骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法与流程

本发明涉及骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，具体属于中药检测技术领域。

背景技术：

骨痛药酒是由制草乌、桑寄生、七叶莲、威灵仙、虎杖、络石藤、菝葜、苍术(麸炒)、油松节、制何首乌、红藤、丹参、接骨木、伸筋草、木瓜、川芎、牛膝、麻黄、香加皮、红花、续断和干姜制成的。骨痛药酒具有祛风定痛，舒筋活络作用，药借酒势，酒助药威，可快速打通愈阻，畅通血管，经络，化解软骨上的瘀血，分割粘连组织，就像溶解冰块一样，逐渐分解钙化变形的增生骨刺。方中制何首乌为主药，起祛风止痛之效。现有的骨痛药酒的质量标准中，其内容只有酒剂常规检查项目，难以有效地控制药品质量。骨痛药酒方中制何首乌为主药，对其进行鉴别，有利于骨痛药酒的质量控制。因此，研究一种鉴别骨痛药酒中制何首乌的方法，显得尤为必要。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，能够高效的鉴别骨痛药酒中制何首乌成分，准确度高，分离度好。

本发明中骨痛药酒，是由制草乌50g、桑寄生50g、七叶莲50g、络石藤25g、丹参25g、油松节37.5g、木瓜25g、麻黄12.5g、威灵仙25g、虎杖37.5g、菝葜25g、干姜6.25g、制何首乌25g、大血藤37.5g、接骨木50g、伸筋草12.5g、川芎12.5g、牛膝50g、香加皮50g、红花12.5g、续断50g和苍术(麸炒)12.5g制成的。以上二十二味，粉碎成粗粉，照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法(《中国药典》2015年版通则0189)，用酒糖液作溶剂(取砂糖430g，溶解于白酒4300g中)，浸渍48小时后，以每分钟每公斤生药1～3ml的速度缓缓渗漉，收集渗漉液，静置，滤过，即得。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，是以何首乌对照药材和2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品为对照，以体积浓度为40％～60％的醋酸为展开剂的薄层色谱法。

前述骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，具体鉴别方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取本品置蒸发皿中，水浴上蒸至稠膏状，加无水乙醇搅拌提取，滤过，合并滤液，滤液浓缩，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取何首乌对照药材，加乙醇，加热回流提取，室温自然冷却，过滤，滤液浓缩，作为对照药材溶液；

(3)对照品溶液的制备：取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品的溶液，作为对照品溶液；

(4)鉴别：照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液、对照品溶液、供试品溶液，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积浓度为40％～60％的醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同的蓝色荧光斑点。

进一步地，前述骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，具体鉴别方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取本品80～120ml置蒸发皿中，水浴上蒸至稠膏状，加无水乙醇搅拌提取3～6次，每次10ml～20ml，滤过，合并滤液，滤液浓缩至2～4ml，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取何首乌对照药材0.2g～0.3g，加乙醇15ml～30ml，加热回流提取1～2h，室温自然冷却，过滤，滤液浓缩至2～4ml，作为对照药材溶液；

(3)对照品溶液的制备：取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品的溶液，作为对照品溶液；

(4)鉴别：照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液2～4μl、对照品溶液2～4μl、供试品溶液2～4μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积浓度为50％的醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同的蓝色荧光斑点。

优选地，前述骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，具体鉴别方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取本品100ml置蒸发皿中，水浴上蒸至稠膏状，加无水乙醇搅拌提取4次，每次10ml，滤过，合并滤液，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取何首乌对照药材0.25g，加乙醇20ml，加热回流提取1h，室温自然冷却，过滤，滤液浓缩至2ml，作为对照药材溶液；

(3)对照品溶液的制备：取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品的溶液，作为对照品溶液；

(4)鉴别：照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液2μl、对照品溶液2μl、供试品溶液2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积浓度为50％的醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同的蓝色荧光斑点。

何首乌为蓼科植物何首乌polygonummultiflorumthunb.的干燥块根。叶枯萎时采挖，削去两端，洗净，个大的切成块，干燥，称何首乌；炮制加工品，称制何首乌。何首乌的炮制加工品，制成品为不规则皱缩状的块片，厚约1cm。表面黑褐色或棕褐色，凹凸不平。质坚硬，断面角质样，棕褐色或黑色。气微，味微甘而苦涩。苦、甘、涩，温。归肝、心、肾经。具有补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨功效。用于血虚萎黄，眩晕耳鸣，须发早白，腰膝酸软，肢体麻木，崩漏带下，久疟体虚；高血脂。主要适宜人群是脂肪肝，三高，肥胖症，失眠，脱发，少白头及亚健康人群。

本发明实验将选取何首乌对照药材和2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品作为双对照，通过无水乙醇提取本品中活性成分，对制何首乌进行薄层鉴别，并考察不同点样量、不同厂家薄层板、不同温度、不同湿度对本品中制何首乌薄层色谱的影响。试验结果表明：以何首乌对照药材和2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品作为双对照，以体积浓度为40％～60％的醋酸为展开剂，对制何首乌进行鉴别的薄层色谱法特征明显，专属性强，可作为本品中制何首乌的鉴别方法。

为了确保本发明鉴别方法科学、合理、有效，对本发明的鉴别方法进行了研究和考察。

1、仪器与试剂

ms304s/01电子天平，mettlertoledo(梅特勒-托利多)，醋酸(川江化学)，氨水(重庆川江化学试剂厂)，乙醚(天津科密欧化学试剂有限公司，分析纯)，正丁醇(西陇化工股份有限公司，分析纯)，氢氧化钙(西陇化工股份有限公司)，p-1型薄层色谱展开缸(上海信谊仪器厂有限公司)，聚酰胺薄膜(四甲生化)，硅胶g薄层板(青岛海洋化工)，5μl点样毛细管(天津市思利达科技有限公司)，sld-1薄层色谱摄影仪(天津思利达色谱技术开发公司)。

骨痛药酒(批号20170201、20170202、20170203，贵州信邦制药股份有限公司)，2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品(中国药品生物制品检定所)。

2、专属性考察

吸取供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2μl。按供试品溶液、阴性对照溶液、何首乌对照药材溶液、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液顺序点于同一聚酰胺薄膜上，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。色谱图如图1所示。供试品色谱中，在与对照药材与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点，阴性对照色谱中相应位置上无斑点。表明该方法的专属性良好。

3、最佳点样量的考察

分别吸取步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液1、2、3、4、5、6、8μl，分别点于不同聚酰胺薄膜上，进行考察，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。其中，供试品溶液2μl点样量效果最佳，当点样量大于4μl时，供试品溶液位置斑点出现拖尾现象，点样量低于2μl时，供试品溶液位置斑点不明显；对照药材溶液点样量2～4μl时效果好，尤其是在2μl时效果最佳；对照品溶液点样量2～4μl时效果好，尤其是在2μl时效果最佳，故选择供试品溶液点样量为2～4μl，最佳点样量2μl；对照药材溶液点样量2～4μl，最佳点样量2μl；对照品溶液点样量2～4μl，最佳点样量2μl。

4、耐用性考察

4.1、不同品牌聚酰胺薄膜

吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2μl，按供试品溶液、何首乌对照药材溶液、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液点样，更换不同品牌的聚酰胺薄膜，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。色谱图如图2所示，供试品色谱中，在与对照药材与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。且更换不同品牌薄膜后，各薄膜之间无显著差异，表明更换不同品牌聚酰胺薄膜对制何首乌的薄层鉴别无影响。

4.2、湿度

吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2μl，按供试品溶液、何首乌对照药材溶液、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液点样，更换不同湿度，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。色谱图如图3所示，供试品色谱中，在与对照药材与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。且变换不同湿度后，各薄膜之间无显著差异，表明变换不同湿度对制何首乌的薄层鉴别无影响。

4.3、温度

吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2μl，按供试品溶液、何首乌对照药材溶液、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品溶液点样，更换不同温度，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。色谱图如图4所示，供试品色谱中，在与对照药材与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点，且变换不同温度后，各薄膜之间无显著差异，表明变换不同温度对制何首乌的薄层鉴别无影响。

现有技术中，骨痛药酒标准中并未涉及2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷鉴别项目，本发明中使用体积分数为40％～60％的醋酸作为展开剂，优选采用体积分数为50％的醋酸作为展开剂，保证最终的展开效果良好且没有拖尾，达到了最佳的分离效果。

本发明的有益之处在于：本发明提供的一种骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，能够高效的鉴别骨痛药酒中制何首乌成分，准确度高，分离度好。本发明的方法可控性更高，操作简单、分离度高、重现性好，并且阴性对照无干扰，不同厂家聚酰胺薄膜和温度、湿度条件均不影响。本发明鉴别方法能够对骨痛药酒中制何首乌成分进行准确、全面、科学有效的鉴别，提升了质量检测标准，进一步确保了产品质量的稳定、安全、有效。

附图说明

图1是本发明骨痛药酒中制何首乌的专属性鉴别色谱图；

图2是骨痛药酒中制何首乌鉴别时不同品牌聚酰胺薄膜色谱图；

图3是骨痛药酒中制何首乌鉴别时不同湿度条件下色谱图；

图4是骨痛药酒中制何首乌鉴别时不同温度条件下色谱图；

图中附图标记的含义：图1:1-供试品批号20170201，2-供试品批号20170202，3-供试品批号20170203，4-阴性对照，5-何首乌对照药材，6-2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品；图2：a-国药集团化学试剂薄膜(薄膜规格：100×200mm)，b-上海鼓臣生物技术薄膜(薄膜规格：100×200mm)；图3：a-湿度32％，b-湿度72％；图4：a-温度25℃，b-温度8℃；图2～图4：1-供试品批号20170201，2-供试品批号20170202，3-供试品批号20170203，4-何首乌对照药材，5-2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。

实施例1

骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，具体鉴别方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取本品80ml置蒸发皿中，水浴上蒸至稠膏状，加无水乙醇搅拌提取3次，每次20ml，滤过，合并滤液，滤液浓缩至3ml，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取何首乌对照药材0.2g，加乙醇15ml，加热回流提取1.5h，室温自然冷却，过滤，滤液浓缩至3ml，作为对照药材溶液；

(3)对照品溶液的制备：取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品的溶液，作为对照品溶液；

(4)鉴别：照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液3μl、对照品溶液4μl、供试品溶液4μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积浓度为40％的醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同的蓝色荧光斑点。

实施例2

骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，具体鉴别方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取本品120ml置蒸发皿中，水浴上蒸至稠膏状，加无水乙醇搅拌提取6次，每次15ml，滤过，合并滤液，滤液浓缩至4ml，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取何首乌对照药材0.3g，加乙醇30ml，加热回流提取2h，室温自然冷却，过滤，滤液浓缩至4ml，作为对照药材溶液；

(3)对照品溶液的制备：取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品的溶液，作为对照品溶液；

(4)鉴别：照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液4μl、对照品溶液3μl、供试品溶液3μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积浓度为60％的醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同的蓝色荧光斑点。

实施例3

骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，具体鉴别方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取本品100ml置蒸发皿中，水浴上蒸至稠膏状，加无水乙醇搅拌提取4次，每次10ml，滤过，合并滤液，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取何首乌对照药材0.25g，加乙醇20ml，加热回流提取1h，室温自然冷却，过滤，滤液浓缩至2ml，作为对照药材溶液；

(3)对照品溶液的制备：取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品的溶液，作为对照品溶液；

(4)鉴别：照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液2μl、对照品溶液2μl、供试品溶液2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积浓度为50％的醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同的蓝色荧光斑点。

实施例4

骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，具体鉴别方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取本品90ml置蒸发皿中，水浴上蒸至稠膏状，加无水乙醇搅拌提取5次，每次20ml，滤过，合并滤液，滤液浓缩至3ml，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取何首乌对照药材0.28g，加乙醇20ml，加热回流提取2h，室温自然冷却，过滤，滤液浓缩至2ml，作为对照药材溶液；

(3)对照品溶液的制备：取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品的溶液，作为对照品溶液；

(4)鉴别：照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液2μl、对照品溶液3μl、供试品溶液3μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积浓度为45％的醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同的蓝色荧光斑点。

实施例5

骨痛药酒中制何首乌的鉴别方法，具体鉴别方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取本品110ml置蒸发皿中，水浴上蒸至稠膏状，加无水乙醇搅拌提取3次，每次10ml，滤过，合并滤液，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取何首乌对照药材0.22g，加乙醇25ml，加热回流提取1h，室温自然冷却，过滤，滤液浓缩至3ml，作为对照药材溶液；

(3)对照品溶液的制备：取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品的溶液，作为对照品溶液；

(4)鉴别：照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液2μl、对照品溶液3μl、供试品溶液2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积浓度为50％的醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同的蓝色荧光斑点。