人胱抑素C胶体金定量检测卡的制作方法

本发明属于免疫化学领域，具体的涉及两种抗人胱抑素c(cysc)抗体及其制备方法以及上述抗体在人胱抑素c检测中的应用。
背景技术：
：胱抑素c(cystatinc，cysc)由122个氨基酸组成，分子量为13.3kd，是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ-微量蛋白或γ-后球蛋白。cysc在体内以恒定速度产生并存在于各种体液中，尤以脑脊液和精浆中含量为高。循环中的cysc仅经肾小球滤过而被清除，且在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液，因此，其血中浓度由肾小球滤过率决定而不依赖任何外来因素(如性别、年龄及饮食等)的影响，是一种反映肾小球滤过率变化的理想标志物。血清肌酐(scr)、尿素(urea)、内生肌酐清除率(ccr)等肾脏清除率指标受许多肾外因素，如年龄、性别、身高、肌肉量、膳食结构、药物等以及肾小管对肌酐的分泌的影响，而cysc不受上述因素的影响。研究表明，血液cysc参考浓度一岁后稳定在成人水平，一直到六十岁左右，且无性别差异。亦有研究表明，与其他指标相比，cysc检出糖尿病肾病的灵敏度为40％，特异性为100％，因此可通过定期检测糖尿病患者血液中cysc浓度变化以观察是否有糖尿病微血管病变的发生。另外，血清中cysc室温可稳定两天，0℃至20℃可稳定7天，在-80℃可稳定6个月，且反复冻融对测定值无显著影响。综上各种指标使得cysc成为反映肾小球滤过情况的重要敏感指标。鉴于cysc在反映肾小球滤过率方面的优越性，制备cysc抗体并用于制备cysc定量检测试剂盒具有重要的临床应用价值。胶体金定量检测法使用方便易于推广且成本较低，可满足疾病指标的定量检测，适合于基层医疗系统的即时检验。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供能有效的、特异性结合人胱抑素c的抗体。更具体地说：本发明的第一目的在于提供两种抗人胱抑素c抗体。第一种抗人胱抑素c抗体(c12)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列seqidno：1所示的hcdr1、如序列seqidno：2所示的hcdr2和/或如序列seqidno：3所示的hcdr3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列seqidno：4所示的lcdr1、如序列seqidno：5所示的lcdr2和/或如序列seqidno：6所示的lcdr3。优选的hcdr1～hcdr3、lcdr1～3的核苷酸序列如序列seqidno：17～22所示。优选的是本发明中的c12抗体重链可变区的氨基酸序列如seqidno:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:8所示，重链可变区和轻链可变区通过连接短肽直接融合，其氨基酸序列如seqidno:35所示。更优选的，c12抗体重链可变区核苷酸序列如seqidno:23所示，轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:24所示，重链可变区和轻链可变区通过连接短肽直接融合，其核苷酸序列如seqidno:36所示。第二种抗人胱抑素c抗体(c14)，其抗体重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列seqidno：9所示的hcdr1、如序列seqidno：10所示的hcdr2和/或如序列seqidno：11所示的hcdr3；以及其抗体轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列seqidno：12所示的lcdr1、如序列seqidno：13所示的lcdr2和/或如序列seqidno：14所示的lcdr3。优选的hcdr1～hcdr3、lcdr1～3的核苷酸序列如序列seqidno：25～30所示。优选的是本发明中c14抗体重链可变区的氨基酸序列如seqidno:15所示，抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:16所示；重链可变区和轻链可变区通过连接短肽直接融合，其氨基酸序列如seqidno:35所示.更优选的，c14抗体重链可变区核苷酸序列如seqidno:31所示，轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:32所示，重链可变区和轻链可变区通过连接短肽直接融合，其核苷酸序列如seqidno:36所示。本发明第二个目的是提供两种单链抗体，所述抗体c12的氨基酸序列如seqidno:33所示；所述抗体c14的氨基酸序列如seqidno:34所示。本发明第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如seqidno:37所示、如seqidno:38所示。本发明第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主菌。本发明第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。本发明的第七个目的在于提供上述抗人胱抑素c抗体在检测人胱抑素c含量中的应用。本发明的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人胱抑素c的抗体对组合；该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。本发明的第九个目的在于提供一种利用所述抗人胱抑素c抗体检测人胱抑素c的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体c12，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有抗体c14，质控带位置包被抗his标签抗体或proteinl。所述反应膜优选硝酸纤维素膜。所述抗his标签抗体优选鼠抗his抗体。本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的一组抗体组合(c12及c14)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人血浆样本检测的人胱抑素c的胶体金免疫层析定量检测卡。附图说明图1.抗体m12和m14重链及轻链可变区基因电泳图。lane1为m12重链可变区pcr扩增基因，lane2为500dnaladder，lane3为m12轻链可变区pcr扩增基因，lane4为m14重链可变区pcr扩增基因，lane5为m14轻链可变区pcr扩增基因。图2.单链抗体结构示意图。vh表示重链可变区序列，vl表示轻链可变区序列，his标签为六个组氨酸。图3.单链抗体表达pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图。图3-a为c12基因pcr产物；图3-b为c14基因pcr产物。图4.单链抗体特异性检测效果图(westernblot)。图4-a为单链抗体c12；图4-b为单链抗体c14。图5.本发明胶体金免疫层析定量检测卡结果示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸收垫、4为质控线(c线)、5为检测线(t线)、6为金标垫、7为pvc片材。图6.cysc检测卡(cc14-cc12)拟合曲线图，其中标准曲线方程为y＝-0.002x2+0.120x+0.066，其中相关系数r2＝0.999。图7.cysc检测卡(cc14-cc12)线性范围曲线图，其中，标准曲线方程为y＝1.004x+0.103，相关系数为r2＝0.997。图8.市场上获得良好信誉的胱抑素c定量检测试剂与待评价产品方法学比对图，其中，标准曲线方程为y＝1.090x-0.517，相关系数为r2＝0.953，说明本试剂盒与市售主流胱抑素c定量检测试剂检测结果一致性较好。具体实施方式定义“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由b淋巴细胞分泌的大型y形蛋白质，能够通过y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。“单链抗体”(scfv)指的是抗体的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将vl的n端连接至vh的c末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。互补决定区(complementarity-determiningregion,cdr)，也叫做高变区。成型于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。实施例1.抗人胱抑素c杂交瘤细胞株的制备1.动物免疫以提取于人血浆的胱抑素c(购买于hytest公司)按照一般免疫程序免疫balb/c雌性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司)。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接elisa法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，进行小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。2.细胞融合(1).脾脏细胞的制备将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。(2).饲养细胞的制备取8～10周龄的雌性balb/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10ml1640ht培养基(购自sigma公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入20％1640hat培养基中备用；取2～3周龄的雌性balb/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640hat培养基中，备用。(3).细胞融合选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株sp2/0，收集并计数。取约108个上述脾细胞与2×107个上述sp2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清(尽量弃净)，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1ml预热的peg1450(聚乙二醇1450，购自sigma公司)，加入1640ht培养基30ml终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640hat培养基中。将上述hat培养基充分混匀后，以200μl/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％co2的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640ht培养基替换20％1640hat培养基，3天后取上清进行检测。3.抗人胱抑素c特异性杂交瘤株筛选(1).检测板的准备：用cb包被液稀释cysc(购买于hytest公司)至1μg/ml，包被96孔elisa酶标板，100μl/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)的pbst缓冲液封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。(2).阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μl/孔加入上述检测板中，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μl/孔的hrp标记的羊抗鼠igg，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μl/孔的tmb显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μl的2mh2so4终止反应，并于od450处读取数值。阳性孔确定原则：od450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株m12及m14均具有较高的效价，遂后续进一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。实施例2.杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定对上述杂交瘤细胞株分泌的m12及m14抗体可变区序列进行测定。a.rna的提取：参照细胞总rna抽提试剂盒(购自roche公司)说明书对上述杂交瘤细胞株m12及m14进行总rna提取并立即进行反转录；b.rna反转录成为dna：参照thermoscientificrevertedfirststrandcdnasynthesiskit(购自thermo公司)对上一步骤中所提取的总rna进行反转录，制得cdna，冻存于-20℃备用；c.可变区序列的pcr扩增及回收：以上一步骤中所得cdna为模板，以鼠igg亚型单克隆抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行pcr扩增，将pcr产物经dna胶回收试剂盒(购自tiangen公司)进行回收，见附图1；d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pmd18-tkit(购自takara公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pmd18-t载体进行连接，转化大肠杆菌dh5α，挑取阳性克隆，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测序得到杂交瘤细胞株分泌的抗体m12的抗体重链可变区氨基酸序列如seqidno:7所示、轻链可变区氨基酸序列如seqidno：8所示。vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列seqidno：1所示的hcdr1、如序列seqidno：2所示的hcdr2、如序列seqidno：3所示的hcdr3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列seqidno：4所示的lcdr1、如序列seqidno：5所示的lcdr2、如序列seqidno：6所示的lcdr3。测序得到杂交瘤细胞株分泌的抗体m14的抗体重链可变区氨基酸序列如seqidno:15所示、轻链可变区氨基酸序列如seqidno：16所示。vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列seqidno：9所示的hcdr1、如序列seqidno：10所示的hcdr2、如序列seqidno：11所示的hcdr3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列seqidno：12所示的lcdr1、如序列seqidno：13所示的lcdr2、如序列seqidno：14所示的lcdr3。实施例3.单链抗体的重组表达及纯化根据实施例2中测序结果，分别将杂交瘤细胞株m12及m14的抗体重链及轻链可变区之间加入连接肽(ggggs)3，引入六个组氨酸，并将其全基因进行人工合成，构建到毕赤酵母中进行单链抗体的重组表达。所表达得到的单链抗体分别命名为抗体c12及抗体c14，其结构组成如附图2所示。上述单链抗体的重组表达具体如下：1.单链抗体基因的表达质粒构建人工合成的单链抗体c12的基因序列如seqidno:37所示、氨基酸序列如seqidno:33所示；人工合成的单链抗体c14的核苷酸序列如seqidno:38所示、氨基酸序列如seqidno:34所示。人工合成的单链抗体c12及c14全基因合成的片段上游引入ppiczαa载体中xhoi序列后dna序列，下游引入xbai酶切位点，构建到puc57质粒(由南京金斯瑞生物科技有限公司提供)中，得到一种长期保存质粒，质粒记为puc57-c12-scfv-(his)6、及puc57-c14-scfv-(his)6。进行pcr扩增，其中上游引物p1为cgccagggttttcccagtcacgac；下游引物p2为:agcggataacaatttcacacagga。常规pcr程序后，琼脂糖凝胶电泳分析(附图3)，显示两种产物大小与预期大小(706bp、725bp)一致。将pcr获得基因产物回收纯化后，采用xhoi(#r0146s,购自newenglandbiolabs公司)和xbai(#r0145v,购自newenglandbiolabs公司)双酶切，用t4连接酶连接到ppiczαa(v19520，购自invitrogen)质粒中，转化到dh5α感受态细胞中，在含有zeocin(r250-01，购自invitrogen公司)的lb平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到抗体c12及c14的表达质粒，分别记为ppiczα-c12-scfv-(his)6及ppiczα-c14-scfv-(his)6。2.单链抗体基因在毕赤酵母宿主工程菌株的构建、筛选及表达ypds固体培养基配制：参照invitrogen公司easyselectpichiaexpressionkit说明书；毕赤酵母感受态细胞：参照easyselectpichiaexpressionkit说明书；bmgy培养基配制：参照invitrogen公司multi-copypichiaexpressionkit说明书；bmmy培养基配制：参照invitrogen公司multi-copypichiaexpressionkit说明书。将ppiczα-c12-scfv-(his)6及ppiczα-c14-scfv-(his)6质粒，用saci限制性内切酶酶切线性化。乙醇沉淀后将线性化载体，分别电转化进入到x-33感受态酵母细胞，分别涂布到含有zeocin的ypds固体培养基，30℃培养3-5天，就有阳性克隆产生。挑取上述获得的单克隆于5mlbmgy培养基中，30℃培养至od600＝2.0～6.0时，取1ml保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移到bmmy中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％(v/v)。一周后，离心收集菌液上清，通过蛋白免疫印迹分析(westernblot)，观察目标蛋白表达情况。westernblot中一抗为抗his-tag抗体(his-tag(2a8)mousemab，m20001，购于艾比玛特生物医药(上海)有限公司)。将上述获得的c12及c14重组融合蛋白基因工程菌株分别接种于bmgy培养基中，30℃，220rpm培养至菌体密度到od600＝2.0～6.0，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0％(v/v)。一周后，收集发酵培养液。3.单链抗体纯化采用组氨酸标签亲和柱纯化单链抗体c12及c14融合蛋白，预装柱子选择为histraphp，具体步骤如下：(1)发酵液的除杂预处理：将上述表达得到抗体c12及c14融合蛋白发酵液上清，离心收集上清，并加入结合缓冲液，使得上清终浓度为300mmnacl，20mmnah2po4，10mmimidazole，调ph7.5，0.45μm滤膜过滤。(2)histraphp亲和柱纯化：运用全自动智能蛋白纯化系统(aktaavant150，购自gehealcare公司)对预处理获得的抗体c12及c14融合蛋白发酵液进行亲和纯化，柱子为histraphp(17-5248-02,购自gehealcare公司)。结合缓冲液为300mmnacl，20mmnah2po4，10mmimidazole，ph7.5，洗脱缓冲液为300mmnacl，20mmnah2po4，500mmimidazole，ph7.5。洗脱时进行线性洗脱，并收集各个洗脱峰。通过sds-page电泳鉴定纯度，合并符合要求的收集管，更换缓冲液为pbs溶液并超滤浓缩(1mg/ml)，过滤除菌于-20℃保存备用。实施例4.单链抗体的性能评价1.单链抗体c12及c14的westernblot鉴定a.聚丙烯酰胺凝胶电泳：配置12％分离胶、5％浓缩胶，分别上样标准蛋白质及天然cysc蛋白(购买于hytest公司)，恒压下电泳1小时；b.转膜：恒流(35ma/膜)条件下转膜1小时，将两块聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质分别转移至两张硝酸纤维素膜上。考马斯亮蓝g250对完成转膜的sds-page胶进行染色，观察蛋白的残留情况；c.封闭：含5％脱脂奶的tbst缓冲液封闭(封闭液)，4℃过夜；封闭后洗涤液(tbst，详见takara公司tbstbuffer)洗涤一次，10分钟；d.抗原抗体反应：封闭液稀释(按1:400体积比)辣根过氧化物酶标记c12(c12-hrp，1mg/ml，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)及辣根过氧化物酶标记c14(c14-hrp，1mg/ml，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)，分别加入上述两张硝酸纤维素膜中，室温反应1小时；tbst洗涤5次，每次10分钟；e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，每张硝酸纤维素膜分别加入2ml稳定型过氧化物酶溶液(1ml)与鲁米诺/增强剂溶液(1ml)的混合液(购买于thermo公司)，均匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室温避光反应一分钟后于凝胶成像系统(购买于ge公司)拍照(图4-a，图4-b)，留取结果。检测结果可见，c12及c14具有较好的特异性，可特异性检测cysc蛋白。2.单链抗体c14及c12在胶体金检测平台的评价将实施例3中纯化的抗体进行配对组合，分别作为包被抗体或标记抗体进行配对检测胱抑素c(cysc)，检测步骤如下：1)用抗体包被液将c14或c12稀释至1mg/ml，划线于硝酸纤维素膜上；2)用0.01mpb缓冲液将胶体金标记的c14或c12稀释3倍后铺于结合垫上；3)按附图5所示贴膜，切条，装卡(具体制备参见实施例5)4)用样本稀释液稀释cysc标准品(众红自制)，至浓度为7mg/l，1mg/l，将这两个浓度标准品和零浓度标准品(即样本稀释液)分别添加50ul到胶体金检测卡中(c12包被-c14标记或c14包被-c12标记)，10min后将检测卡放置在读数仪上进行读数。结果如下表所示：由上述结果可知，可见c14作为包被抗体，c12作为标记抗体组成的双抗体夹心法检测系统可应用于胶体金检测平台，进行cysc的检测。实施例5抗人胱抑素c的胶体金免疫检测卡的制备1、溶液配制1)0.01mpb缓冲液制备：称取na2hpo4·12h2o3.22g，nah2po4·2h2o0.15g，加纯化水1000ml，转子搅拌至溶解，用ph计测定其ph7.4±0.1，0.45um滤膜过滤。2)封闭液制备：称取牛血清白蛋白(bsa)5g，加0.01mpb溶液(ph7.4±0.1)50ml，转子搅拌至溶解。3)抗体包被液制备：取0.2ml异丙醇，加入9.8ml0.01mpb溶液(ph7.4±0.1)，转子搅拌5-10min。4)金标抗体复溶液制备：称取1g牛血清白蛋白，5g海藻糖，加入100ml0.01mpb溶液(ph7.4±0.1)，转子搅拌至溶解后，加入25ultween-20，继续用转子搅拌5-10min。5)样本稀释液制备：称取12.5g牛血清白蛋白加入500ml0.01mpb溶液(ph7.4±0.1)，转子搅拌至溶解，加入0.5mlproclin300，继续用转子搅拌5-10min。2、人胱抑素c胶体金检测卡制备1)胶体金的标记抗体c12的胶体金标记(以1ml胶体金溶液标记为例)：用k2co3调节胶体金ph值(每1ml胶体金中加入4ul0.2mk2co3)，搅拌5-10分钟，向胶体金溶液中缓慢加入抗体c12(每1ml胶体金中加入25ug抗体c12)，低速搅拌30分钟；加入封闭液至其终浓度为10％(质量百分比)，搅拌20分钟；静置30min后12000rpm离心30min；去上清用100ul金标抗体复溶液复溶沉淀即得胶体金标记的c12抗体。2)金标垫及反应膜制备将c12金标抗体稀释3倍后，喷涂在金标垫6上，干燥备用；将抗体c14用抗体稀释液稀释至0.8mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的t线5位置；将抗his标签抗体用抗体稀释液稀释至0.2mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的c线4位置，反应膜干燥备用。3)贴膜、切膜、组装将样品垫1、金标垫6、包被有抗体的硝酸纤维素膜2、吸水垫3从左至右依次设置(如图5所示)，且两两之间应少许接触，所述包被有抗体的硝酸纤维素膜的t线5在左、c线4在右，并根据外壳大小进行切割，装入外壳，完成检测卡制备。4)试剂盒组装将组装好的检测卡，干燥剂装入铝箔袋中，热封机封口，贴标签；将样本稀释液按1ml/管进行分装，并按照试剂盒规格装入自封袋，贴标签；按照成品规格，将一定份数的内包，1个含样本稀释液的自封袋，1份说明书，1个合格标签装入包装盒内，并在包装盒外贴好标签。3、人胱抑素c胶体金检测卡使用方法1)打开外包装，从密封铝箔袋中取出检测卡，置于平坦台面上。2)吸取2.5μl血清/血浆样本，加入样本稀释液中，充分混合。3)吸取50ul经处理后的样本加入检测卡的加样孔中，室温下静置10min。4)将检测卡放入免疫层析定量分析仪中，按“快速检测”键开始检测，仪器将自动对检测卡进行扫描。5)从免疫层析定量分析仪的显示屏幕上读取/打印检测结果。4、人胱抑素c胶体金检测卡检测效果评估1)精密性：将c14(包被)-c12(标记)检测卡按检测卡使用方法检测1、7mg/l的cysc参考品各10次重复测定，剔除离群值后计算检测卡精密度。实验结果显示三个浓度检测结果变异系数cv<10％。浓度点(mg/l)17cv9.43％9.75％2)检测范围：将c14(包被)-c12(标记)检测卡检测不同浓度的cysc重组蛋白0.15、0.3、0.625、1.25、2.5、5、10mg/l，拟合曲线及检测范围为0.2-10mg/l(如附图6)。3)线性范围：将高值样本与样本稀释液按照一定比例配制成5个系列浓度样本，用c14(包被)-c12(标记)检测卡检测，每个样本检测3次，将结果与理论浓度进行回归统计，判断在该浓度范围内是否成线性。线性范围为0.2-10mg/l(如附图7)。检测卡灵敏度为0.2mg/l。4)准确度：将c14(包被)-c12(标记)检测卡按检测卡使用方法检测1、7mg/l的cysc参考品各3次重复，计算平均值和理论值的相对偏差，实验结果显示三个浓度检测结果相对偏差b<5％。浓度点(mg/l)17b3.4％4.14％5、准确度—方法学比对：选择同类产品中目前市场上获得良好信誉的广州万孚生物技术股份有限公司胱抑素c定量检测试剂(免疫层析法)作对照产品比对验证。选择30份临床病人标本，按1到20的顺序编号，用对照产品和待评价的c14(包被)-c12(标记)的胶体金检测卡同时进行实验，按照1，2，3......28，29，30，30，29，28......3，2，1的样本顺序进行测定。对照和待评价产品的检测结果相关系数r2＝0.953，说明两种方法检测结果有较好的相关性(如附图8)。6、配方筛选除上述最优制备例1外，申请人还尝试多种制备方案，例如下面几组检测卡制备及应用结果如下表：sequencelisting<110>江苏晶红生物医药科技股份有限公司江苏众红生物工程创药研究院有限公司<120>人胱抑素c胶体金定量检测卡<130>人胱抑素c胶体金定量检测卡<160>38<170>patentinversion3.3<210>1<211>8<212>prt<213>mouse<400>1glytyrthrphethrsertyrtrp15<210>2<211>8<212>prt<213>mouse<400>2valaspproglyserglythrthr15<210>3<211>6<212>prt<213>mouse<400>3thralaglypheasptyr15<210>4<211>6<212>prt<213>mouse<400>4glnasnileasnvaltrp15<210>5<211>3<212>prt<213>mouse<400>5lysalaser1<210>6<211>9<212>prt<213>mouse<400>6glnglnglyglnthrtyrproleuthr15<210>7<211>113<212>prt<213>mouse<400>7glnvalglnleuglnglnproglysergluleuvalargproglythr151015servallysleusercysargalaserglytyrthrphethrsertyr202530trpmethistrpvallysglnarghisglyglnglyleuglutrpleu354045glyasnvalaspproglyserglythrthrasntyrglugluasnphe505560lysthrlysglythrleuthrvalaspthrserserserthrvaltyr65707580methisleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095thralaglypheasptyrtrpglyglnglythrthrleuthrvalser100105110ala<210>8<211>107<212>prt<213>mouse<400>8aspileglnmetasnglnserproserserleuseralaserleugly151015aspthrilethrilethrcyshisalaserglnasnileasnvaltrp202530leuglytrppheglnglnlysprogluasnileprolysleuleuile354045tyrlysalaserthrleuhisthrglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrvalphethrleuthrileserserproglnpro65707580gluaspilealathrtyrtyrcysglnglnglyglnthrtyrproleu859095thrpheglyalaglythrlysleugluilelys100105<210>9<211>8<212>prt<213>mouse<400>9glytyrthrphethraspphetyr15<210>10<211>8<212>prt<213>mouse<400>10iletrpproglyserglyasnthr15<210>11<211>11<212>prt<213>mouse<400>11alaargglythrglythrglytyrpheaspval1510<210>12<211>7<212>prt<213>mouse<400>12glnvalglnilepheserasn15<210>13<211>3<212>prt<213>mouse<400>13alaalalys1<210>14<211>9<212>prt<213>mouse<400>14glnhisphetrpglythrprotyrthr15<210>15<211>118<212>prt<213>mouse<400>15glnvalglnleuglnglnserglyalagluleualaargproglyala151015servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethraspphe202530tyrleuasntrpvallysglnargthrglyglnglyleuglutrpile354045glygluiletrpproglyserglyasnthrtyrtyrasnglulysphe505560lysasplysalathrleuthralaasplysserserserthralatyr65707580methispheserserleuthrsergluaspseralavaltyrphecys859095alaargglythrglythrglytyrpheaspvaltrpglyalaglythr100105110thrvalthrvalserala115<210>16<211>109<212>prt<213>mouse<400>16argtrpgluleuserhismetvalaspleuglnalaalaalaasnser151015leuvaltyrproargphethrmetasppheglnvalglnilepheser202530asnleualatrptyrglnglnlysglnglylysserproglnleuleu354045valtyralaalalysasnleualaaspglyvalproserargpheser505560glyserglyserglythrglntyrserleulysileasnserleugln65707580sergluasppheglysertyrtyrcysglnhisphetrpglythrpro859095tyrthrpheglyglyglythrlysleugluilelysarg100105<210>17<211>24<212>dna<213>mouse<400>17ggctacacattcaccagctactgg24<210>18<211>24<212>dna<213>mouse<400>18gttgatcctggtagcggtactact24<210>19<211>18<212>dna<213>mouse<400>19accgcggggtttgactac18<210>20<211>18<212>dna<213>mouse<400>20cagaacattaatgtttgg18<210>21<211>9<212>dna<213>mouse<400>21aaggcttcc9<210>22<211>27<212>dna<213>mouse<400>22caacagggtcaaacttatccgctcacg27<210>23<211>339<212>dna<213>mouse<400>23caggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtgaggcctggaacttcagtgaagctg60tcctgcagggcttctggctacacattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagagg120catggacaaggccttgagtggctaggaaatgttgatcctggtagcggtactactaactac180gaggagaatttcaagaccaagggcacactgactgtggacacttcctccagtacagtctac240atgcacctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgtaccgcggggttt300gactactggggccaaggcaccactctcactgtctctgca339<210>24<211>321<212>dna<213>mouse<400>24gacatccagatgaaccagtctccatccagtctgtctgcatcccttggagacacaattacc60atcacttgccatgccagtcagaacattaatgtttggttaggctggttccagcagaaacca120gaaaatattcctaaactattgatctataaggcttccaccttgcacacaggcgtcccatca180cggtttagtggcagtggatctggaacagttttcacattaaccatcagcagcccgcagcct240gaagacattgccacttactactgtcaacagggtcaaacttatccgctcacgttcggtgct300gggaccaagttggaaatcaaa321<210>25<211>24<212>dna<213>mouse<400>25ggctacaccttcactgacttctat24<210>26<211>24<212>dna<213>mouse<400>26atttggcctggaagtggtaatact24<210>27<211>33<212>dna<213>mouse<400>27gcaagagggactgggacggggtacttcgatgtc33<210>28<211>21<212>dna<213>mouse<400>28caagtgcagattttcagtaat21<210>29<211>9<212>dna<213>mouse<400>29gctgcaaaa9<210>30<211>27<212>dna<213>mouse<400>30tgtcaacatttttggggtactccgtac27<210>31<211>354<212>dna<213>mouse<400>31caggttcagctgcagcagtctggagctgagctggcgaggcccggggcttcagtgaagctg60tcctgcaaggcttctggctacaccttcactgacttctatctaaactgggtgaagcagagg120actggacag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