技术简介：
本专利针对补肺活血胶囊质量控制难题，提出基于HPLC指纹图谱的标准化方法。通过分析10批样品，确定12个共有特征峰，建立包含黄芪、赤芍、补骨脂成分的指纹图谱，实现产品质量一致性监控。方法经精密度、稳定性等验证，相似度均＞0.99，为中药标准化提供可靠依据。
关键词：HPLC指纹图谱,补肺活血胶囊质量控制
本发明涉及补肺活血胶囊hplc指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。
背景技术：
：补肺活血胶囊收录于2015年版《中国药典》第一部，由黄芪、赤芍、补骨脂三种药制成。中药理论认为，黄芪补气，赤芍化淤，补骨脂纳气平喘。三药合用具有益气活血、补肺固肾的功效，用于肺心病(缓解期)属气虚血瘀证，证见咳嗽气促，或咳喘胸闷，心悸气短，肢冷乏力，腰膝酸软，口唇紫绀，舌淡苔白或舌紫暗等。本发明提供一种补肺活血胶囊hplc指纹图谱的构建方法，通过补肺活血胶囊标准指纹图谱，能对其质量进行监控，确保成品的均一性。技术实现要素：本发明提供一种补肺活血胶囊hplc指纹图谱的构建方法。该方法能对成品的质量进行监控；为补肺活血胶囊的标准化研究提供了科学依据。本发明补肺活血胶囊hplc指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取本品内容物，研细，取约1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加50％甲醇溶解，定量转移至5ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。(2)对照品溶液的制备：分别称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芍药苷、异补骨脂素、补骨脂素对照品适量，制成浓度为各50μg/ml的混合溶液。(3)采用高效液相色谱法分析上述供试品溶液和对照品溶液，得到补肺活血胶囊高效液相色谱指纹图谱，色谱条件为：进样量10μl；色谱柱为hitachihigh-techc18(4.6×250mm，5μm)；流以乙腈为流动相a，0.2％甲酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱，0-25min，16％a，84％b，25-65min，16-42％a，84-58％b；柱温25℃；检测波长260nm。质谱工作参数：ionsprayvoltage1500v；ionsourcegas150psi；ionsourcegas260psi；temperature550℃；curtaingas15psi；collisiongaspressure8psi；entrancepotential10v。采用esi电喷雾离子源，正离子模式进行检测。本发明通过对10批补肺活血胶囊构建的hplc指纹图谱并进行分析比较，找出其共有特征峰得到补肺活血胶囊标准指纹图谱。补肺活血胶囊标准指纹图谱检测出12个共有色谱峰，归属于黄芪的共有峰为4号峰、8号峰、10号峰，归属于赤芍的共有峰为2号峰、5号峰、6号峰、7号峰，归属于补骨脂的共有峰为1号峰、3号峰、9号峰、11号峰、12号峰。利用dad检测器和uflc-tripletof-dad-ms/ms技术手段对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测，通过uv吸收曲线的比较，结合质谱的分子离子峰、裂解碎片信息鉴定：1号峰为补骨脂苷、2号峰为芍药苷、3号峰为异补骨脂苷、4号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5号峰为没食子酰芍药苷、6号峰为1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、10号峰为毛蕊异黄酮、11号峰为补骨脂素、12号峰为异补骨脂素。所述图谱的图形如说明书附图中的图1所示的图谱。以4号峰毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照物峰，补肺活血胶囊指纹图一共有峰的相对保留值列表如下：附图说明图1是本发明的补肺活血胶囊标准指纹图谱。图2是混合对照品与补肺活血胶囊标准指纹图谱对应的色谱图，图中峰号2、4、10、11、12依次指示为芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、补骨脂素、异补骨脂素。图3是补肺活血胶囊、黄芪、缺黄芪阴性对照色谱图，图中从左到右的箭头所指为补肺活血胶囊标准指纹图谱中归属于黄芪的色谱峰的峰号。图4是补肺活血胶囊、赤芍药材、缺赤芍阴性对照色谱图，图中从左到右的箭头所指为补肺活血胶囊标准指纹图谱中归属于赤芍的色谱峰的峰号。图5是补肺活血胶囊、补骨脂药材对照色谱图，图中箭头所指为补肺活血胶囊标准指纹图谱中归属于补骨脂的色谱峰的峰号。具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例11仪器与试药1.1仪器：日本shimadzu公司超快速高效液相质谱仪(lc-20ad-xr二元泵，sil-20ad-xr自动进样器，cto-20a柱温箱，spd-m10a-pda检测器)美国戴安公司dionexultimate3000dglc高效液相色谱仪(dgp-3600sd双三元泵、srd-3600脱气机、wps-3000sl自动进样器、tcc3000-rs柱温箱、dad检测器检测器)；色谱柱：hitachihigh-techc18(4.6×250mm，5μm)。1.2试药：10批成品，均由广东雷允上药业有限公司提供。实验中液相色谱所用试剂乙腈、甲酸均为色谱纯，其余所用试剂均为分析纯，水为超纯水。对照品：补骨脂素(厂家：中国药品生物制品检定所，批号：110739-201416)；异补骨脂素(厂家：中国药品生物制品检定所，批号：110738-2013)；芍药苷(厂家：中国药品生物制品检定所，批号：110736-201539)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷(厂家：中国药品生物制品检定所，批号：111920-201505)；毛蕊异黄酮(厂家：成都普菲德生物技术有限公司，批号：151208)。2.方法与结果2.1补肺活血胶囊hplc指纹图谱的构建方法2.1.1溶液的制备供试品溶液的制备：取本品内容物，研细，取约1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加50％甲醇溶解，定量转移至5ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。混合对照品溶液的制备：分别称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芍药苷、异补骨脂素、补骨脂素对照品适量，制成浓度为各50μg/ml的混合溶液。药材供试品溶液的制备：取各味药材饮片，分别按供试品溶液的制备”项下方法制备。2.1.2高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液10μl，进样；色谱条件：色谱柱为hitachihigh-techc18(4.6×250mm，5μm)；流动相为以乙腈为流动相a，0.2％甲酸溶液为流动相b，采用以下梯度洗脱方式：检测波长260nm；流速：0.8ml/min；柱温：25℃；得到补肺活血胶囊高效液相色谱标准指纹图谱。2.1.3共有峰确定：将上述得到的10批补肺活血胶囊的高效液相色谱指纹图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行比较，确定12个共有特征峰并获得共有模式(参照指纹图谱)。所得的色谱图检出归属于黄芪的共有峰为4号峰、8号峰、10号峰，归属于赤芍的共有峰为2号峰、5号峰、6号峰、7号峰，归属于补骨脂的共有峰为1号峰、3号峰、9号峰、11号峰、12号峰。利用dad检测器和uflc-tripletof-dad-ms/ms技术手段对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测，通过uv吸收曲线的比较，结合质谱的分子离子峰、裂解碎片信息鉴定：1号峰为补骨脂苷、2号峰为芍药苷、3号峰为异补骨脂苷、4号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5号峰为没食子酰芍药苷、6号峰为1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、10号峰为毛瑞异黄酮、11号峰为补骨脂素、12号峰为异补骨脂素。以上色谱峰构成了补肺活血胶囊的指纹特征。2.1.4精密度试验：取同一补肺活血胶囊供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，相似度均大于0.99，结果表明仪器的精密度良好。相似度结果如下：精密度1精密度2精密度精密度精密度精密度对照指纹图谱精密度11.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000精密度21.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000精密度31.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000精密度41.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000精密度51.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000精密度61.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000对照指纹1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0002.1.5稳定性考察：取同一补肺活血胶囊供试品溶液，分别在0、2、4、8、10、24、48小时进样，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行评价，相似度均大于0.99，结果表明供试品溶液放置48小时内稳定。相似度结果如下：2.1.6重复性试验：取同一批补肺活血胶囊6份，按供试品溶液制备项下方法操作，分别进样，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行评价，相似度均大于0.99，结果表明方法重复性好。相似度结果如下：s1s2s3s4s5s6对照指纹图谱s11.0001.0001.0001.0001.0000.9991.000s21.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000s31.0001.0001.0001.0001.0000.9991.000s41.0001.0001.0001.0001.0000.9991.000s51.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000s60.9991.0000.9990.9991.0001.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0002.1.7中间精密度：取同一批号的补肺活血胶囊，分别在不同日期、不同分析人员、不同仪器等变动因素条件下，依法测定，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行评价。结果表明该方法中间精密度好，补肺活血胶囊hplc指纹图谱质量控制方法可行。(1)不同分析时间：取同一批号的补肺活血胶囊，分别于不同日期按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行评价，相似度均大于0.99。相似度结果如下：分析时间1分析时间2对照指纹图谱分析时间11.0000.9940.999分析时间20.9941.0000.998对照指纹图谱0.9990.9981.000(2)不同分析人员：取同一批号的补肺活血胶囊，不同人员分别按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行评价，相似度均大于0.99。相似度结果如下：分析人员1分析人员2对照指纹图谱分析人员11.0001.0001.000分析人员21.0001.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.000(3)不同仪器：取同一批号的补肺活血胶囊一份，按“供试品溶液的制备”项下方法操作，分别在不同的仪器依法测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行评价，相似度均大于0.99。相似度结果如下：分析仪器1分析仪器2对照指纹图谱分析仪器11.0001.0001.000分析仪器21.0001.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.000当前第1页12