液相色谱串联质谱法同时测定蜂王浆中10种烟碱类药物残留量的方法与流程

本发明涉及蜂王浆中多个烟碱类药物残留量测定的检测方法，尤其涉及一种液相色谱串联质谱法同时测定蜂王浆中10种烟碱类药物残留量的方法。
背景技术：
：新型烟碱类药物属于一类新型高效、低毒、内吸性强、残效期长、残留量低的广谱性杀虫剂，在市场上占有很高的份额，其广泛用于水稻、玉米、南瓜等农作物的害虫防治。自20世纪80年代中期由德国拜耳公司成功开发出第一个烟碱类杀虫剂吡虫啉问世，到目前为止已有十几个产品商品化或即将商品化，如呋虫胺(dinotefuran)、噻虫胺(clothianidin)、吡虫啉(imidacloprid)、啶虫脒(acetamiprid，又名吡虫清)等。研究表明烟碱类杀虫剂的作用机制主要是通过选择性控制昆虫神经系统烟碱型乙酰胆碱酯酶受体，阻断昆虫中枢神经系统的正常传导，从而导致害虫出现麻痹进而死亡。它可有效防治同翅目、鞘翅目、双翅目和鳞翅目等害虫，对用传统杀虫剂防治产生抗药性的害虫也有良好的活性，既可有效地防治蔬菜、水稻和果树等各种重要经济作物上发生的蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱、蓟马和蝽等刺吸式害虫以及一些鳞翅目和鞘翅目害虫，也可用于伴侣动物牛寄生虫和卫生害虫如蜚蠊、苍蝇和白蚁的防治。已有研究表明，当蜜蜂接触新烟碱类杀虫剂时，会迷失回巢方向，蜂王繁殖能力显著下降，从而导致蜂群的数量明显减少。药物的使用使得蜜源植物和蜜蜂体内的药物残留可能导致蜂产品受到污染，从而威胁消费者的身体健康。为此欧盟法规规定了蜂蜜中新烟碱类农药的最大残留量为：啶虫脒、氟啶虫酰胺和吡虫啉50μg/kg，噻虫胺、呋虫胺、烯啶虫胺和噻虫嗪10μg/kg，噻虫啉200μg/kg。伴随着人民生活水平、食品安全意识的提高和蜂王浆保健需求的增加，新型烟碱类农药在蜂王浆中的残留问题日益突出。因此建立蜂王浆中多种烟碱类药物残留量测定的方法，具有重要的科学意义和社会意义。烟碱类药物作为有效的杀虫剂，其在食品中残留量的测定主要集中在植物源性产品中，目前我国已经制定的植物源性食品中药物残留检测也基本涵盖了烟碱类药物。例如gb/t19648-2006水果和蔬菜中500种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱-质谱法，gb/t20769-2008水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法，gb/t23205-2008茶叶中448种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法等。近几年伴随着烟碱类药物对蜜蜂影响的深入研究，特别是欧盟制定了该类药物的限量以来，研究人员陆续展开了对蜂蜜中烟碱类药物残留的测定研究。但尚未检索到对蜂王浆中烟碱类药物残留量测定情况的研究报道。为了给蜂王浆产品的质量安全提供必要的技术支持，建立蜂王浆中烯啶虫胺、呋虫胺、噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉、啶虫脒、噻虫啉、氟啶虫酰胺、氯噻啉和吡呀酮(表1)残留量同时测定的检测方法非常重要。表1各类化合物的基本信息编号名称英文名称cas号分子式分子量1烯啶虫胺nitenpyram120738-89-8c11h15cln4o2270.722呋虫胺dinotefuran165252-70-0c7h14n4o3202.213噻虫嗪thiamethoxam153719-23-4c8h10cln5o3s291.714噻虫胺clothianidin205510-53-8c6h8cln5o2s249.685吡虫啉imidacloprid138261-41-3c9h10cln5o2255.666啶虫脒acetamiprid135410-20-7c10h11cln4222.677噻虫啉thiacloprid111988-49-9c10h9cln4s252.728氟啶虫酰胺flonicamid158062-67-0c9h6f3n3o229.169氯噻啉imidaclothiz105843-36-5c7h8cln5o2s261.6910吡呀酮pymetrozine123312-89-0c10h11n5o217.23技术实现要素：为了解决蜂王浆中多个烟碱类药物残留量同时测定的技术问题，本发明提供了一种液相色谱串联质谱法同时测定蜂王浆中10种烟碱类药物残留量同时测定的方法，该方法简便快捷，消耗资源小，检测成本低的特点。为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案。液相色谱串联质谱法同时测定蜂王浆中10种烟碱类药物残留量的方法，所述的10种烟碱类药物为烯啶虫胺、呋虫胺、噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉、啶虫脒、噻虫啉、氟啶虫酰胺、氯噻啉和吡呀酮，该方法包括以下的步骤：一、提取称取样品2.00g，精确到0.01g，于50ml具塞离心试管中，加入同位素内标物，加入10ml水，涡旋，混匀，静置5min，加入甲醇至20ml，涡旋，混匀，高速离心，取上清液5ml，加水至30ml，涡旋，混匀，待净化；所述的同位素内标溶液的加入为：噻虫胺-d3、吡虫啉-d4、噻虫啉-d4、噻虫嗪-d3、啶虫脒-d3和呋虫胺-d3内标物20ng；二、净化上述提取液过hlb固相萃取柱进行净化，甲醇：水＝1：9进行淋洗，抽干，甲醇洗脱，收集5ml洗脱溶液并用氮气吹至近干，用甲醇：0.15％甲酸溶液＝1：9定容至10ml，过0.22μm滤膜，待液相色谱-质谱/质谱仪测定；三、测定1)标准工作液和样品溶液在设定的液相色谱串联质谱条件下进样，以质量浓度x为横坐标，峰面积的比值y为纵坐标，外标法定量的化合物时以峰面积为纵坐标，绘制5点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中各化合物的响应值应在仪器检测的线性范围内；设定的各化合物的母离子、子离子和碰撞能量等质谱参数如下：设定的液相色谱串联质谱的仪器条件参数如下：2)在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的化合物在设定的质谱定性离子的相对离子丰度与浓度相当的混合基质标准工作液的相对离子丰度一致，相对离子丰度偏差不超过设定的规定，则可确定含有该化合物。本方法经水稀释样品并初步沉淀蛋白，甲醇进一步沉淀蛋白和提取，hlb固相萃取净化的前处理过程，采用液相色谱-串联质谱法测定，外标法和同位素内标稀释法定量。测定定量限(以s/n等于10计)蜂王浆样品中烯啶虫胺(5μg/kg)、呋虫胺(5μg/kg)、噻虫嗪(0.5μg/kg)、噻虫胺(0.5μg/kg)、吡虫啉(2.5μg/kg)、啶虫脒(0.0025μg/kg)、噻虫啉(1μg/kg)、氟啶虫酰胺(0.25μg/kg)、氯噻啉(2.5μg/kg)和吡呀酮(0.25μg/kg)。线性关系良好，相关系数大于0.995；总体回收率：75.6％～107.8％；相对标准偏差：0.8％～13.5％。该方法简便快捷，消耗资源小，检测成本低，所提及的前处理过程、涉及化合物以及测定所用仪器可以与已有方法进行很好的互补，适用于蜂王浆中烟碱类药物残留量同时测定的要求，可以为维护食品安全和保障蜂王浆质量进一步提供有力的技术保障。附图说明图1空白蜂王浆添加目标化合物的加标回收实验测试的总离子流图(呋虫胺、噻虫胺、烯啶虫胺、噻虫嗪浓度：5μg/kg，吡蚜酮、啶虫脒、氟啶虫酰胺、吡虫啉、氯噻啉浓度：25μg/kg，噻虫啉浓度：100μg/kg)。图2～图27为空白蜂王浆添加目标化合物的加标回收实验测试的选择性离子流图(呋虫胺、噻虫胺、烯啶虫胺、噻虫嗪浓度：5μg/kg，吡蚜酮、啶虫脒、氟啶虫酰胺、吡虫啉、氯噻啉浓度：25μg/kg，噻虫啉浓度：100μg/kg)。其中：图2吡虫啉(256.1/175.1)选择性离子流图。图3吡虫啉(256.1/209.1)选择性离子流图。图4吡虫啉-d4(260.2/179.0)选择性离子流图。图5吡蚜酮(218.1/105.2)选择性离子流图。图6吡蚜酮(218.1/78.2)选择性离子流图。图7啶虫脒(223.1/56.1)选择性离子流图。图8啶虫脒(223.1/90.1)选择性离子流图。图9啶虫脒-d3(226.1/126.1)选择性离子流图。图10呋虫胺(203.1/129.1)选择性离子流图。图11呋虫胺(203.1/157.1)选择性离子流图。图12呋虫胺-d3(206.1/132.0)选择性离子流图。图13氟啶虫酰胺(230.1/203.0)选择性离子流图。图14氟啶虫酰胺(230.1/148.1)选择性离子流图。图15氯噻啉(262.1/181.2)选择性离子流图。图16氯噻啉(262.1/122.2)选择性离子流图。图17噻虫胺(250.1/169.1)选择性离子流图。图18噻虫胺(250.1/113.1)选择性离子流图。图19噻虫胺-d3(253.1/172.1)选择性离子流图。图20噻虫啉(253.1/90.1)选择性离子流图。图21噻虫啉(253.1/186.1)选择性离子流图。图22噻虫啉-d4(257.1/126.1)选择性离子流图。图23噻虫胺(292.1/211.1)选择性离子流图。图24噻虫胺(292.1/132.1)选择性离子流图。图25噻虫胺-d3(295.0/214.2)选择性离子流图。图26烯啶虫胺(271.1/56.1)选择性离子流图。图27烯啶虫胺(271.1/126.1)选择性离子流图。具体实施方式液相色谱串联质谱法同时测定蜂王浆中10种烟碱类药物残留量的方法，该方法包括以下的步骤：一、提取蜂王浆样品的检测，样品中蛋白沉淀是前处理的关键步骤，本发明对比三氯乙酸沉淀蛋白和有机溶剂沉淀蛋白提取的方式。在蜂王浆中直接加入三氯乙酸进行蛋白沉淀净化，其提取溶剂较难通过减压浓缩进行去除，呋虫胺和噻虫啉无法被有效的提取，啶虫脒提取回收率30％左右。有机溶剂沉淀蛋白试验分别考察甲醇和乙腈沉淀蛋白的情况，研究发现甲醇和乙腈沉淀蛋白效果并无明显的差别，乙腈作为沉淀提取剂时，呋虫胺和吡蚜酮的提取回收率30％左右，烯啶虫胺的提取回收率50％左右，甲醇作为沉淀提取剂时的提取回收率均大于80％。最后选择甲醇作为蛋白沉淀剂和提取溶剂。具体操作：称取样品2.00g(精确到0.01g)于50ml具塞离心试管中，加入内标物，加入10ml水，涡旋，混匀，静置5min，加入甲醇至20ml，涡旋，混匀，高速离心，取上清液5ml，加水至30ml，涡旋，混匀，待净化。二、净化本发明尝试选择mcx，hlb，c18三种不同类型的固相萃取柱进行净化效果的考察。实验结果表明：1、c18固相萃取柱采用甲醇上样同时进行洗脱方式，结果表明呋虫胺回收率20％左右，氟啶虫酰胺回收率50％左右。2、mcx固相萃取柱采用酸性甲醇上样，中性甲醇淋洗，碱性甲醇洗脱的方式，结果表明烯啶虫胺的回收率30％左右，且净化实验的重现性不理想。3、hlb固相萃取柱采用水溶液上样，混合溶剂淋洗，甲醇洗脱的方式。结果表明，淋洗溶液的比例在甲醇含量达到20％时，呋虫胺可以被淋洗溶液洗脱，因此采用甲醇：水(1：9)进行淋洗，采用甲醇进行洗脱。具体操作：上述提取液过hlb固相萃取柱进行净化，甲醇：水(1：9)进行淋洗，抽干，甲醇洗脱，收集5ml洗脱溶液并用氮气吹至近干，用甲醇：0.15％甲酸溶液(1：9)定容至10ml，过0.22μm滤膜，待液相色谱-质谱/质谱仪测定。三、测定标准工作液和样品溶液在表2和表3设定的液相色谱串联质谱条件下进样，以质量浓度x为横坐标，峰面积的比值y为纵坐标(外标法定量的化合物以峰面积为纵坐标)，绘制5点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中各化合物的响应值应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的化合物在表2中的质谱定性离子的相对离子丰度与浓度相当的混合基质标准工作液的相对离子丰度一致，相对离子丰度偏差不超过表3的规定，则可确定含有该化合物。表2为各类化合物的母离子、子离子和碰撞能量等质谱参数。在表2和表3设定的液相色谱串联质谱条件下，空白样品添加回收实验的回收率和精密度见表4，各类化合物的质谱色谱峰见图1和图2～图27。表2各类化合物的质谱参数表3液相色谱串联质谱的仪器条件参数表4蜂王浆中10种烟碱类药物添加水平、回收率和精密度(n＝6)当前第1页12