HILPDA蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用、肝癌预后评估试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及hilpda蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用、肝癌预后评估试剂盒及方法。

背景技术：

肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第3位。我国每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45％。由于依靠血清甲胎蛋白(afp)检测结合超声显像对高危人群的监测，使肝癌在亚临床阶段即可诊断，早期切除的远期效果尤为显著。肝癌可发生于任何年龄，以40～49岁最多，男女之比为2～5∶1。肝癌的并发症主要为消化道出血、肝癌结节破裂、肝功能衰竭、感染等，这些并发症往往是导致肝癌死亡的直接原因。

肝性脑病是最危险的并发症，占肝癌死亡原因的34.9％左右，常发生于肝癌的终末期，多由于肝癌或同时合并的肝硬化导致肝实质的严重广泛破坏所致，在诱因上多见于上消化道出血、感染、电解质紊乱、大量利尿药的应用或放腹水等，其治愈率低、预后差，因此应积极治疗和预防，避免其诱发因素的发生。

肝癌的治疗目前仍以手术切除为首选方案。尤其是早期肝癌患者，手术后宜予一定的化疗，以减少术后复发的机会，若有条件做肝动脉碘化油栓塞化疗更佳，术后还需给与一些生物反应调节剂治疗、中药治疗。手术治疗是肝癌首选的治疗方法，通过完整的清除肿瘤组织，达到治愈的目的。

hypoxia-induciblelipiddroplet-associated(hilpda)是一个新的过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferators-activatedreceptors，ppars)的靶基因，ppars与配体结合激活后，与视黄醇类x受体(rxr)形成异二聚体，形成的pparγ/rxr异二聚体与靶基因启动子上游的ppar反应元件(ppre)结合，最终调节靶基因的转录。其配体为脂溶性分子，受体与配体结合后，主要通过调节靶基因的表达产生生物效应。ppars与各自的配体结合后引起本身的构象的变化，促进或抑制靶基因的表达。

肝癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对肝癌的治疗也缺少特异性的分子靶点，而hilpda做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道hilpda蛋白与判断肝癌预后或肝癌转移相关。本发明研究发现在肝癌中的hilpda表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示hilpda可作为肝癌的术后预后的有效预警蛋白。

技术实现要素：

本发明目的在于提供hilpda蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，并提供用于肝癌术后预后评估的试剂盒及方法。

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测hilpda蛋白在肝癌组织中的相对表达量，能够判断肝癌患者出现肝癌复发转移的风险。基于hilpda蛋白表达量与肝癌复发转移的相关性，以hilpda蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导肝癌的预后判断。

因此，本发明提供了hilpda蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是以hilpda蛋白作为分子标记，利用hilpda单克隆抗体或hilpda多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测hilpda蛋白在肝癌组织中的相对表达量。

本发明还提供了所述应用中用于肝癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：人源hilpda单克隆抗体或hilpda多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。

本发明经过研究发现，hilpda在复发转移肝癌组织中表达高于未复发转移肝癌组织，可以推测hilpda在肝癌术后复发转移中发挥重要作用。查阅国内外文献，hilpda与肝癌的发生以及复发转移的相关研究少，在本研究中，hilpda在肝癌组织中的表达上调，而在癌旁和正常肝组织中则表达下调，且与未复发转移组相比，hilpda在复发转移组中表达也上调，表明hilpda可能作为促进因子参与肝癌发生发展过程。通过kaplan-meier生存曲线分析，hilpda表达程度与肝癌患者的预后有关，hilpda高表达的患者预后不良(p<0.05)。

综上所述，hilpda在肝癌组织中高表达，hilpda的高表达与肝癌患者术后复发转移有关。hilpda可以作为肝癌预后的一个重要候选分子标记物。

优选的，所述人源hilpda多克隆抗体由序列为seqidno.1所示的hilpda蛋白免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。

本发明所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2(水溶液)、3％bsa封闭液(以pbs配制)、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、pbs(ph7.4)、0.01medta修复液。

利用本发明所述试剂盒进行肝癌术后预后评估的方法如下：

(1)取肝癌患者病理标本，利用人源hilpda单克隆抗体或人源hilpda多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；

其中，病理标本来自于肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用sp染色法，具体步骤如下：

(a)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

(b)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯i：10min；二甲苯ii：10min；二甲苯iii：10min。

(c)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。

(d)pbs清洗3次，每次5min。

(e)edta抗原高压修复：切片放入0.01medta修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。pbs清洗3次，每次5min。

(f)加入300μl的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。pbs清洗3次，每次5min。

(g)加入300μl的3％(w/w)bsa封闭液(pbs配制)，37℃1h。pbs清洗3次，每次5min。

(h)加入一抗：hilpda抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后pbs洗4次，每次5min。

(i)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。pbs洗4次，每次5min。

(j)pbs洗3次，每次5min。dab(dab显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。

(k)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。

(l)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

(2)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用aperioimagescope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的algorithms(positivepixelcountv9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：

(3)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为positivity×log10[255/iavg]，其中positivity＝npositive/ntotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；iavg＝(iwp+ip+isp)/(nwp+np+nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。

(4)采用spss18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用kaplan-meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。本发明显示hilpda蛋白与肝癌的预后具有显著的相关性，为预测肝癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对肝癌患者的预后有重要作用。当癌组织hilpda免疫组化评分高于0.319时，肝癌易出现复发转移，肝癌患者术后易死亡。

本发明的有益效果主要体现在：本发明研究发现在肝癌中的hilpda表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示hilpda可作为肝癌的术后预后的有效预警蛋白。因此，本发明提供了hilpda蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

附图说明

图1为hilpda在肝癌患者术后1年内无复发转移的组织样本中弱表达；

图2为hilpda在肝癌患者术后1年内复发转移的组织样本中高表达；

图3为hilpda在肝癌旁组织中弱表达；

图4为肝癌组织中hilpda低表达组与高表达组生存曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此：

实施例1

用于肝癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：用于对肝癌组织中的hilpda蛋白的相对表达量进行检测的人源hilpda单克隆抗体或hilpda多克隆抗体、免疫组化实验试剂。其中，免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2、3％bsa封闭液、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶、pbs以及0.01medta修复液。

本发明所述人源hilpda多克隆抗体由序列为seqidno.1所示的hilpda蛋白免疫兔子获得。可自行制备，也可采用市购商品。

本发明所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2(水溶液)、3％bsa封闭液(以pbs配制)、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、pbs(ph7.4)、0.01medta修复液。

实施例2

hilpda蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是利用本发明试剂盒进行肝癌术后预后评估，方法如下：

(1)取肝癌患者病理标本，利用人源hilpda单克隆抗体或人源hilpda多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；

其中，病理标本来自于肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用sp染色法，具体步骤如下：

(a)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

(b)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯i：10min；二甲苯ii：10min；二甲苯iii：10min。

(c)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。

(d)pbs清洗3次，每次5min。

(e)edta抗原高压修复：切片放入0.01medta修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。pbs清洗3次，每次5min。

(f)加入300μl的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。pbs清洗3次，每次5min。

(g)加入300μl的3％(w/w)bsa封闭液(pbs配制)，37℃1h。pbs清洗3次，每次5min。

(h)加入一抗：hilpda抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后pbs洗4次，每次5min。

(i)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。pbs洗4次，每次5min。

(j)pbs洗3次，每次5min。dab(dab显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。

(k)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。

(l)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

(2)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用aperioimagescope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的algorithms(positivepixelcountv9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：

(3)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为positivity×log10[255/iavg]，其中positivity＝npositive/ntotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；iavg＝(iwp+ip+isp)/(nwp+np+nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。hilpda高低表达标准以358例肝癌组织中hilpda表达评分的中位数(0.319)为界。

(4)采用spss18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用kaplan-meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。

按照上述方法，本发明在358例肝癌病人的肿瘤组织中检测结果如图1-3所示：hilpda在1年内无复发转移组中弱表达；在复发转移组中高表达(图2)；在癌旁组织中弱表达(图3)。

hilpda与肝癌患者预后的关系：

通过kaplan-meier生存曲线分析，hilpda的表达程度与肝癌患者的预后相关，如图4所示，hilpda高表达的患者平均生存期(存活率)低于hilpda低表达的患者。

实施例3

取某肝癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的hilpda免疫组化组织评分为0.495。经过术后随访发现，该患者在术后第11个月发生肝癌复发转移，术后第二十个月死亡。

实施例4

取某肝癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的hilpda免疫组化组织评分为0.125。经过术后随访发现，该患者在术后1年均未发现转移复发，健在。

由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测hilpda蛋白分子相对表达量能预测肝癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当癌组织hilpda的免疫组化评分高于0.319时，肝癌易出现复发转移，肝癌患者术后易死亡。显然hilpda蛋白与肝癌具有相关性，因此，以hilpda蛋白作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测肝癌手术后复发转移等事件，并判断预后。

序列表

<110>福建师范大学

<120>hilpda蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用、肝癌预后评估试剂盒及方法

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>63

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metlyshisvalleuasnleutyrleuleuglyvalvalleuthrleu

151015

leuserilephevalargvalmetgluserleugluglyleuleuglu

202530

serproserproglythrsertrpthrthrargserglnleualaasn

354045

thrgluprothrlysglyleuproasphisproserargsermet

505560