一种基于钴纳米颗粒检测蛋白浓度的方法与流程

本发明属于分析检测技术领域，涉及一种基于钴纳米颗粒检测蛋白浓度的方法。

背景技术：

现有化学发光检测蛋白质的方法包括直接化学发光、酶促化学发光和电化学发光三种：(1)直接化学发光法将能够产生化学发光信号的分子直接标记在抗体上，加入相关反应物，产生化学发光信号；(2)酶促化学发光利用酶标抗体，底物等产生化学发光信号；(3)电化学发光是利用电化学反应和相关底物产生化学发光信号。

但是，上述现有技术存在以下缺陷：(1)直接化学发光法直接利用相关分子产生的化学发光信号，没有涉及催化反应等信号放大步骤，灵敏度不够精准；(2)酶促化学发光法涉及酶标抗体，需要考虑酶活性等对检测结果的影响，检测要求较高；(3)电化学发光法中涉及了电化学反应，检测仪器比前述两种更复杂，分析成本高。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种基于钴纳米颗粒和化学发光检测蛋白浓度的高灵敏方法，具有可方便快捷检测、分析成本低、不需要较大型分析仪器、灵敏度更高、检测结果准确率高的特点，尤其适用于生物大分子，如包括蛋白质、核酸等样品的高灵敏检测。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于钴纳米颗粒检测蛋白浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，使用钴纳米颗粒修饰待检测样品的抗体，得到钴纳米颗粒修饰抗体溶液；

步骤二，将待测样品的单克隆抗体分别加入到96孔板的实验孔中，恒温静置过夜，将实验孔分为两组；

步骤三，弃去步骤二中第一组实验孔中所得到的上层溶液，使用加吐温的磷酸盐缓冲液清洗96孔板中的试验孔；再向96孔板中第一组的每个实验孔中加入相同体积的、不同蛋白浓度的标准样品，恒温静置；

步骤四，弃去步骤二中第二组实验孔中所得到的上层溶液，使用加吐温的磷酸盐缓冲液清洗96孔板中的试验孔；再向96孔板中的第二组的每个实验孔中加入待测样品，恒温静置；

步骤五，分别弃去步骤三的第一组实验孔和步骤四的第二组实验孔中所得到的上层溶液，再使用加吐温的磷酸盐缓冲液清洗96孔板的实验孔；再向96孔板中的每个实验孔加入步骤一中所得钴纳米颗粒修饰抗体溶液，恒温静置；

步骤六，弃去步骤五第一组、第二组实验孔中所得到的上层溶液，使用加吐温的磷酸盐缓冲液清洗96孔板的实验孔；再向96孔板中的每个实验孔加入无机酸水溶液，震荡；

步骤七，从步骤六第一组、第二组每个实验孔中各取出相同体积的所得溶液，加入相对应至苏木精碱性溶液中；

步骤八，检测第一组中不同蛋白浓度的标准样品的化学发光信号值，并根据浓度和发光信号值的关系做出定量曲线；

步骤九，检测第二组中待测样品的发光信号值，将其信号值代入步骤八中所得的定量曲线中，得出待测样品中的蛋白浓度。

作为优选方式，所述步骤一中，使用钴纳米颗粒修饰待检测物质抗体的方法如下：

(1)将钴纳米颗粒溶液与待测样品多克隆抗体溶液混合，震荡；

(2)离心除去上述(1)中所得上清液，收集钴纳米颗粒修饰后的抗体，再用磷酸盐缓冲液重新分散，得到钴纳米颗粒修饰抗体溶液；

作为优选方式，上述(1)中钴纳米颗粒与待测样品多克隆抗体的质量比是1～1000:1；粉末态钴纳米颗粒溶解于磷酸盐缓冲液中；钴纳米颗粒的粒径为10nm或20nm或50nm或100nm。

作为优选方式，所述步骤一中，使用钴纳米颗粒修饰待检测物质抗体的方法如下：

(1)将带正电的高分子聚乙烯亚胺溶液与钴纳米颗粒溶液混合，震荡；

(2)离心除去上述(1)中所得上清液，收集修饰后的钴纳米颗粒；修饰后的钴纳米颗粒用磷酸盐缓冲液重新分散，得到修饰后的钴纳米颗粒溶液；

(3)向上述(2)中所得钴纳米颗粒溶液中加入待测样品的多克隆抗体溶液中，利用静电吸附将钴纳米颗粒修饰在抗体的表面，再离心收集钴纳米颗粒修饰后的抗体。

作为优选方式，上述(1)中带正电的高分子pei的浓度为10～500mg/ml；上述(1)中钴纳米颗粒溶液的浓度为0.1～100mg/ml；上述(2)中磷酸盐缓冲液的ph为5-9；上述(3)中多克隆抗体溶液的浓度为0.5～2mg/ml。

作为优选方式，所述步骤三中的标准样品是浓度为0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20ng/ml的肌酸激酶同工酶溶液。

作为优选方式，所述步骤二中，在2～8℃温度下恒温静置过夜。

作为优选方式，所述步骤三中，37℃恒温静置1～4h。

作为优选方式，所述步骤四或步骤五中，37℃恒温静置0.5～2h。

作为优选方式，所述步骤五中，所述无机酸为浓度为5～20mmol/l的硫酸或硝酸或盐酸；所述步骤六中，震荡时间为5～20min。

本发明提供一种基于钴纳米颗粒检测蛋白浓度的方法，与现有设计相比，其优点在于：(1)本发明通过将钴纳米颗粒修饰在抗体表面，通过钴纳米颗粒释放钴离子，因一个几十纳米钴颗粒可以释放大量钴离子，钴离子可使催化底物苏木精产生更强的化学发光信号，相比现有技术检测方法中的颜色信号或荧光信号，本发明的化学发光信号使检测灵敏度更高，灵敏度检出限可达到0.01ng/ml。(2)本发明根据标准样品的发光信号与其蛋白浓度的关系作出定量曲线后，后续仅需测定相应待测样品的发光信号，即可快速准确得出待测样品的蛋白浓度，检测方法方便快捷，检测结果准确率高。(3)本发明方法所用的多种试剂均是普通化学试剂，不需要较大型分析仪器，操作简单，分析成本低。

具体实施方式

本发明基于钴纳米颗粒检测蛋白浓度的方法可以检测多种生物蛋白，只需满足待测蛋白样品的抗体是可以买到或制备即可，本实施例生物蛋白以肌酸激酶同工酶(下文简称ck-mb)为例。

本发明实施例1-3使用市售的、ck-mb含量为0.04ng/ml的待测样品a和含量为0.5ng/ml的待测样品b，ck-mb使用磷酸盐缓冲液(简称pbs缓冲液)配制。

实施例1

本发明提供一种基于钴纳米颗粒检测蛋白浓度的方法，包括以下步骤：

步骤一，使用钴纳米颗粒修饰ck-mb的抗体，本实施例利用钴纳米颗粒大的比表面积、表面能高的特点，易于吸附抗体，该步骤的作用就是让抗体吸附在钴纳米颗粒表面，后续释放钴离子，增强化学发光信号，提高检测灵敏度，方法如下：

(1)将500μl使用ph值为7.2的pbs缓冲液溶解的、浓度为0.1mg/ml的钴纳米颗粒溶液与50μl浓度为1mg/ml的ck-mb的多克隆抗体溶液混合，置于2ml的离心管内，震荡2小时；其中，钴纳米颗粒为粉末状，其粒径可以为10nm或20nm或50nm或100nm，本实施例中使用粒径为50nm的钴纳米颗粒；多克隆抗体溶液的溶剂是pbs缓冲液；加入ck-mb的多克隆抗体溶液可以识别待检测蛋白；

(2)离心除去上述(1)中上清液，收集钴纳米颗粒修饰后的抗体，再用5000μlpbs缓冲液重新分散，得到钴纳米颗粒修饰抗体溶液，备用；

步骤二，将100μl浓度为0.005mg/ml的ck-mb的单克隆抗体溶液分别加入到96孔板的14个实验孔中，恒温静置过夜，恒温的温度可以是2～8℃，本实施例中的恒温温度是4℃；分两组分别实验。此步骤为了让ck-mb的单克隆抗体通过物理吸附吸附在96孔板上，用于后续捕获待检测物。

步骤三，弃去步骤二中第一组实验孔中所得到的上层溶液，使用200μl加吐温的磷酸盐缓冲液(下文简称pbst缓冲液)清洗两次96孔板中的实验孔；再向96孔板中第一组的12个实验孔中依次加入100μl浓度为0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20ng/ml的溶剂为pbs缓冲液的ck-mb溶液，37℃恒温静置，恒温静置的时间可以为1～4小时，本实施例中恒温静置2小时。

步骤四，弃去步骤二中第二组2个实验孔中所得到的上层溶液，使用200μlpbst清洗两次96孔板中的实验孔；再向96孔板中的2个实验孔中依次加入100μl待测样品a和100μl待测样品b，37℃恒温静置，恒温静置的时间可以为0.5～2小时，本实施例中恒温静置1小时。

步骤五，分别弃去步骤三和步骤四实验孔中所得到的上层溶液，使用200μlpbst清洗两次96孔板的实验孔；再向96孔板中的每个实验孔加入100μl浓度为10μg/ml的步骤一中所得钴纳米颗粒修饰抗体溶液，37℃恒温静置，恒温静置的时间可以为0.5～2小时，本实施例中恒温静置1小时。此步骤的作用是让钴纳米颗粒修饰抗体和待检测物相互作用，后续才能释放钴离子，产生化学发光信号，进行检测。

步骤六，弃去步骤五实验孔中所得到的上层溶液，使用200μlpbst清洗三次96孔板；再向96孔板中的每个实验孔加入10μl浓度为10mmol/l的稀硝酸，震荡，震荡时间可以为5～20min，本实施例中震荡时间为10min。使用稀硝酸、盐酸、硫酸等无机酸可以溶解释放钴纳米颗粒中的钴离子。

步骤七，从步骤六第一组、第二组每个实验孔中各取出10μl所得溶液，加入至苏木精碱性溶液中。本发明中苏木精碱性溶液采用以下溶液混合制得混合液：2.5ml无水乙醇配置的浓度为0.005mol/l苏木精溶液，2.5ml水配置的浓度为2.58mol/l的h2o2，0.2ml水配置的浓度为1mol/l的koh溶液。在碱性反应环境下，钴离子催化苏木精产生更强的化学发光信号，钴离子是催化剂，一个几十纳米的钴纳米颗粒含有上万个钴离子，实现信号放大的作用。

步骤八，使用biotek多功能酶标仪(synergyh1)检测第一组中12个已知浓度的ck-mb标准样品的化学发光信号值，并根据其浓度和发光信号值的关系做出定量曲线；见表1，图1。

步骤九，使用biotek多功能酶标仪(synergyh1)检测第二组中待测样品a和待测样品b的发光信号值，将其信号值代入步骤八所得的定量曲线中，得出待测样品中ck-mb的浓度。

如图1所示，本发明实施例1的定量曲线方程为：y＝118674.4x+14252.7，其中，r²＝0.999；测得待测样品a、b的发光信号值分别为19305.7、69105.6，由上述定量曲线方程得出待测样品a、b中的ck-mb浓度分别是0.043ng/ml、0.46ng/ml，与其已知浓度0.04ng/ml、0.5ng/ml相比，相对误差为7.5％，8％。

实施例2

本发明提供一种基于钴纳米颗粒检测蛋白浓度的方法，本发明实施例2与实施例1的方法基本相同，所不同的是钴纳米颗粒溶液的浓度，包括以下步骤：

步骤一，使用钴纳米颗粒修饰ck-mb的抗体，本实施例利用钴纳米颗粒大的比表面积直接吸附抗体，因钴纳米颗粒比表面积大，表面能高，易于蛋白质的吸附，方法如下：

(1)将500μl使用pbs溶解的、浓度为100mg/ml的钴纳米颗粒溶液与50μl浓度为1mg/ml的ck-mb的多克隆抗体溶液混合，置于2ml的离心管内，震荡2小时；其中，钴纳米颗粒为粉末状，其粒径可以为10nm或20nm或50nm或100nm，本实施例中使用粒径为50nm的钴纳米颗粒。

(2)离心除去上述(1)中上清液，收集钴纳米颗粒修饰后的抗体，再用5000μlpbs缓冲液重新分散，得到钴纳米颗粒修饰抗体溶液，备用；

步骤二，将100μl浓度为0.005mg/ml的ck-mb的单克隆抗体溶液分别加入到96孔板的14个实验孔中，4℃恒温静置过夜，分两组分别实验。

步骤三，弃去步骤二中第一组12个实验孔中所得到的上层溶液，使用200μlpbst清洗两次96孔板中的实验孔；再向96孔板中的12个实验孔中依次加入100μl浓度为0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20ng/ml的ck-mb溶液，37℃恒温静置2小时。

步骤四，弃去步骤二中第二组2个实验孔中所得到的上层溶液，使用200μlpbst清洗两次96孔板中的实验孔；再向96孔板中的2个实验孔中依次加入100μl待测样品a和100μl待测样品b，37℃恒温静置1小时。

步骤五，分别弃去步骤三和步骤四实验孔中所得到的上层溶液，使用200μlpbst清洗两次96孔板的实验孔；再向96孔板中的每个实验孔加入100μl浓度为10μg/ml的步骤一中所得钴纳米颗粒修饰抗体溶液，37℃恒温静置1小时。

步骤六，弃去步骤五实验孔中所得到的上层溶液，使用200μlpbst清洗三次96孔板；再向96孔板中的每个实验孔加入10μl浓度为10mmol/l的稀硝酸，震荡10min。

步骤七，从步骤六第一组、第二组每个实验孔中各取出10μl所得溶液，加入至苏木精碱性溶液。

步骤八，使用biotek多功能酶标仪(synergyh1)检测第一组中12个已知浓度的ck-mb标准样品的化学发光信号值，并根据其浓度和发光信号值的关系做出定量曲线；见表1，图2。

步骤九，使用biotek多功能酶标仪(synergyh1)检测第二组中待测样品a和待测样品b的发光信号值，将其信号值代入步骤八所得的定量曲线中，得出待测样品中ck-mb的浓度。

如图2所示，本发明实施例2的定量曲线方程为：y＝122670.6x+11874.2，其中，r²＝0.999；测得待测样品a、b的发光信号值分别为17208.2、70025.3，由上述定量曲线方程得出待测样品a、b中的ck-mb浓度分别是0.043ng/ml、0.47ng/ml，即相对误差为7.5％，6％。

实施例3

本发明提供一种基于钴纳米颗粒检测蛋白浓度的方法，本发明实施例2与实施例1的放发基本相同，所不同的是使用钴纳米颗粒修饰待检测物质的抗体方法，包括以下步骤：

步骤一，使用钴纳米颗粒修饰待检测物质的抗体，本实施例利用静电吸附法将抗体修饰在钴纳米颗粒表面，因钴纳米颗粒比表面积大，表面能高，易于包覆高分子，方法如下：

(1)将500μl浓度为100mg/ml的带正电的高分子聚乙烯亚胺溶液(简称pei)与500μl使用pbs溶剂溶解的、浓度为10mg/ml的钴纳米颗粒溶液混合，置于2ml的离心管内，室温震荡2h；其中，带正电的高分子聚乙烯亚胺溶液(简称pei)的浓度为10～500mg/ml；钴纳米颗粒溶液的浓度可以为0.1～100mg/ml；钴纳米为粉末状，其粒径可以为10nm或20nm或50nm或100nm，本实施例中使用粒径为50nm的钴纳米颗粒；此步骤采用物理吸附，钴纳米颗粒比表面积大，表面能高，易于包覆高分子；

(2)离心除去上述(1)中所得到的上清液，收集修饰后的钴纳米颗粒；修饰后的钴纳米颗粒用500μlpbs重新分散，得到修饰后的钴纳米颗粒溶液；其中，pbs缓冲液的ph值可以是5～9，本实施例使用ph为7.2的pbs缓冲液；

(3)向上述(2)中所得钴纳米颗粒溶液中加入50μl浓度为1mg/ml的ck-mb的多克隆抗体溶液，利用静电吸附将抗体吸附在钴纳米颗粒表面，再离心收集钴纳米颗粒修饰后的抗体，再用5000μlpbs缓冲液重新分散，得到钴纳米颗粒修饰抗体溶液，备用；其中，多克隆抗体溶液的浓度范围是0.5～2mg/ml，本实施例中浓度为1mg/ml。

步骤二，将100μl浓度为0.005mg/ml的ck-mb的单克隆抗体溶液分别加入到96孔板的14个实验孔中，4℃恒温静置过夜，分两组分别实验。

步骤三，弃去步骤二中第一组12个实验孔中所得到的上层溶液，使用200μlpbst清洗两次96孔板中的实验孔；再向96孔板中的12个实验孔中依次加入100μl浓度为0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20ng/ml的ck-mb溶液，37℃恒温静置2小时。

步骤四，弃去步骤二中第二组2个实验孔中所得到的上层溶液，使用200μlpbst清洗两次96孔板中的实验孔；再向96孔板中的2个实验孔中依次加入100μl待测样品a和100μl待测样品b，37℃恒温静置1小时。

步骤五，分别弃去步骤三和步骤四实验孔中所得到的上层溶液，使用200μlpbst清洗两次96孔板的实验孔；再向96孔板中的每个实验孔加入100μl浓度为10μg/ml的步骤一中所得钴纳米颗粒修饰抗体溶液，37℃恒温静置1小时。

步骤六，弃去步骤五实验孔中所得到的上层溶液，使用200μlpbst清洗三次96孔板；再向96孔板中的每个实验孔加入10μl浓度为10mmol/l的稀硝酸，震荡10min。

步骤七，从步骤六第一组、第二组每个实验孔中各取出10μl所得溶液，加入至苏木精碱性溶液。

步骤八，使用biotek多功能酶标仪(synergyh1)检测第一组中12个已知浓度的ck-mb标准样品的化学发光信号值，并根据其浓度和发光信号值的关系做出定量曲线；见表1，图3。

步骤九，使用biotek多功能酶标仪(synergyh1)检测第二组中待测样品a和待测样品b的发光信号值，将其信号值代入步骤八所得的定量曲线中，得出待测样品中ck-mb的浓度。

如图3所示，本发明实施例3的定量曲线方程为：y＝114272.3x+15065.7，其中，r2＝0.999；测得待测样品a、b的发光信号值分别为19856.8、75684.5，由上述定量曲线方程得出待测样品a、b中的ck-mb浓度分别是0.042ng/ml、0.53ng/ml，即相对误差为5％，6％。

对比例

本发明某公司直接化学发光法检测ck-mb说明书所写检测灵敏度为小于0.625ng/ml，使用该方法测量本发明实施例1-3中的待测样品a、b，因样品浓度太低，超出了现有试剂盒的检测范围，无法准确检测。

表1

由表1、图1-3所示，本发明实施例1-3和对比例相比较得出，验证了本发明基于钴纳米颗粒检测蛋白浓度的方法的可行性，可以用于检测多种生物蛋白，针对不同的生物蛋白，检测灵敏度可达0.01ng/ml，该方法操作简单、检测灵敏度高、准确性很高，不再另行举例。