本发明属于医用材料技术领域，涉及一种p2y12受体血小板凝集检测试剂卡制备方法及其应用。
背景技术：
血小板在维持正常止血中起着关键的作用。当暴露于受损的血管时，血小板将粘附在暴露的内皮下基质上，随后，在损伤的部位释放或产生的各种因子(如凝血酶、adp、或胶原等)激活血小板。血小板激活后，血小板上的糖蛋白gpiib/iiia受体发生构象改变，使得其与多价纤维蛋白原结合，导致邻近的血小板补充到损伤部位并聚集形成止血塞或血栓。
体外血小板聚集依赖于血小板受到聚集诱导剂(凝血酶、二磷酸腺苷(adp))作用而激活，使其与包被在微球上的纤维蛋白原结合而产生聚集。其中，adp作为诱导剂可与血小板上受体之一即p2y12受体结合，从而通过p2y12受体途径激活血小板活性，使得血小板上的糖蛋白iib/iiia受体与纤维蛋白原结合而产生聚集。血小板的聚集程度与活化的血小板上的gpiib/iiia受体数量成正比。当全血样本中的血小板被诱发聚集后，全血样本的透光率增加，通过检测血小板聚集前后光学信号的变化来完成此项检测。但由于个体血小板功能活性存在差异性，这可能导致患者术前或术后出现不同程度的血栓、出血等风险。因此，临床上检测患者的与p2y12受体途径相关的血小板凝集功能是非常必要的，同时采用光学比浊法的方法学也成为此项研究的关键技术。
目前，国内临床上与p2y12受体途径相关的血小板凝集功能的检测主要采用以下几种方法：lta法，血栓弹力图法，闭合时间法，电阻抗法等，但这些方法测定耗时过长、操作复杂繁琐、无法实现快速便捷的检测。国外，accumetrics,inc.公司上市一种p2y12受体相关血小板凝集功能检测试剂盒(比浊法)产品，此产品是临床上普遍认为质量较好的产品，具有特异性强、操作简便、快速检测等特点，且国内并无类似产品。
本发明者们致力于探寻一种能够快速有效地检测患者与p2y12受体途径相关的血小板凝集功能的检测试剂卡及其检测方法，其检测原理及方法学与accumetrics,inc.公司生产的p2y12受体相关血小板凝集功能检测试剂盒(比浊法)产品相同。本公司研发的p2y12受体血小板凝集检测试剂卡(比浊法)需与本公司生产的全自动血小板聚集仪配合使用检测与p2y12受体途径相关的血小板凝集功能，不仅样本用量少，简便快速，而且适合于即时检测，不受时间、地点限制，24h全方位为患者服务，是今后床旁快速检测发展的方向。
目前，国内并未出现关于采用光学比浊法快速检测患者的血小板凝集功能的报道，因此，在本领域期望开发一种能够快速有效地检测患者血小板凝集功能的检测试剂卡，从而为临床医生和患者提供预测接受p2y12受体拮抗剂治疗的患者未来发生血栓或出血的风险的有效辅助资料。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种p2y12受体血小板凝集检测试剂卡制备方法及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种p2y12受体血小板凝集检测试剂卡，所述检测试剂卡包括如图1所示由四个检测通道组成，一通道中含有由bsa和纤维蛋白原包被的冻干试剂，无激活剂，二通道中含有由bsa和纤维蛋白原包被的冻干试剂，含血小板最大激活剂iso-trap(凝血酶受体激活肽)，三通道中不含冻干试剂，四通道中含有由bsa和纤维蛋白原包被的冻干试剂，含血小板p2y12受体激活剂adp(二磷酸腺苷)和p2y1受体拮抗剂pge1(前列腺素e1)。
本发明所述的检测试剂卡利用光学比浊法快速有效地检测患者与p2y12受体途径相关的血小板凝集功能，实现对全血样品中血小板凝集功能进行有效评估，比传统的比浊法和一般的血小板聚集功能检测方法更快速有效。
优选地，所述冻干试剂包含聚苯乙烯或聚苯二乙烯微球。
优选地，所述微球粒径为4-6μm，例如4μm、4.3μm、4.6μm、4.9μm、5.2μm、5.5μm、5.7μm或6μm。
优选地，所述微球功能官能基团为羧基基团，gpiib/iiia受体配体的氨基基团与微球羧基基团通过酰胺键牢固结合，均匀分布在微球表面。
优选地，所述冻干试剂中包含近红外染料，当含有血小板的血液样品和所述冻干试剂接触时形成测定混合物，用近红外光谱中的光照射所述测定混合物，并评估近红外线在所述测定混合物中的透光率来评估由血小板介导的凝集。
在本发明中，微球在反应过程中起载体作用，通常过量添加，而gpiib/iiia受体配体用量则是根据微球的粒径和用量来进行适当选择。
优选地，所述gpiib/iiia受体配体可选自兔纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或人纤维蛋白原任意一种或组合使用。
在本发明中，所述试剂卡二通道含血小板最大激活剂iso-trap的最终浓度为2-25μm，例如2μm、4μm、6μm、8μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm、20μm、22μm、24μm或25μm；
优选地，当待测血液样品加入到试剂卡中，所述血小板最大激活剂iso-trap的最终浓度为6-16μm。
在本发明中，所述试剂卡四通道含p2y12受体激活剂adp的最终浓度为5-40μm，例如5μm、8μm、10μm、13μm、15μm、18μm、20μm、23μm、25μm、28μm、30μm、33μm、35μm、38μm或40μm，以及所述p2y1受体拮抗剂pge1的最终浓度为5-40nm，例如5nm、8nm、10nm、13nm、15nm、18nm、20nm、23nm、25nm、28nm、30nm、33nm、35nm、38nm或40nm；
优选地，当待测血液样品加入到试剂卡中后，所述p2y12受体激活剂adp的最终浓度为15-25μm；
优选地，当待测血液样品加入到试剂卡中后，所述p2y1受体拮抗剂pge1的最终浓度为15-25nm。
优选地，所述试剂卡的检测血液样品为全血样品。
本发明提供一种冻干试剂的冻干保护剂溶液，所述冻干保护剂溶液的成分如下：
在本发明中，所述冻干保护剂溶液中海藻糖的含量为50-160g/l，例如50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l或160g/l。
在本发明中，所述冻干保护剂溶液中乳糖的含量为50-120g/l，例如50g/l、55g/l、60g/l、65g/l、70g/l、75g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l或120g/l。
在本发明中，所述冻干保护剂溶液中吐温20的含量为0.45-0.8ml/l，例如0.45ml/l、0.5ml/l、0.55ml/l、0.6ml/l、0.65ml/l、0.7ml/l、0.75ml/l或0.8ml/l。
在本发明中，所述冻干保护剂溶液中牛血清白蛋白的含量为30-70g/l，例如30g/l、35g/l、40g/l、45g/l、50g/l、55g/l、60g/l、65g/l或70g/l。
在本发明中，所述冻干保护剂溶液中叠氮钠的含量为12-35ml/l，例如12ml/l、15ml/l、17ml/l、20ml/l、22ml/l、25ml/l、27ml/l、30ml/l、32ml/l或35ml/l。
在本发明中将如上所述成分溶解在纯化水中得到所述冻干保护剂溶液。
优选地，所述冻干保护剂溶液包括如下成分：
优选地，所述试剂卡包含样本仓、暂存仓、微流通道和检测通道，样本仓与暂存仓连通，暂存仓与微流通道连通，微流通道与所述四个检测通道连通。
另一方面，本发明提供了一种利用第一方面所述的试剂卡进行检测的方法。
优选地，所述方法为：使待测全血样品通过样本仓进入到试剂卡中，全血样品沿着微流通道最终流入四个检测通道，检测通道三不含冻干试剂，作为空白对照，检测通道一、二和四中的冻干试剂溶解于样品中，若其与样品中的血小板发生反应则会导致透光率增加，通过检测反应前后光学信号的变化来完成对样品的检测。
本发明所述试剂卡需与本公司研发的全自动血小板聚集仪配合使用方可检测与p2y12受体途径相关的血小板凝集功能，其检测方法为：
1)采集静脉全血至少2ml于枸橼酸钠抗凝采血管；
2)采集的样本应在室温保存，检测前，温和颠倒采血管至少5次，确保样本彻底混匀，不应使用明显凝血的样本。
3)从铝箔袋中取出试剂卡，用手握住试剂卡，拔下试剂卡上针的保护鞘。
4)开启试剂卡配套仪器全自动血小板聚集仪，点击检测界面上的“开始”按钮进行样本检测，根据屏幕图标提示操作。先将试剂卡插入仪器检测槽内，待屏幕显示试管图像，再将装有静脉全血的采血管温和颠倒至少5次混匀样本后插入到试剂卡的针孔中，采血管橡皮塞朝下使针彻底刺穿，关闭遮光盖，全自动血小板聚集仪自动完成试剂卡检测，通过采集反应前后光学信号的变化计算结果并显示。
相对于现有的血小板凝集功能检测技术，本发明具有以下优点：
本发明试剂卡四通道添加血小板p2y12受体激活剂adp(二磷酸腺苷)和p2y1受体拮抗剂pge1(前列腺素e1)，提高了p2y12受体介导的血小板聚集的反应特异性；并且采用全封闭的配套仪器配合完成检测，期间需将采集的枸橼酸钠抗凝的静脉全血采血管插入到试剂卡内，只需等待2min即可显示结果，操作简便，检测快速；采集的全血样本无需进行离心等繁琐操作；检测结果与accumetrics,inc.公司上市的p2y12受体相关血小板凝集功能检测试剂盒(比浊法)产品对比，相关系数大于0.975，检测结果可信度高。
附图说明
图1为本发明的检测试剂卡卡的结构示意图，所述试剂卡包含样本仓、暂存仓、微流通道和检测通道，样本仓与暂存仓连通，暂存仓与微流通道连通，微流通道与所述四个检测通道连通。一、二、四检测通道分别含有不同的冻干试剂，三通道为空白对照。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
(1)在本实施例中，确定了起载体作用的微球材质、粒径、功能官能基团、gpiib/iiia受体配体蛋白、近红外染料、iso-trap/adp/pge1激活剂用量及冻干保护剂溶液成分，以上为微球标记，制备冻干试剂准备。
(2)利用本实施例确定的原料成分及用量制备冻干试剂，制备方法如下：
微球标记：
①微球清洗：取1ml的羧基微球，用6ml0.02mph5.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，2000g，4℃离心(2000g，5min)弃上清。
②微球活化：分别加入用0.02mph5.0磷酸盐缓冲液配制的edc和nhs溶液至终浓度为20mg/ml，室温活化25分钟，4℃离心(2000g，5min)弃上清，用0.02mph8.5硼酸盐缓冲液6ml洗涤两次后用该缓冲液复溶至6ml。
③蛋白标记：向上一步活化微球中加入用0.02mph8.5硼酸盐缓冲液配制gpⅱb/ⅲa受体配体至终浓度为0.3mg/ml，室温孵育2小时。
④封闭：孵育结束后，4℃离心(2000g，5min)弃上清，加入用0.02mph8.5硼酸盐缓冲液配制bsa至终浓度1mg/ml，室温封闭30min，封闭结束后，4℃离心(2000g，5min)弃上清，用0.02mph8.5硼酸盐缓冲液缓冲液复溶至6ml。
⑤染色：向上一步中加入用二氯甲烷和0.02mph8.5硼酸盐缓冲液配制近红外染料至终浓度为0.05mg/ml，涡旋震荡5min，4℃离心(2000g，5min)弃上清。
⑥复溶：加入6ml0.02mph8.5硼酸盐缓冲液，4℃离心(8000g，10min)弃上清，洗涤两次后加入0.02mph8.5硼酸盐缓冲液定容至6ml，4℃保存备用。
微球冻干：
标记完成的微球与冻干保护剂溶液按一定比例混合，混匀后平均分成3份，标号一、二、四，分别加入相对应的血小板激活剂，其中一通道不添加激活剂，用0.01mhepes缓冲液(ph7.5)替代；二通道添加iso-trap的终浓度为6-16μm，本实例中优选15μm；四通道添加adp的终浓度为15-25μm，本实例中优选20μm，p2y1拮抗剂的终浓度为15-25nm，本实例中优选20nm。将每管液体混匀，采用电动移液器分别吸取管中液体滴入装有液氮的容器中，每滴液体体积控制在10-20μl，本实施例中优选15μl，每个液滴滴在液氮中速冻成小球，当小球冻结实后将其转移至小玻璃瓶中，再将小玻璃瓶转移至冷冻干燥机中冻干成试剂球，分别为一通道冻干试剂、二通道冻干试剂、四通道冻干试剂。具体冻干保护剂溶液成分如下：
试剂卡焊接：
一通道冻干试剂、二通道冻干试剂、四通道冻干试剂分别装入试剂卡的对应检测通道内，并在一、二、四通道中分别装入一颗直径约2mm的钢珠，组装试剂卡，采用超声波焊接机对试剂卡进行超声焊接密封，使试剂卡的检测通道密闭，微球通道畅通，保证了产品质量。
包装：
将试剂卡装入大小合适的铝箔袋中，并在袋中放置吸氧剂和干燥剂各一包，采用铝箔封口机进行封口，即得到p2y12受体血小板凝集检测试剂卡。
实施例2
利用实施例1制备得到的p2y12受体血小板凝集检测试剂卡进行血小板凝集功能检测，方法如下：
p2y12受体血小板凝集检测试剂卡是由聚苯乙烯材质制成的透明试剂卡，其包含四个检测通道，一通道中含有由bsa和纤维蛋白原包被的冻干试剂，无激活剂，二通道中含有由bsa和纤维蛋白原包被的冻干试剂，含血小板最大激活剂iso-trap(凝血酶受体激活肽)，三通道中不含冻干试剂，作为空白对照，四通道中含有由bsa和纤维蛋白原包被的冻干试剂，含血小板p2y12受体激活剂adp(二磷酸腺苷)和p2y1受体拮抗剂pge1(前列腺素e1)。
将p2y12受体血小板凝集检测试剂卡的四个检测通道进行标号，如图1所示。
本发明所述试剂卡需与本公司研发的全自动血小板聚集仪配合使用方可检测与p2y12受体途径相关的血小板凝集功能，其检测方法为：
1)采集静脉全血至少2ml于枸橼酸钠抗凝采血管；
2)采集的样本应在室温保存，检测前，温和颠倒采血管至少5次，确保样本彻底混匀，不应使用明显凝血的样本。
3)从铝箔袋中取出试剂卡，用手握住试剂卡，拔下试剂卡上针的保护鞘。
4)开启试剂卡配套仪器全自动血小板聚集仪，点击检测界面上的“开始”按钮进行样本检测，根据屏幕图标提示操作。先将试剂卡插入仪器检测槽内，待屏幕显示试管图像，再将装有静脉全血的采血管温和颠倒至少5次混匀样本后插入到试剂卡的针孔中，采血管橡皮塞朝下使针彻底刺穿，关闭遮光盖，全自动血小板聚集仪自动完成试剂卡检测，通过采集反应前后光学信号的变化计算结果并显示。
结果判定标准如下：
判断阈值：208pu，单位用pu表示。
若检测结果＞208pu，一般认为，p2y12受体途径相关的血小板凝集功能正常。
若检测结果＜208pu，一般认为，p2y12受体途径相关的血小板凝集功能较弱。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的制备工艺方法及检测方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。