一种氮素高效利用型苹果资源的筛选方法及其应用与流程

本发明涉及生物筛选方法，具体的说，涉及一种氮素高效利用型苹果资源的筛选方法及其应用。

背景技术：

氮素是植物生长发育所必需的重要的大量元素，它是构成核酸、蛋白质和磷脂等生物大分子的主要成分。对于高等植物特别是陆生植物来说，硝酸盐是主要的氮源，它不仅作为营养物质，同时还作为信号分子调节植物的生长和发育。随着社会经济和农业生产的快速发展，化肥尤其成为不可或缺的农业生产资源，然而过量施肥不仅增加了农业的生产成本和资源的浪费，同时也造成了土壤环境恶化和水体污染，影响农业可持续发展和农产品质量安全。因此，国家农业部在2015年3月发布了《到2020年化肥使用量零增长行动方案》的政策，以期待到2020年我国实现主要农作物化肥施用量的零增长。

中国是世界上苹果种植面积最大的国家，也是总产量最高的国家，同时，苹果产业也是我国产量最大的果树产业，苹果产业的发展对于提高农民收入、解决剩余劳动力以及带动下游附加产业的发展起到了关键作用。但是，我国苹果产业与苹果生产先进国家相比，生产水平还存在着较大差距。例如，肥料利用率低，氮肥利用率国外发达国家高达50％～60％，我国仅为33％，特别是氮肥通过挥发、淋溶和径流等途径损失数量巨大。同时，由于片面追求产量与效益，果园内大量施用氮肥，因此导致了土壤肥力下降、果实品质降低和环境污染严重等后果，这严重制约了苹果产业的可持续发展。

因此，减少化肥的施用特别是氮肥的施用，提高氮素的利用效率，筛选氮素高效利用苹果资源对于苹果产业的具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种采用生理生化实验技术筛选氮素高效利用型苹果资源的方法及在产业中的应用。

一种氮素高效利用型苹果资源的筛选方法，根据苹果果肉的颜色，将苹果分为红肉苹果栽培品种植株和非红肉苹果栽培品种植株，通过分别检测红肉苹果栽培品种植株和非红肉苹果栽培品种植株的硝酸盐的利用率的相关生理指标，计算红肉苹果栽培品种植株的硝酸盐的利用率的相关生理指标的平均值，计算非红肉苹果栽培品种植株的硝酸盐的利用率的相关生理指标的平均值，比较两个平均值之间的大小关系，判定得出红肉苹果栽培品种植株的硝酸盐的利用率明显高于非红肉苹果栽培品种植株。

本发明的有益效果在于：本发明的氮素高效利用型苹果资源的筛选方法，能够有效的提高苹果资源对氮素利用效率。

进一步，所述硝酸盐的利用率的相关生理指标包括硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性和总氮的含量。

进一步，所述硝酸盐的利用率的相关生理指标包括n¹⁵标记的硝酸盐的含量。

上述进一步方案的有益效果在于：通过对硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性和总氮的含量以及n¹⁵标记的硝酸盐的含量的测定，可以有效的判定硝酸盐的利用率，测得的硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性和总氮的含量以及n¹⁵标记的硝酸盐的含量的数值越大，表明硝酸盐的利用率越高。

进一步，检测的红肉苹果栽培品种植株为随机选取的45种红肉苹果品种植株，检测的非红肉苹果栽培品种植株为随机选取的84种非红肉苹果品种植株。

进一步，检测的红肉苹果栽培品种植株和非红肉苹果栽培品种植株为红肉苹果品种光辉和非红肉苹果品种王林的杂交群体以及红肉苹果品种b9和红肉苹果品种金沙乙拉木的杂交群体，两个杂交群体分离后代中随机选择长势良好并且基本一致的5棵红肉群体植株和5棵非红肉群体植株。

进一步，其中红肉苹果品种光辉的基因型是mdmyb10:mdmyb10、非红肉苹果品种王林的基因型是mdmyb10:mdmyb10、红肉苹果品种b9的基因型是mdmyb10:mdmyb10、红肉苹果品种金沙乙拉木的基因型是mdmyb10:mdmyb10。

进一步，在整个生长季节检测了来自两个杂交群体分离后代的植株的根、叶和果的混合样品中硝酸盐的利用率。

进一步，检测的红肉苹果栽培品种植株和非红肉苹果栽培品种植株为随机选取的由层积处理苹果属观赏海棠品种王族种子生发出的红肉苹果和非红肉苹果实生苗。

采用上述进一步方案的有益效果是：检测实生苗硝酸盐的利用率，包括硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(nra)、总氮含量和n15标记的硝酸盐的吸收速率。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，根据苹果果肉的颜色，可以分为红肉栽培品种和非红肉栽培品种，通过检测45种红肉苹果品种和84种非红肉苹果品种植株的硝酸盐的利用率，包括硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(nra)和总氮的含量，发现红肉苹果品种植株的硝酸盐的利用率的相关生理指标的平均值明显高于非红肉苹果品种植株。

综上，本发明采用生理生化实验技术，筛选到氮素高效利用型苹果品种，并验证肉苹果品种能够提高硝酸盐的利用率。

附图说明

图1红肉苹果品种和非红肉苹果品种的硝酸盐利用率的检测。其中，图1-a表示：红肉非红肉群体硝酸盐含量；图1-b表示：红肉非红肉群体硝酸还原酶活性；图1-c表示：红肉非红肉群体总氮含量。

图2光辉×王林和b9×金沙乙拉木红肉杂交群体分离后代中红肉群体植株和非红肉群体植株的硝酸盐利用率的检测图。其中，图2-a表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的硝酸盐的含量；图2-b表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的硝酸还原酶的活性(nra)；图2-c表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的总氮含量；图2-d表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的n15标记的硝酸盐的含量(ndff％)；图2-e表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的硝酸盐的含量；图2-f表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的硝酸还原酶的活性(nra)；图2-g表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的总氮含量；图2-h表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的n15标记的硝酸盐的含量(ndff％)；图2-i表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的硝酸盐的含量；图2-j表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的硝酸还原酶的活性(nra)；图2-k表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的总氮含量；图2-l表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的n15标记的硝酸盐的含量(ndff％)；图2-m表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的硝酸盐的含量；图2-n表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的硝酸还原酶的活性(nra)；图2-p表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的总氮含量；图2-q表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的n15标记的硝酸盐的含量(ndff％)。

图3红肉苹果品种后代中的红肉苹果和非红肉苹果实生苗的硝酸盐利用率的检测。其中，图3-a表示：红肉非红肉群体硝酸盐含量；图3-b表示：红肉非红肉群体硝酸还原酶活性；图3-c表示：红肉非红肉群体15n吸收速率；图3-d表示：红肉非红肉群体总氮含量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：不同苹果品种的硝酸盐利用率的检测

随机选取长势良好并且基本一致的45种红肉苹果品种和84种非红肉苹果品种的植株，在生长季的中期选取植株的叶片检测的其硝酸盐的利用率，包括硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(nra)和总氮的含量，检测结果如图1所示。图1红肉苹果品种和非红肉苹果品种的硝酸盐利用率的检测，其中，图1-a表示：红肉非红肉群体硝酸盐含量；图1-b表示：红肉非红肉群体硝酸还原酶活性；图1-c表示：红肉非红肉群体总氮含量。从图上可以明显看出，红肉苹果品种的硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(nra)和总氮的含量高于非红肉苹果品种的硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(nra)和总氮的含量；也就是说，红肉苹果品种的硝酸盐的利用率的相关生理指标平均值明显高于非红肉苹果品种。

实施例2：红肉杂交群体分离后代的硝酸盐利用率的检测

本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，红肉杂交群体分离后代中红肉群体植株和非红肉群体植株的硝酸盐的利用率的检测，包括以下步骤：选择了两个杂交群体进行了实验，分别是红肉苹果品种光辉(基因型是mdmyb10:mdmyb10)和非红肉苹果品种王林(基因型是mdmyb10:mdmyb10)的杂交群体，红肉苹果品种b9(基因型是mdmyb10:mdmyb10)和红肉苹果品种金沙乙拉木(基因型是mdmyb10:mdmyb10)的杂交群体，根据果肉颜色的不同，两个杂交群体的后代分为红肉群体和非红肉群体，杂交群体分离后代中的红肉群体和非红肉群体的比例分别是1:1和3:1。在光辉×王林和b9×金沙乙拉木两个杂交群体分离后代中随机选择长势良好并且基本一致的5棵红肉群体植株和5棵非红肉群体植株，在整个生长季节检测了植株的根、叶的混合样品中硝酸盐的利用率，包括硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(nra)、总氮含量和n15标记的硝酸盐的含量(ndff％)，部分测试结果如图2所示，其中，图2-a表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的硝酸盐的含量；图2-b表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的硝酸还原酶的活性(nra)；图2-c表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的总氮含量；图2-d表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的n15标记的硝酸盐的含量(ndff％)；图2-e表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的硝酸盐的含量；图2-f表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的硝酸还原酶的活性(nra)；图2-g表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的总氮含量；图2-h表示：(光辉与王林杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的n15标记的硝酸盐的含量(ndff％)；图2-i表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的硝酸盐的含量；图2-j表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的硝酸还原酶的活性(nra)；图2-k表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的总氮含量；图2-l表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的根的n15标记的硝酸盐的含量(ndff％)；图2-m表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的硝酸盐的含量；图2-n表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的硝酸还原酶的活性(nra)；图2-p表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的总氮含量；图2-q表示：(b9与金沙乙拉木杂交)红肉群体植株棵非红肉群体植株在整个生长季节检测了植株的叶的n15标记的硝酸盐的含量(ndff％)。

上述实验的结果表明，在苹果生长季节的每一个阶段红肉群体植株的根、叶相对于非红群体植株都具有较高的硝酸盐的利用率。而对于不同的组织器官，无论在红肉群体植株中还是在非红肉群体植株中，根中的硝酸盐的含量和硝酸还原酶的活性(nra)明显高于其在叶和果中的含量和活性。同时，红肉杂交群体中的红肉群体植株的杂合子植株和纯合子植株在硝酸盐的吸收和利用方面没有显著差异。

实施例3：红肉杂交群体实生苗的硝酸盐利用率的检测

层积处理苹果属观赏海棠品种王族的种子，随机选择长势良好并且基本一致的两个月大小的红肉苹果和非红肉苹果实生苗，分别采用在低浓度的硝酸盐(0.5mm)和正常浓度的硝酸盐(5mm)沙培实生苗，检测实生苗硝酸盐的利用率，包括硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(nra)、总氮含量和n15标记的硝酸盐的吸收速率，测试结果如图3所示，图3为红肉苹果品种后代中的红肉苹果和非红肉苹果实生苗的硝酸盐利用率的检测结果图，其中，图3-a表示：红肉非红肉群体硝酸盐含量；图3-b表示：红肉非红肉群体硝酸还原酶活性；图3-c表示：红肉非红肉群体15n吸收速率；图3-d表示：红肉非红肉群体总氮含量。结果表明，在低浓度的硝酸盐(0.5mm)处理条件下，红肉苹果实生苗相对于非红肉苹果实生苗具有较高的硝酸盐的利用率。然而，在正常浓度的硝酸盐(5mm)处理条件下，它们的硝酸盐的利用率没有显著差异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。