级稀释为硫离子的浓度范围为0.5～512.0μm的标准溶液；将步骤1）中制得的三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极通过三电极体系在10mlph为6，氯离子浓度为140mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中进行线性扫描，检测电位范围为-0.2～0.4v，扫描速度为100mv/s。获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，然后分别加入10μl浓度梯度含待测硫离子的标准溶液中，引起其相应的电信号峰值降低，通过对比两组电信号峰的差值，得到硫离子浓度-峰电流差值的标准曲线及其定量方程式y=1.555+2.811x，如图3所示。

ⅱ）待测样品中硫离子含量的测定

配制含未知浓度硫离子的待测样品溶液，将三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极通过三电极体系在10mlph为6，氯离子浓度为140mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中进行线性扫描，检测电位范围为-0.2～0.4v，扫描速度为100mv/s。获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，然后加入未知浓度含硫离子的待测样品溶液，通过对比两组峰电流的值，得到其差值，根据硫离子浓度-峰电流差值的标准曲线，将高度差值带入方程式y=1.555+2.811x中，计算得到的㏒[s^2-]浓度，然后将其换算成浓度数值。将结果与色谱法的检测结果进行对比，发现并无明显差异，证明该方法具有较好的准确性，结果详见表1。

表1本方法与色谱法对s^2-检测结果的比较

实施例2：血液中多硫化物含量的速测

步骤1）、2）、3）同实施例1；

4）测定待测样品中硫化物含性。

ⅰ）多硫化物的速测标准曲线

用处理过的血浆样品配制浓度梯度含待测多硫化物的标准溶液：待测硫离子标准品溶液加入到pbs缓冲溶液中，逐级稀释为多硫化物的浓度范围为1.0～576.0μm的标准溶液；将三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极通过三电极体系在10mlph为6，氯离子浓度为140mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中进行线性扫描，，检测电位范围为-0.2～0.4v，扫描速度为100mv/s。获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，然后分别加入10μl浓度梯度的多硫化物标准溶液，引起其相应的电信号峰值降低，通过对比两组电信号峰的差值，得到多硫化物浓度-峰电流差值的标准曲线及其定量方程式y=-0.4763+3.374x，如图4所示。

ⅱ）待测样品中多硫化物含量的测定

配制含未知浓度多硫化物的待测样品溶液，将步骤1）中制得的三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极通过三电极体系在10mlph为6，氯离子浓度为140mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中进行线性扫描，检测电位范围为-0.2～0.4v，扫描速度为100mv/s。获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，然后加入未知浓度含多硫化物的待测样品溶液，通过对比两组峰电流的值，得到其差值，根据多硫化物浓度-峰电流差值的标准曲线，将高度差值带入方程式y=-0.4763+3.374x中，计算得到的㏒[sx^2-]浓度，然后将其换算成浓度数值。将结果与色谱法的检测结果进行对比，发现并无明显差异，证明该方法具有较好的准确性，结果详见表2。

表2本方法与色谱法对sx^2-检测结果的比较

实施例3：血液中半胱氨酸含量的速测

步骤1）、2）、3）同实施例1；

4）测定待测样品中硫化物含量

ⅰ）半胱氨酸的速测标准曲线

用处理过的血浆样品配制浓度梯度含待测半胱氨酸的标准溶液：待测硫离子标准品溶液加入到pbs缓冲溶液中，逐级稀释为半胱氨酸的浓度范围为0.5～400.0μm的标准溶液；将三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极通过三电极体系在10mlph为6，氯离子浓度为140mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中进行线性扫描，，检测电位范围为-0.2～0.4v，扫描速度为100mv/s。获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，然后分别加入10μl浓度梯度的半胱氨酸标准溶液，引起其相应的电信号峰值降低，通过对比两组电信号峰的差值，得到半胱氨酸浓度-峰电流差值的标准曲线及其定量方程式y=0.9121+3.314x，如图5所示。

ⅱ）待测样品中半胱氨酸含量的测定

配制含未知浓度半胱氨酸的待测样品溶液，将步骤1）中制得的三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极通过三电极体系在10mlph为6，氯离子浓度为140mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中进行线性扫描，检测电位范围为-0.2～0.4v，扫描速度为100mv/s。获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，然后加入未知浓度含半胱氨酸的待测样品溶液，通过对比两组峰电流的值，得到其差值，根据半胱氨酸浓度-峰电流差值的标准曲线，将高度差值带入方程式y=0.9121+3.314x中，计算得到的㏒[cys]浓度，然后将其换算成浓度数值。将结果与色谱法的检测结果进行对比，发现并无明显差异，证明该方法具有较好的准确性，结果详见表3。

表3本方法与色谱法对半胱氨酸检测结果的比较

实施例4：废水中硫代硫酸根含量的速测

步骤1）、2）、3）同实施例1；

4）测定待测样品中硫化物含量

ⅰ）硫代硫酸根的速测标准曲线

用从当地取得的废水样品配制浓度梯度含待测硫代硫酸根的标准溶液：待测硫离子标准品溶液加入到pbs缓冲溶液中，逐级稀释为硫代硫酸根的浓度范围为0.5～384.0μm的标准溶液；将三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极通过三电极体系在10mlph为6，氯离子浓度为140mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中进行线性扫描，检测电位范围为-0.2～0.4v，扫描速度为100mv/s。获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，然后分别加入10μl浓度梯度的硫代硫酸根标准溶液，引起其相应的电信号峰值降低，通过对比两组电信号峰的差值，得到硫代硫酸根浓度-峰电流差值的标准曲线及其定量方程式y=1.384+3.394x，如图6所示。

ⅱ）待测样品中硫代硫酸根含量的测定

配制含未知浓度硫代硫酸根的待测样品溶液，将步骤1）中制得的三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极通过三电极体系在10mlph为6，氯离子浓度为140mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中进行线性扫描，检测电位范围为-0.2～0.4v，扫描速度为100mv/s。获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，然后加入未知浓度含硫离子的待测样品溶液，通过对比两组峰电流的值，得到其差值，根据硫代硫酸根浓度-峰电流差值的标准曲线，将高度差值带入方程式y=1.384+3.394x中，计算得到的㏒[s2o3^2-]浓度，然后将其换算成浓度数值。将结果与色谱法的检测结果进行对比，发现并无明显差异，证明该方法具有较好的准确性，结果详见表4。

表4本方法与色谱法对s2o3^2-检测结果的比较

一、基于三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极速测硫化物的方法的响应性能比较。

采用本发明中三聚氰胺纳米银复合材料作为功能识别材料，在不含氯离子的磷酸盐缓冲溶液中该材料单独作为探针与硫离子作用时，并无明显的峰电流降低现象；但在含较高浓度氯离子的磷酸盐缓冲溶液（pbs）中时，复合材料中纳米银与氯离子作用生成氯化银，电极获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，加入硫化物后氯化银被置换成硫化银，引起其相应的电信号峰值的大幅度降低，从而实现对硫化物的特异性响应，详见图7。此外，氯离子浓度不同对agcl的峰电流的大小和电位的高低均有影响，随着氯离子浓度的增大，峰电位逐渐接近于0，峰电流逐渐增大，当氯离子浓度达到140mm时，峰电位和峰电流趋于稳定，详见图8。

二、基于三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极速测硫化物的方法的检测选择性

将表面修饰了三聚氰胺纳米银复合材料的玻碳电极在pbs缓冲溶液中进行线性扫描，获得尖锐的ag/agcl固相电信号响应峰，然后分别加入可能存在的不同的干扰物质进行检测，干扰物质包括f^-、cl^-、br^-、po4^3-、co3^2-、so3^2-、so4^2-、、k⁺、ca²⁺、na⁺、mg²⁺、nh4⁺、zn²⁺、fe³⁺、cu²⁺、cr²⁺、ba²⁺、pb²⁺、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。结果表明，三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极对s^2-、半胱氨酸、sx^2-、s2o3^2--等硫化物有不同程度的响应，对其它离子和氨基酸的响应远远低于这些硫化物。因此，三聚氰胺纳米银复合材料修饰电极对硫化物具有较高的特异性响应，其它常见离子和氨基酸干扰较小，详见图9。