一种利用酶标记核酸适配体检测黄曲霉毒素B1的方法与流程

本发明涉及一种利用酶标记核酸适配体检测黄曲霉毒素b1的方法。

背景技术：

黄曲霉毒素(aflatoxin)是一种真菌毒素，主要是指由黄曲霉及寄生曲霉产生的次级代谢产物。黄曲霉毒素存在于多种受污染的食品中，如玉米、谷类、酒类、坚果类、调味料及豆制品。其中，黄曲霉毒素b1(aflatoxinb1，afb1)是一种毒性最强的黄曲霉毒素，被国际癌症研究机构确认为一种最主要的致癌物。考虑到afb1对人类健康和食品安全的威胁，及其受污染的广泛性，对afb1的灵敏检测十分必要。

目前，诸如高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法和薄层色谱法等色谱分析方法已经被广泛应用于afb1的定量分析。色谱分析方法具备了较高的灵敏度和准确度，但操作耗时、步骤繁琐、且需要昂贵的仪器。与此相比，免疫分析法操作简单、快速，易实现现场检测，其中基于酶反应信号放大的酶联免疫分析(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)具有较高的检测灵敏度。然而，在酶联免疫分析中，抗体存在一些局限，如免疫抗体对环境因素敏感、活性不稳定、制备成本高等，且不同批次免疫抗体产品实验间的重现性低。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用酶标记核酸适配体检测黄曲霉毒素b1的方法。

本发明提供了一种检测黄曲霉毒素b1的方法，依次包括如下步骤：

(1)取具有包被的微孔板，加入待测样本和特异探针共孵育，然后洗涤；

(2)通过检测特异探针相应的信号实现对黄曲霉毒素b1的检测；

所述具有包被的微孔板为如下(a)或(b)或(c)：

(a)包被有黄曲霉毒素b1-bsa偶联物的微孔板；

(b)包被有黄曲霉毒素b1和载体蛋白的偶联物的微孔板；

(c)包被有黄曲霉毒素b1的酶标板；

所述特异探针为特异探针甲或特异探针乙或特异探针丙；

所述特异探针甲为元件甲和元件乙的结合物；所述元件甲为在与黄曲霉毒素b1特异结合的核酸适配体的末端借助三甘醇作为连接臂连接生物素得到的物质；所述元件乙为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；

所述特异探针乙为在与黄曲霉毒素b1特异结合的核酸适配体的末端连接辣根过氧化物酶得到的物质；

所述特异探针丙包括亲和配体和酶分子标记；所述亲和配体为与黄曲霉毒素b1特异结合的核酸适配体。

所述特异探针甲中，所述末端具体可为5'末端。所述特异探针甲中，元件甲和元件乙的结合为非共价结合。

所述特异探针乙中，所述连接可为直接连接也可为借助连接臂连接。所述特异探针乙中，所述连接可为共价连接和可为非共价连接。所述特异探针乙中，所述末端具体可为5'末端。

所述与黄曲霉毒素b1特异结合的核酸适配体具体如序列表的序列1所示。

所述共孵育的条件具体可为：室温静置孵育30分钟。

所述微孔板为透明微孔板；所述特异探针为所述特异探针甲或所述特异探针乙；所述步骤(2)的实现方式为：加入tmb底物溶液，室温孵育(具体可室温静置孵育30分钟)后测定450nm处的吸光度。

所述微孔板为非透明微孔板(例如黑色微孔板)；所述特异探针为所述特异探针甲或所述特异探针乙；所述步骤(2)的实现方式为：加入化学发光底物溶液，室温孵育(具体可室温静置孵育5分钟)后测定化学发光强度。

所述待测样本可为固态样品或液态样品，例如葡萄酒。

本发明还保护一种探针，为特异探针甲或特异探针乙或特异探针丙。

所述特异探针甲为元件甲和元件乙的结合物；所述元件甲为在与黄曲霉毒素b1特异结合的核酸适配体的末端借助三甘醇作为连接臂连接生物素得到的物质；所述元件乙为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；

所述特异探针乙为在与黄曲霉毒素b1特异结合的核酸适配体的末端连接辣根过氧化物酶得到的物质；

所述特异探针丙包括亲和配体和酶分子标记；所述亲和配体为与黄曲霉毒素b1特异结合的核酸适配体。

所述特异探针甲中，所述末端具体可为5'末端。所述特异探针甲中，元件甲和元件乙的结合为非共价结合。

所述特异探针乙中，所述连接可为直接连接也可为借助连接臂连接。所述特异探针乙中，所述连接可为共价连接和可为非共价连接。所述特异探针乙中，所述末端具体可为5'末端。

所述与黄曲霉毒素b1特异结合的核酸适配体具体如序列表的序列1所示。

本发明还保护一种用于检测黄曲霉毒素b1的试剂盒，包括以上任一所述探针。

所述试剂盒还包括具有包被的微孔板。

所述具有包被的微孔板为如下(a)或(b)或(c)：

(a)包被有黄曲霉毒素b1-bsa偶联物的微孔板；

(b)包被有黄曲霉毒素b1和载体蛋白的偶联物的微孔板；

(c)包被有黄曲霉毒素b1的酶标板。

所述微孔板为透明微孔板或非透明微孔板(例如黑色微孔板)。

所述试剂盒还包括tmb底物溶液或化学发光底物溶液。

本发明还保护以上任一所述探针或以上任一所述试剂盒在检测黄曲霉毒素b1中的应用。

本发明还保护以上任一所述探针在制备用于检测黄曲霉毒素b1的试剂盒中的应用。

以上任一所述微孔板具体可为96孔板。

核酸适配体(aptamer)是指能够与靶分子高亲和力和高特异性结合的单链dna或rna。在特异性识别功能上，核酸适配体能够与传统的抗体相媲美。同时在生物传感方面，核酸适配体具有一些抗体所不具备的优势。例如，核酸适配体能够通过低成本的化学合成进行大量制备，很容易在核酸适配体上引入各种功能基团，化学纯度高，具有较高的热稳定性，便于长期储存和运输。

本发明中，利用生物素(biotin)和链霉亲和素(streptavidin)的强相互作用，生物素标记的核酸适配体与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素结合在一起，形成hrp标记的核酸适配体探针。也可以用亲和素(avidin)代替链霉亲和素。也可以采用化学键合的方法直接将hrp标记到核酸适配体上。

本发明的检测原理：待测样本中的afb1与固定在微孔板上的afb1-bsa偶联物竞争性地和探针相结合，保留在微孔板上的酶分子催化底物反应生成产物，产生检测信号，从而实现对afb1的检测(随着待测样本中afb1浓度的增加，所测得的信号逐渐降低)。采用吸光光度分析法时，采用透明的微孔板，使用tmb(3,3',5,5'-tetramethylbenzidinedihydrochloride)底物溶液，室温下进行酶反应，然后测定450nm处的吸光度。采用化学发光法检测时，采用黑色的微孔板，使用相应的化学发光底物溶液，室温下进行反应，然后测定化学发光强度。

本发明中，利用核酸适配体作为亲和配体选择性识别afb1，采用酶分子作为标记物用于产生检测信号，建立了基于微孔板的吸光光度分析法和化学发光分析法来定量检测afb1的方法。采用辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)作为酶标记分子，相应的反应底物为tmb，检测方法为吸光光度检测法时，afb1检出限为0.2nm。采用辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)作为酶标记分子，采用相应的化学发光底物和化学发光检测法时，检出限为0.01nm。本发明提供的酶联适配体分析方法具有简单、快速、灵敏度高的优势，可实现多个样品的快速分析，可做成检测试剂盒，在afb1的分析检测中具有很大的应用前景。

附图说明

图1为利用hrp标记的核酸适配体采用吸光光度法检测afb1的结果。

图2为利用hrp标记的核酸适配体采用化学发光法检测afb1的结果。

图3为利用hrp标记的核酸适配体采用吸光光度法检测afb1的选择性。

图4为利用hrp标记核酸适配体采用化学发光法检测稀释白葡萄酒样品中添加的afb1的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

黄曲霉毒素b1，英文名为aflatoxinb1，简写为afb1，分子式为c17h12o6，cas号为1162-65-8，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为std#1042。

赭曲霉毒素a，英文名为ochratoxina，简写为ota，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为std#5012。

伏马毒素b1：英文名为fumonisinb1，简写为fb1，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为std#2031。

伏马毒素b2：英文名为fumonisinb2，简写为fb2，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为std#2041。

玉米赤霉烯酮：英文名为zearalenone，简写为zae，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为std#4012。

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(hrp-conjugatedstreptavidin)：生工生物工程(上海)股份有限公司，产品编号d111054-0100。辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素又称hrp标记的链霉亲和素。

afb1-bsa偶联物：sigmaaldrich公司，产品编号为a6655。

偶联物溶液：将afb1-bsa偶联物溶于0.1mna2co3水溶液(ph9.6)，afb1-bsa偶联物的浓度为10μg/ml。

结合反应缓冲溶液：10mmhepes(ph7.0)，20mmmgcl2，50mmnacl和1mg/mlbsa。

洗涤溶液：10mmhepes(ph7.0)，20mmmgcl2，50mmnacl和0.1％(体积百分含量)tween-20。

封闭溶液：10mmhepes(ph7.0)，20mmmgcl2，50mmnacl和10mg/mlbsa。

tmb(3,3',5,5'-tetramethylbenzidinedihydrochloride)底物溶液：生工生物工程(上海)股份有限公司，产品编号c006110。

化学发光底物溶液：sigmaaldrich公司，产品编号11582950001。使用时，试剂a(luminol和4-iodophenol)与试剂b(双氧水)按照100：1的体积比室温下混合温育15分钟。

透明的96孔板：corning公司，产品编号costar3590。

黑色的96孔板：thermofisherscientific公司，型号nuncmaxisorp。

多功能酶标仪：synergyh1microplatereader,biotek,usa。

实施例1、制备hrp标记的核酸适配体

1、制备具有生物素标记的核酸适配体(上海生物工程有限公司人工合成)。

核酸适配体的核苷酸序列如序列表的序列1所示，核酸适配体的5’末端借助三甘醇(triethyleneglycol，teg)作为连接臂，连接生物素。

序列表的序列1：5’-tgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccct-3'。

2、hrp标记的链霉亲和素与步骤1制备的具有生物素标记的核酸适配体按照1：1的摩尔比在结合反应缓冲溶液中4℃静置孵育30分钟，得到hrp标记的核酸适配体。

后续操作中，hrp标记的核酸适配体的浓度以核酸适配体的dna浓度计。

实施例2、制备afb1-bsa偶联物修饰的微孔板

一、微孔板甲的制备

微孔板甲为用于吸光光度检测法的具有afb1-bsa偶联物修饰的微孔板。

1、取透明的96孔板，每孔加入100微升偶联物溶液，4℃静置孵育12小时。

2、完成步骤1后，取所述96孔板，用洗涤溶液洗三次(每次每孔加入150微升洗涤溶液)。

3、完成步骤2后，取所述96孔板，每孔加入200微升封闭溶液，室温静置孵育1小时。

4、完成步骤3后，取所述96孔板，每孔加入300微升洗涤溶液洗一次。

得到微孔板甲。

二、微孔板乙的制备

微孔板乙为用于化学发光检测法的具有afb1-bsa偶联物修饰的微孔板。

用黑色的96孔板代替透明的96孔板，其他同步骤一。

得到微孔板乙。

实施例3、利用hrp标记的核酸适配体采用吸光光度法检测afb1

待测溶液：含有2nm实施例1制备的hrp标记的核酸适配体和不同浓度的afb1的结合反应缓冲溶液。设置不加入afb1的对照。待测溶液中，afb1的浓度见图1的横坐标。

1、取实施例2制备的微孔板甲，每孔加入100微升待测溶液，室温静置孵育30分钟。

2、完成步骤1后，取所述微孔板，弃上清，用洗涤溶液洗三次(每次每孔加入150微升洗涤溶液)。

3、完成步骤2后，取所述微孔板，每孔加入100微升tmb底物溶液，室温静置孵育30分钟，然后每孔加入100微升1mhcl溶液。

4、完成步骤3后，取所述微孔板，采用多功能酶标仪测定450nm处的吸光度。

每种afb1浓度设置2个重复处理，结果取平均值。

结果见图1。图1中，a图显示了afb1浓度为0、0.2nm、0.5nm、1nm、2nm、5nm、10nm、20nm、50nm、100nm、200nm和500nm时对应的吸光度检测结果，b图显示了afb1浓度为0、0.2nm、0.5nm、1nm和2nm时对应的吸光度检测结果。结果表明：随着afb1浓度的增加，吸光度值逐渐下降，检测限为0.2nmafb1。

实施例4、利用hrp标记的核酸适配体采用化学发光法检测afb1

待测溶液：含有2nm实施例1制备的hrp标记的核酸适配体和不同浓度的afb1的结合反应缓冲溶液。设置不加入afb1的对照。待测溶液中，afb1的浓度见图2的横坐标。

1、取实施例2制备的微孔板乙，每孔加入100微升待测溶液，室温静置孵育30分钟。

2、完成步骤1后，取所述微孔板，弃上清，用洗涤溶液洗三次(每次每孔加入150微升洗涤溶液)。

3、完成步骤2后，取所述微孔板，每孔加入100微升化学发光底物溶液，室温静置孵育5分钟。

4、完成步骤3后，取所述微孔板，采用多功能酶标仪测定化学发光强度。

每种afb1浓度设置2个重复处理，结果取平均值。

结果见图2。图2中，a图显示了afb1浓度为0、0.01nm、0.02nm、0.05nm、0.1nm、0.2nm、0.5nm、1nm、2nm、5nm、10nm、20nm、50nm、100nm和200nm时对应的化学发光强度值，b图显示了afb1浓度为0、0.01nm、0.02nm、0.05nm、0.1nm、0.2nm和0.5nm时对应的化学发光强度值。结果表明：随着afb1浓度的增加，化学发光强度值逐渐下降，检测限为0.01nmafb1。

实施例5、利用hrp标记的核酸适配体采用吸光光度法检测afb1的选择性

待测溶液：含有2nm实施例1制备的hrp标记的核酸适配体和不同待测化合物的结合反应缓冲溶液。设置不加入待测化合物的空白样品。待测化合物为黄曲霉毒素b1时，在待测溶液中的浓度为20nm。待测化合物为赭曲霉毒素a、伏马毒素b1、伏马毒素b2或玉米赤霉烯酮时，在待测溶液中的浓度为100nm。

方法同实施例3。

每种待测化合物设置2个重复处理，结果取平均值。

结果见图3。只有含有afb1的待测溶液测得的信号强度明显低于空白样品测得的信号强度，而含有其它各个化合物的待测溶液测得的信号强度与空白样品测得的信号强度接近。结果表明，本发明提供的方法具有很好的选择性。

实施例6、利用hrp标记的核酸适配体采用化学发光法检测稀释白葡萄酒样品中添加的afb1

取白葡萄酒样品(长城干白葡萄酒,中国长城葡萄酒有限公司生产，度数11.5％)，用结合反应缓冲溶液稀释至20倍体积，然后加入实施例1制备的hrp标记的核酸适配体和afb1，得到待测溶液。待测溶液中，hrp标记的核酸适配体的浓度为2nm，afb1的浓度见图4的横坐标。

方法同实施例4。

每种afb1浓度设置2个重复处理，结果取平均值。

结果见图4。图4中，a图显示了afb1浓度为0、0.01nm、0.02nm、0.05nm、0.1nm、0.5nm、1nm、2nm、5nm、10nm、20nm、50nm、100nm和200nm时对应的化学发光强度值，b图显示了afb1浓度为0、0.01nm、0.02nm、0.05nm、0.1nm和0.5nm时对应的化学发光强度值。结果表明，随着afb1浓度的增加，化学发光强度值逐渐下降，检测限为0.01nmafb1。

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<110>中国科学院生态环境研究中心

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