专利名称：凝集素样氧化型ldl受体抑制用医药品以及动脉硬化预防医药品的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制凝集素样氧化型LDL受体与氧化型LDL结合的抑制用医药品、以及含有该抑制用医药品的动脉硬化预防医药品。近年来，在包括日本在内的发达国家，随着生活环境的变化、饮食生活的变化，各种生活习惯病患者不断增加。作为主要的生活习惯病，可以列举糖尿病、高血压症、高脂血症等，这些疾病的发病者日益增多。此外，还有迹象表明虽然未出现严重症状但却显示了这样的征兆的所谓预备军呈现增加的趋势。而且，这样的生活习惯病常常成为重症疾病的原因。本申请要求基于2009年6月23日在日本提出的日本特愿2009-148658号的优先权，在此援引其内容。
背景技术：
动脉硬化疾病是由生活习惯病引起的疾病之一，高脂血症、特别是高胆固醇血症是主要成因。目前，以动脉硬化疾病等循环器官疾病的预防、治疗为目的的药剂、特定的保健用食品，是以降低血中的胆固醇、中性脂肪的浓度(量)为指标的。例如，胆固醇合成抑制药中的他汀类、降低中性脂肪的血中浓度的PPAR激动剂对缺血性心脏病等循环器官疾病显示出疗效，得到广泛的使用。由于动脉硬化疾病及其主要成因的生活习惯病是慢性疾病，为了有效地预防，期待可以长期安全服用的有效的预防剂。例如，作为有效预防动脉硬化的药剂，公开了含有苹果来源的多酚作为有效成分的脂联素调节剂(例如，参考专利文献1。)。发现脂联素 (adiponectin)是在脂肪细胞中特异性高表达的分泌蛋白，在随后的研究中才明确其可抑制单核细胞与血管内皮细胞的粘着、平滑肌细胞的增殖等，具有抗动脉硬化的作用，通过调节血中的脂联素量可以实现抗动脉硬化的作用。已有文献报道苹果来源的多酚具有各种各样的功效，其中，具有与脂质代谢有关的功效。例如，有报道称苹果来源的多酚中含有的原花青素，可抑制胰脂肪酶，因此其可抑制甘油三酯的吸收(例如，参考非专利文献1。)。此外，可知LDL(低密度脂蛋白)氧化生成的氧化型LDL对动脉硬化具有促进功能，通过降低血中的氧化型LDL量，可实现抗动脉硬化的作用。例如，公开了一种动脉硬化预防剂，按照干燥重量换算，其以含有低于95重量％比例的原花青素的松树皮提取物为有效成分(例如，参考专利文献2。)。松树皮提取物对血管中的高脂质具有氧化抑制效果，因此，通过服用松树皮提取物可以降低氧化型LDL的血中含量。另一方面，认为氧化型LDL的动脉硬化促进作用，是氧化型LDL介由凝集素样氧化型LDL受体(L0X-1 ；凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1)被血管内皮细胞摄取而产生的。L0X-1被鉴定为血管内皮细胞的氧化型LDL受体，目前公知其是促进炎症、动脉硬化、血栓、心筋梗塞、支架治疗后的血管再狭窄等的循环器官疾病的因子。即，也可以通过抑制氧化型LDL与L0X-1结合以及被血管内皮细胞摄取，来实现抗动脉硬化作用。作为具有这样的L0X-1抑制作用的预防剂，公开了含有属于碗蕨科 (Dennstaedtiaceae)的蕨菜的植物提取物作为有效成分的具有L0X-1拮抗作用的组合物 (例如，参考专利文献3。)，含有属于芸香科的植物提取物作为有效成分的具有L0X-1拮抗作用的动脉硬化抑制剂(例如，参考专利文献4。)，现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开2006-193502号公报专利文献2 日本特开2005-23032号公报专利文献3 日本特开2007-297381号公报专利文献4 日本特开2007-320956号公报非专利文献非专利文献1 7 ￥ Y (Sugiyama)、外6名、夕Y — f卟·才歹· 7夕’丨J力化千工 y >l· , 7 > Y 7 一 F · Vr 彡 7 卜 1J 一 (Journal of Agricultural and Food Chemistry)、 2007年、第55卷、第4604 4609页。
发明内容
发明要解决的问题专利文献1和2中记载的预防剂与他汀类等相同，其目的在于通过抑制血中脂质水平来预防动脉硬化。与其相比，专利文献3和4中记载的预防剂，是以阻断氧化型LDL等的引起动脉硬化的脂蛋白的作用点为目的的全新机制的预防、治疗方法。然而，上述预防剂对氧化型LDL与L0X-1的结合以及被血管内皮细胞摄取的抑制效果并不充分，需要寻找更有效的动脉硬化预防剂。本发明是鉴于上述问题而进行的，其目的在于鉴定一种具有优异的凝集素样氧化型LDL受体抑制作用的化合物，并提供一种对于治疗或预防那些以L0X-1为恶化因素发挥作用的疾病、特别是动脉硬化疾病有用的医药品。需要说明的是，本发明和本申请说明书中的“凝集素样氧化型LDL受体抑制作用” 意指抑制L0X-1与氧化型LDL结合、抑制氧化型LDL被摄取至细胞内的作用。解决问题的方法本发明人等基于上述现有技术，进一步研究了具有高凝集素样氧化型LDL受体抑制作用的物质，其结果发现在原花青素中，三聚体以上的物质具有很强的效果，从而完成了本发明。S卩，本发明提供(1) 一种凝集素样氧化型LDL受体抑制用医药品，其特征在于，以3倍体以上的原花青素作为有效成分。(2)上述(1)所述的凝集素样氧化型LDL受体抑制用医药品，其特征在于，所述原花青素来源于包括苹果、葡萄种子、花生内皮以及松树皮在内的植物。(3) 一种动脉硬化预防医药品，其特征在于，含有三聚体以上的原花青素作为有效成分，具有凝集素样氧化型LDL受体抑制作用。
(4)上述(3)所述的动脉硬化预防医药品，其特征在于，所述原花青素来源于包括苹果、葡萄种子、花生内皮以及松树皮在内的植物。发明的效果本发明的凝集素样氧化型LDL受体抑制用医药品及使用了该凝集素样氧化型LDL 受体抑制用医药品的动脉硬化预防医药品，可以有效地抑制氧化型LDL与凝集素样氧化型 LDL受体的结合，抑制氧化型LDL被摄取至细胞内。此外，作为本发明的凝集素样氧化型LDL 受体抑制用医药品等的有效成分的原花青素，一直以来是饮食品中含有的化合物，即使长期服用也几乎未见报道有副作用，是安全性高的化合物。因此，期待可以通过持续地摄取本发明的凝集素样氧化型LDL受体抑制用医药品等，有效地预防动脉硬化疾病，降低罹患该疾病的风险。
[图1]是表示实施例1中各聚合度的原花青素在450nm处的吸光度(0D450)的测定结果的图。[图2]是表示实施例2中各聚合度的原花青素的算出的氧化型LDL摄取率(％) 的图。[图3]是表示实施例3中添加了各种多酚时的氧化型LDL摄取率(％)的图。[图4]是表示实施例4中的添加了各种原花青素时的氧化型LDL结合率(％)的图。[图5]是表示实施例5中添加了4种不同结构的三聚体原花青素时的氧化型LDL 结合率(％ )的图。[图6]是表示实施例7中的口服摄取AP的大鼠肠系膜动脉中脂质的染色图像 (A)、以及在肠系膜动脉中观察到的脂质沉积个数(B)的图。[图7]表示的是实施例7中的口服摄取AP的大鼠血中的氧化型LDL浓度。发明的
具体实施例方式原花青素是具有下述结构的化合物黄烷-3-醇在4-8位或4-6位的碳之间反复缩合，代表性的原花青素具有下述结构(+)_儿茶素和(-)_表儿茶素在4-8位或4-6位的碳之间反复缩合。原花青素会因黄烷-3-醇结合位置的不同(结合在6位或8位的位置上的)、结合的是何种黄烷-3-醇即结合种类的不同、以及结合的单体间产生的立体构象的影响而具有复杂的结构。本发明人等使用测定人L0X-1蛋白质和氧化型LDL结合的ELLSA系统，对从约500 种食品素材中得到的具有凝集素样氧化型LDL受体抑制作用(以下称作“L0X-1抑制作用”) 的化合物进行了研究。ELISA系统是对&ito等人的方法(参考Atherosclerosis、2008年、 第200卷第2号、第303 309页。)改良进行的。结果发现苹果来源的多酚具有L0X-1抑制作用。进一步有新发现对于在细胞表面表达L0X-1的细胞而言，在苹果来源的多酚的存在下，使氧化型LDL发生反应时，L0X-1与氧化型LDL的结合被抑制，进而抑制氧化型LDL被细胞摄取，即，苹果来源的多酚具有L0X-1抑制作用。此外还发现主要在原花青素、特别是三聚体以上的原花青素中观察到了强烈的所述苹果来源的多酚的L0X-1抑制作用。本发明的凝集素样氧化型LDL受体抑制用医药品(以下称作“L0X-1抑制用医药品”)的特征在于以三聚体以上的原花青素作为有效成分。原花青素具有的L0X-1抑制作用依赖于原花青素的聚合度，聚合度大的原花青素具有较高的L0X-1抑制作用。本发明的 L0X-1抑制用医药品以聚合度为3以上的较大的原花青素类化合物作为有效成分，由此能够达到比聚合度为2以下的原花青素类化合物(二聚体或单体原花青素)或未按照聚合度另行纯化的原花青素明显优异的L0X-1抑制作用。需要说明的是，本发明人等首先发现原花青素具有的L0X-1抑制作用依赖于原花青素的聚合度。本发明的L0X-1抑制用医药品，可以仅以特定聚合度的原花青素作为有效成分， 也可以以聚合度不同的多种原花青素的混合物作为有效成分。本发明的L0X-1抑制用医药品，优选使用从后述的原料植物中提取/纯化得到的原花青素中除去了单体及二聚体原花青素的聚合度为3以上的全部原花青素作为有效成分。需要说明的是，在本申请说明书中的“单体原花青素”意指儿茶素类(儿茶素、表儿茶素)。此外，作为本发明的L0X-1抑制用医药品的有效成分，只要是聚合度为3以上的原花青素即可，并不限定于具有特定结构的化合物。这是因为只要聚合度在3以上，具有上述任意结构的原花青素均具有L0X-1抑制作用。需要说明的是，结构为至少1个缩合部位在黄烷-3-醇的4-6位碳间进行缩合的原花青素、末端为表儿茶素的原花青素具有较强的L0X-1 抑制作用，因此优选包含具有上述结构的原花青素作为有效成分。三聚体以上的原花青素可以是通过公知的有机合成法合成的原花青素，也可以将含有原花青素的植物作为原料，从该原料植物得到原花青素级分后，使用基于聚合度纯化的天然原花青素。天然原花青素可以通过下述方法得到例如，从原料植物中提取原花青素得到提取物，然后从提取物中获得含有原花青素的原花青素级分后，通过柱色谱法从所述原花青素级分中纯化聚合度为3以上的原花青素。作为原料植物，可以列举如下例如，蔷薇科的苹果、金丝桃科的山竹果、木犀科的橄榄、葡萄科的葡萄、杜鹃花科的蔓越莓、越橘、石榴科的石榴、虎耳草科的黑茶子、梧桐科的可可树、豆科的大豆(黑豆)、落花生(花生)、松等的树皮等。可以使用上述植物中的原花青素含量较多的组织、容易提取的组织作为原料。作为本发明的L0X-1抑制用医药品的有效成分，优选苹果、葡萄、花生、或松树来源的原花青素，进一步优选从苹果的果实、葡萄的种子、花生的内皮、松树的树皮提取/纯化而成的原花青素。其中特别优选苹果的果实来源的原花青素。从原料植物提取原花青素，只要是可以在不损害原花青素的条件下从植物中提取的方法即可，并无特殊限定，可以按照常规方法进行。例如，从原料植物采集果实、种子、叶、 茎、树皮等组织，进行适当的碎断、粉碎处理等以后，在水、醇类等有机溶剂中进行加热提取，得到含有原花青素的提取物。使用有机溶剂提取的情况下，可以通过蒸馏法等从提取物中除去有机溶剂。此外，对于苹果等果实的情况下，可以将按照常规方法得到的原料果实的榨汁果汁作为提取物。需要说明的是，榨汁果汁、除去了有机溶剂的提取物，可以直接使用， 但优选使用经过离心分离、过滤等工序得到的澄清的果汁或提取物。可以按照常规方法从上述得到的提取物中获得原花青素级分。原花青素级分可以通过1步纯化操作来制备，也可以通过多步纯化操作来制备。例如，使用可吸附多酚的吸附剂等从由原料植物得到的提取物中分离纯化多酚级分，再使用吸附色谱法等从得到的多酚级分中纯化原花青素级分。作为可吸附多酚的吸附剂，可以列举如下例如，离子交换树脂、合成吸附树脂、硅胶等吸附剂、凝胶过滤剂等。提取物中的多酚向吸附剂的吸附、洗脱可以按照常规方法进行。例如，使由原料植物得到的提取物通过填充有吸附剂的柱子，使多酚类吸附。需要说明的是，向柱子通液之前，预先将该提取物的PH调整至4 9、优选5 7、进一步优选5 6。接着在该柱子中充分地通液纯水或去离子水(PH5 7)，除去柱子中的非吸附物质(糖类、有机酸类等)后，可以使用醇类溶剂、例如，10 90%、优选30 80%的醇类将多酚洗脱。按照上述得到的多酚级分以原花青素为主要成分，此外，还含有氯原酸等咖啡酸衍生物 (酯)、对香豆酸衍生物、黄烷-3-醇类(儿茶素类)、槲皮黄素糖苷等黄酮醇类、根皮素糖苷等查耳酮类等的多酚类。作为用于从多酚级分中分离纯化原花青素级分的吸附色谱柱的固定相，可以使用与前述吸附剂相同的物质。需要说明的是，向柱子通液前，预先将该多酚级分的PH调节为 4 9、优选5 7、进一步优选5 6。进一步地，优选在洗脱前预先使用纯水或去离子水 (pH5 7)对柱子进行充分清洗。此外，作为洗脱溶剂(流动相)，只要是能够将原花青素从柱子固定相上洗脱的时间、原花青素以外的多酚从柱子固定相上洗脱的时间完全区分开的溶剂即可，可以考虑柱子固定相的种类、使用的装置等适当确定。例如，对于溶解在甲醇中的多酚级分，以硅胶作为柱子固定相，通过以己烷-甲醇-丙酮为洗脱溶剂的二元梯度洗脱吸附色谱，使原花青素以外的多酚在原花青素之前洗脱出来，而且，可以按照从原花青素聚合度小的成分开始依次进行洗脱(例如，参考非专利文献1。)。因此，通过使用标准品等预先检测各聚合度的原花青素的洗脱时间，可以得到仅含有所需聚合度的原花青素的原花青素级分。此外，通过回收三聚体原花青素以后的所有洗脱级分，可以得到含有聚合度在3以上的全部原花青素的级分。此外，例如，回收二聚体原花青素以后的洗脱级分，并进行浓缩、冷冻干燥后，使其再次溶解在甲醇中，同样地，通过吸附色谱进行分离，能够以更高的纯化度状态回收所需聚合度的原花青素级分。作为本发明的L0X-1抑制用医药品的有效成分，可以直接使用按照上述方法得到的原花青素级分，也可以使用将该原花青素级分浓缩后的浓缩液。例如，通过在25 100°C、优选35 90°C下减压浓缩，从该原花青素级分中除去甲醇等溶剂，将其浓缩。此夕卜，也可以使用通过下述处理制成的粉末状物质将所得原花青素级分浓缩后，直接将得到的浓缩液喷雾干燥或冷冻干燥处理、或向其中添加糊精等粉末助剂后进行喷雾干燥或冷冻干燥处理。进一步地，也可以将粉末状原花青素溶解在乙醇等有机溶剂、柠檬酸等有机酸等中，以溶解在优选溶剂中的原花青素的形式使用。需要说明的是，作为使原花青素溶解的溶齐U，可以使用例如，乙醇等有机溶剂、柠檬酸等有机酸等。关于本发明L0X-1抑制用医药品中含有的三聚体以上的原花青素的量，只要是足以实现L0X-1抑制作用的量即可，并无特殊限定，可以考虑到原花青素的纯化度、剂型、或摄取方法等适当确定。本发明中为了实现更充分的L0X-1抑制作用，三聚体以上的原花青素的含有比例优选为L0X-1抑制用医药品的50%以上，进一步优选为80%以上，更优选为 100%。此外，本发明的L0X-1抑制用医药品只要不损害三聚体以上原花青素的L0X-1抑制作用，还可以含有其他成分。例如，可以添加赋形剂、稳定化剂、防腐剂、粘度调节剂等通常使用的辅助原料、添加剂。服用本发明的L0X-1抑制用医药品可以取得优异的L0X-1抑制效果，因此，基于治疗或预防以LDL为恶化因素发挥作用的疾病、例如炎症、动脉硬化、血栓、心筋梗塞、支架治疗后的血管再狭窄等目的，优选添加本发明的L0X-1抑制用医药品作为摄取的医药品有效成分。特别是通过将本发明的L0X-1抑制用医药品作为有效成分，即，以三聚体以上的原花青素作为有效成分，可以制造安全性优异且预防效果高的动脉硬化预防医药品。以本发明的L0X-1抑制用医药品作为有效成分的动脉硬化预防医药品(以下称作本发明的动脉硬化预防医药品)可以按照常规方法制造。此外，制造上述药品时，可以添加通常所使用的辅助原料、添加剂。作为上述原料及添加剂，可以列举如下例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甜菊糖、甜茶素、玉米糖浆、乳糖、L-抗坏血酸、dl-α -生育酚、 异抗坏血酸钠、甘油、丙二醇、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、阿拉伯胶、角叉菜胶、酪蛋白、明胶、果胶、琼脂、维生素C、维生素B群、维生素Ε、烟酰胺、泛酸钙、氨基酸类、钙盐类、表面活性剂、色素、香料、防腐剂等。此外，作为本发明的L0X-1抑制用医药品或本发明的动脉硬化预防医药品的剂型，只要是可以实现L0X-1抑制作用的剂型即可，并无特殊限定，可列举如下片剂、液剂、 胶囊剂、饮料剂、含片等。本发明动脉硬化预防医药品中的三聚体以上的原花青素的量，只要是足以实现 L0X-1抑制作用的量即可，并无特殊限定。可以考虑原花青素的纯化度、剂型、或摄取方法、 摄取对象的性别、年龄、体重、健康状况等适当确定。为了达到L0X-1抑制效果及动脉硬化预防效果，可以使本发明的L0X-1抑制用医药品或动脉硬化预防医药品中含有的三聚体以上的原花青素为例如，以干燥重量来计，成年人每日摄取的三聚体以上的原花青素的摄取量为10 3000mg、优选30 lOOOmg。此外， 本发明的LOX-I抑制用医药品及动脉硬化预防医药品可以1日分为1 数次口服摄取。
实施例下文将示出实施例对本发明作以更为详细的说，但本发明并不限定于以下的实施例。[制备例1苹果来源的多酚(AP)的制备]将青森县产的苹果幼果300kg粉碎，压榨得到果汁210kg。向得到的果汁中加入果胶酶使其量为30ppm，进行澄清化，离心分离后，用硅藻土(Silika300S、中央Silika公司制造)进行过滤，进一步澄清化，得到澄清果汁。将澄清果汁通液至填充有吸附树脂(DIAI0N SP-850、三菱化学公司制造)的柱子中，使多酚类吸附。接着通液纯水，除去柱子中的非吸附物质(糖类、有机酸类等)后，使用40%乙醇洗脱多酚类。从得到的多酚级分中将乙醇减压浓缩，制备提取粉末(AP)约^^。使用反相高效液体色谱分析提取粉末中的成分，结果确认包含氯原酸类(约20重量％ )、根皮素糖苷类(约5重量％ )、黄酮醇类(约15重量％ )、原花青素(约50重量％ )及其他褐变物质(约10重量％ )。进一步地，由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/MS、Applied Biosystems公司制造)解析的结果可以确认该原花青素类为黄酮醇类的儿茶素、表儿茶素所构成的二聚体-十五聚体的寡聚物、聚合物(参考 M. Ohnishi-kameyama, et. al. Mass Spectrometry、1997 年、第 11卷、第31 36页。)以下实施例中使用AP的情况下，将该提取粉末AP混悬于生物化学用试剂级别的二甲基亚砜(DMSO)(和光纯药公司制造)中，并使用超纯水适当稀释，使得反应溶液的DMSO 终浓度为以下。[制备例2聚合度不同的原花青素的制备]基于非专利文献1中记载的方法(吸附色谱法)，从AP中分离纯化各聚合度的原
花青素。首先，将上述制备的粉末状AP溶解于甲醇中，然后将其上样于填充有硅胶的柱子 Inertsil PREP-SIL(GL Science公司制造)上，并使用己烷-甲醇-丙酮作为洗脱溶剂进行二元梯度洗脱。由此，首先将原花青素以外的多酚洗脱下来，然后，将原花青素从聚合度小的开始依次洗脱出来。将洗脱下来的二聚体原花青素以后的级分全部回收，将其作为原花青素级分。然后，将该原花青素级分浓缩、冷冻干燥后，再次溶解在甲醇中，同样地使用吸附色谱进行分离，分别回收各聚合度的原花青素级分。但是，将八聚体以上的原花青素作为 1个级分进行回收。将上述回收的级分浓缩、冷冻干燥以后，使用生物化学用试剂级别的 DMSO(和光纯药公司制造)将其混悬。需要说明的是，在以下的实施例中使用时，使用超纯水对该DMSO混悬液进行适当稀释，使得反应溶液的DMSO终浓度为1 %以下。需要说明的是，本制备例中使用AP，但是，在使用其他植物来源的多酚时，也可以同样地分别制备各聚合度的原花青素级分。[制备例3ex-hL0X_l的制作]将人 L0X-1 CDNA (Genbank :NM002543)中编码细胞外域(ex_hL0X_l)的区域 (61 273号的碱基序列)插入表达用载体pSecTag/FRT/V5His (Invitrogen公司制造)， 进一步插入编码Ig K selection signal的碱基序列，使得在ex-hLOX-lN末端附加上该信号以制作 ex-hLOX-1 表达用质粒。使用 FreeStyle 293 Expression System(Invitrogen 公司制造)将该质粒转染至细胞，使ex-hLOX-Ι表达。将转染的细胞培养4天以后，使用Ni-NTA superflow cartride (Qiagen公司制造)从培养液中回收表达的蛋白质 ex-hL0X-l。[制备例4固定了ex-hLOX-Ι的ELISA用板的制作]首先，使用PBS将制备例3制作的ex-hLOX-Ι调节为5 μ g/mL，将得到的蛋白质溶液以50 μ L/孔分别注入384孔EIA Plate (GREINER公司制造、制品编号781061)。将该平板在4°C静置一晚，使ex-hLOX-Ι固定于孔内。然后，使用PBS清洗各孔3次，接着分别向各孔以80 μ L/孔的量注入含有3% BSA的HEPES缓冲液，进行阻断处理。然后，再使用PBS将各孔清洗3次，将其作为ELISA用板。需要说明的是，BSA使用Sigma公司的A-7888，HEPES 缓冲液使用GIBCO公司的15630和WAKO公司的191-01665调制为IOmM HEPES, 150mM NaCl， 并将其调节为PH7.0。[制备例5氧化型LDL的制作]首先，将血浆从采集至添加了含有ACD (acid-citrate-dextrose)缓冲液的采血管中的健康人血液中分离回收。向得到的血浆中加入溴化钾，将比重调节为1.019，然后以 58000rpm离心分离处理20小时。将得到的下层液转移至其他的管中，用溴化钾将比重调节
9为1. 063后，以58000rpm离心分离处理20小时。需要说明的是，超速离心机使用Beckman公司制造的 L-80。使用 SliDe-A-Ly ζ er (注册商标)Dialysis Cassettes IOK MWCO (takara 公司制造)，以PBS作为外液，对回收的上层液进行透析(外液更换4次)，得到纯化人LDL。使用BCA Protein Assay Kit (pierce公司制造)测定蛋白质量，向以PBS调节后的纯化人LDL浓度为3mg/mL的溶液中添加硫酸铜，使其为7. 5 μ M，然后在37°C的CO2培养箱内培养16小时。接着，以含有2mMEDTA的0. 15M氯化钠溶液作为外液，对该溶液进行透析(外液更换4次)，得到人氧化型LDL。[制备例6DiI标记氧化型LDL的制备]使用含有2mM EDTA的0. 15M氯化钠溶液对制备的人氧化型LDL进行稀释，调节其为lmg/mL。向该人氧化型LDL溶液中分别添加DiI (#D282、Invitrogen公司制造)，使其终浓度为0. ;3mg/mL，添加Lipoprotein Deficient Serum (Sigma公司制造)，使其终浓度为 5mg/mL，使其在37。C反应18小时。需要说明的是，DiI使用悬浮在DMSO中浓度为30 μ g/ mL的溶液。反应后，使用氯化钠和溴化钾将比重调节为1. 15，然后以58000rpm离心分离处理 20 小时。使用 Slide-A-Lyzer (注册商标)Dialysis Cassettes IOK M WC0(takara 公司制造)，以含有2mM EDTA的0. 15M氯化钠溶液作为外液，对回收的上层液进行透析(外液更换4次)、得到DiI标记氧化型LDL。[制备例7TetOn hLOX-1 CHO细胞的制备]使用四环素调控表达系统(Clontech公司制造)，制备能够通过添加多西环素实现hLOX-Ι的表达诱导的培养细胞。需要说明的是，作为细胞的培养基，使用分别添加了 Antibiotics-Antimicotics (GIBC0公司制造)且其终浓度为1%、添加了 FBS且其终浓度为 10%的 Ham ‘S F-12+GlutaMAX(GIBC0 公司制造)。首先，制备将人L0X-1 cDNA(Genbank :NM002543)插入表达载体 pTRE2hy g(Contech公司制造)中得到的hLOX-Ι表达用载体。使用Lipofectamin 2000转染试剂 anvitrogen公司制造)将上述hLOX-Ι表达用载体转染至CH0-K1 Tet-On细胞(Clontech 公司制造)。向培养基中分别添加潮霉素B (WAK0公司制造)，使其终浓度为400 μ g/mL,添加G418(calbi0chem公司制造)，使其终浓度为100 μ g/mL，由此可以选择出导入了 hL0X_l 表达用载体的细胞，将其用作iTetOn hLOX-1 CHO细胞。[制备例8抗L0X-1抗体的制备]以Sawamura等的方法(参考NAture、1997年、第386卷、第73 7页。)为基准制造抗L0X-1抗体。S卩，以5mM EDTA-PBS对表达hL0X_l的CHO细胞进行处理(室温、5分钟)后，将其混悬于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液〔25mM HEPES (pH 7. 4)、IOmM氯化镁、0. 25M蔗糖以及蛋白酶抑制剂(10U/mL抑肽酶、2 μ g/mL抑肽素、50 μ g/mL亮肽素、和0. 35mg/mL APMSF)〕中， 使用Potter式勻浆器进行破碎，并进行低速离心分离处理(1500rpm、10分钟、4°C)。接着， 回收上清液，进行超离心分离处理(100，OOOXgU小时、4°C )，将沉淀的膜级分回收，在磷酸缓冲液中混悬，并保存在-20°C。将上述混悬液用于制作人抗体(免疫源)。用得到的细胞膜级分对正常小鼠进行免疫，制备对hLOX-Ι的小鼠单克隆抗体。单克隆抗体的制备，是按照实验医学(增刊)细胞工学手册(黑木登志夫等编撰、 羊土社发行、p66-74、1992年)及单克隆抗体实验操作入门(安东民卫等著、讲谈社发行、1991年)中记载的一般方法制备。需要说明的是，抗L0X-1抗体是以L0X-1作为抗原的特异抗体，是通过抗原抗体反应对L0X-1显示拮抗作用的物质。[实施例1通过ELISA对L0X-1和原花青素的结合进行评价]通过对&ito等人的方法(Atherosclerosis、2008年、第200卷第2号、第303 309页参照。)进一步改良而成的方法，对制备例1和2中制备的AP和各聚合度原花青素与L0X-1的结合性进行评价。具体而言，使用在制备例4中制备的ELISA用板和制备例5 中制备的氧化型LDL，在向反应溶液中添加原花青素等的情况下，研究是否抑制了 L0X-1和氧化型LDL的结合。首先，将各样品以每孔40 μ L的量分别注入至ELISA用板，所述样品是向上述 ELISA测定用缓冲液中分别添加氧化型LDL且终浓度为250ng/mL，添加各种原花青素(包含AP)且终浓度为12. 5、25、50、100、200、或^Oyg/mL。将该板在室温下静置2小时后，用 PBS清洗各孔5次。然后，将用含有1 % BSA和2mM EDTA的HEPES缓冲液稀释了 500倍的抗人载脂蛋白B抗体AntiHuman Apolipoprotein B PEROX (结合位点PP086)的稀释液，以每孔50 μ L分别注入各孔，然后在室温下静置1小时。静置后，使用PBS清洗各孔5次，使用TMB Peroxidase EIA substrate kit (BiO-RAD 公司制造、产品编号:68-12-2 (A) 2722-84-1 (B)) 使TMB显色。向各孔添加2M硫酸使显色反应停止，然后测定450nm的吸光度。图1是表示各聚合度的原花青素在450nm处吸光度(0D450)的测定结果的图。图中，“Xmer”意指X聚体的原花青素，“彡8mer”意指八聚体以上的原花青素。吸光度越小，与L0X-1结合的氧化型LDL越少，表示L0X-1与氧化型LDL的结合被原花青素或 AP抑制。该结果表明AP抑制了 L0X-1与氧化型LDL的结合，S卩，具有L0X-1抑制作用。此夕卜，在原花青素中也观察到了上述L0X-1抑制作用，因此，推测AP的L0X-1抑制作用主要是原花青素产生的。特别是，发现三聚体以上的原花青素具有强L0X-1抑制作用。[实施例2L0X-1表达细胞的氧化型LDL的摄入抑制评价]接着，通过表达L0X-1的细胞中摄入氧化型LDL的量，对原花青素以怎样的程度抑制L0X-1与氧化型LDL的结合进行评价。具体而言、利用使人L0X-1强制过剩表达的CHO细胞(以下称L0X-1表达细胞)摄取氧化型LDL，观察AP及原花青素对介由L0X-1的荧光标记氧化型LDL的摄取所产生的影响。需要说明的是，使用制备例7中制备的TetOn hLOX-lCHO 细胞作为L0X-1表达细胞，使用制备例6中制备的DiI标记氧化型LDL作为荧光标记氧化型LDL。此外，AP和原花青素使用制备例1和2中制备的AP以及各聚合度的原花青素。首先，将使用上述培养基调节至IX IO5细胞/mL的L0X-1表达细胞溶液以每孔 IOOyL分别注入96孔板(Costar公司制造、产品编号3603)的各孔中。此外，为了进行 L0X-1的诱导表达，添加多西环素(Calbiochem公司制造)且终浓度为1 μ g/mL。将该96 孔板在CO2培养箱内于37°C下培养M小时，然后，使用FBS(-)培养基清洗各孔。需要说明的是，FBS(-)培养基是仅从上述培养基中除去了 ras的培养基。然后，以IOOyL每孔分别向各孔中注入用FBS(-)培养基调节至0. 3、1、3、或 10 μ g/mL的各种原花青素(包含AP)，然后，在CO2培养箱内于37°C下培养1小时。使用 FBS (-)培养基清洗各孔，然后以IOOyL每孔向各孔中分别注入用FBS(-)培养基调节至 1 μ g/mL的DiI标记氧化型LDL，在(X)2培养箱内于37°C下培养2小时。使用FBS (-)培养基清洗各孔2次，然后向各孔中添加10%中性缓冲福尔马林液(WAK0公司制造)，进行细胞固定处理，进一步地，添加1 μ g/mL的DAPI溶液(Sigma公司制造)，进行核染色。使用In Cell Analyzer 1000 System(GE healthcare 公司制造)，测定该 96 孔板中各孔的DiI荧光强度及核数。由测定结果，按照下式(1)，求出每个细胞的荧光强度。式(1)每个细胞的荧光强度=[一个孔的DiI荧光强度]/[ 一个孔的核数]进一步地通过下式(2)计算出氧化型LDL摄取率(％ )。需要说明的是，A为未添加各种原花青素(包含AP)的孔的每个细胞的荧光强度，B为未添加DiI标记氧化型LDL的孔的每个细胞的荧光强度，X为未添加各种原花青素(包含AP)和DiI标记氧化型LDL的孔的每个细胞的荧光强度。式(2)氧化型LDL 摄取率(% ) = (X-B)/(A-B) X 100图2表示的是各聚合度原花青素的计算出的氧化型LDL摄取率(％)的图。图中的“Xmer”和“彡8mer”与图1相同。其结果为氧化型LDL摄取率降低，可以确认与实施例 1的结果相同，AP和二聚体以上的原花青素依赖于浓度地抑制L0X-1和氧化型LDL的结合。 特别是，三聚体以上的原花青素在低于AP的低浓度下达到了较高的L0X-1抑制效果。另一方面，在单体原花青素中未观察到L0X-1抑制作用。需要说明的是，如本实施例所示，通过使用了 L0X-1表达细胞和荧光标记氧化型 LDL的检测系统，不同于将是否抑制动脉硬化作为指标的其他动脉硬化抑制剂的筛选方法， 以与各种循环器官疾病恶化相关的L0X-1为焦点，能够筛选出对L0X-1具有抑制作用的物质。[实施例3其他植物来源的原花青素氧化型LDL的摄取抑制评价]同样地，对苹果以外的其他植物来源的原花青素是否具有L0X-1抑制作用也进行了研究。需要说明的是，代替原花青素，使用含有大量原花青素的各种多酚〔AP (制备例1中制备的物质)、葡萄种子来源多酚(ΚΙΚΚ0ΜΑΝ公司制造、商品名=Gravinol)、花生内皮来源的多酚(岸本产业公司制造)、及松树皮来源多酚(TRADEPIA公司制造)〕作为测定试样。具体而言，除了使用以FBS(-)培养基调节为10 μ g/mL的各种多酚代替各种原花青素以外，其他按照与实施例2相同的方法进行测定，计算出氧化型LDL摄取率(％)。需要说明的是，以替代各种多酚添加了相同浓度的DMSO溶液而得到的样品作为空白。图3是表示空白或添加了各种多酚时的氧化型LDL摄取率(％)的图。结果发现 在AP中观察到的对氧化型LDL与L0X-1的结合抑制作用，在其他含有原花青素的素材即松树皮、葡萄种子、花生内皮来源的多酚中也能观察到，可确认它们具有L0X-1抑制作用。与AP相同，各种多酚含有大量原花青素，因此，由本实施例的结果可知从各种多酚中分离纯化的三聚体以上的原花青素具有和各种多酚一样的L0X-1抑制作用。[实施例4利用L0X-1表达细胞进行氧化型LDL的结合抑制评价]氧化型LDL向细胞内的摄取，据报道除了介由L0X-1以外，小凹(Caveolae)、网格蛋白(clathrin)也起到一定作用。因此，为了更直接地对L0X-1和氧化型LDL结合的抑制效果进行评价，将细胞置于低温条件下，在抑制内吞作用的条件下，对原花青素是否抑制 L0X-1和氧化LDL的结合进行评价。首先，将使用上述培养基调节至IX IO5细胞/mL的L0X-1表达细胞溶液以每孔 IOOyL分别注入96孔板(Costar公司制造、产品编号3603)的各孔中。此外，为了实现L0X-1的诱导表达，添加多西环素(Calbiochem公司制造)且使其终浓度为1 μ g/mL。需要说明的是，也制备了不添加多西环素、不诱导表达的孔作为对照。将该96孔板在(X)2培养箱内于37°C下培养M小时，然后，使用冷却至4°C的上述FBS (-)培养基清洗各孔。将该96孔板在冰上静置30分钟，放入冰箱中静置，然后使用冷却至4°C的FBS (-) 培养基调节各种原花青素(包含AP)至0.1 μ g/mL，将其以100 μ L每孔分别注入各孔中， 然后在冰上静置1小时，放入冰箱中静置。此时，将分别注入了冷却至4°C的FBS(-)培养基(其中，代替各种原花青素添加了等浓度的DMS0)得到的样品，作为空白。此外，代替各种原花青素，分别注入用冷却至4°C的FBS (-)培养基调节至0. 3 μ g/mL的抗L0X-1抗体溶液，将其作为阳性对照。需要说明的是，抗L0X-1抗体使用制备例8中制备的物质。使用冷却至4°C的FBS (-)培养基清洗各孔，然后以100 μ L每孔向各孔中分别注入用冷却至4°C的FBS (-)培养基调节至1 μ g/mL的DiI标记氧化型LDL，在冰上静置1小时， 放入冰箱中静置。使用冷却至4°C的FBS(-)培养基清洗各孔2次，然后向各孔中添加冷却至4°C的10%中性缓冲福尔马林液(WAK0公司制造)，进行细胞固定处理，回到常温后，添加 1 μ g/mL的DAPI溶液(Sigma公司制造)，进行核染色。使用In Cell Analyzer 1000 System(GE healthCare 公司制造)测定该 96 孔板中每孔的DiI荧光强度及核数，按照与实施例2相同的方法，求出每个细胞的荧光强度。进一步地，通过下式(3)计算出氧化型LDL结合率(% )。需要说明的是，A、B和 X与上式(2)相同。式(3)氧化型LDL 结合率(% ) = (X-B)/(A-B) XlOO图4是表示添加了各种原花青素时氧化型LDL结合率(％ )的图。图中的“Xmer” 及“彡Smef与图1相同。此外，“未诱导”是指，未添加多西环素，未进行表达诱导的孔的结果。该结果在未诱导L0X-1表达的孔中，几乎不结合氧化型LDL。此外，在添加了与L0X-1 结合的抗L0X-1抗体的孔中，氧化型LDL结合率为53%左右，可确认抑制了与氧化型LDL的结合。由上述结果可知，确认本实施例的检测系统能够测定各种原花青素对L0X-1与氧化型LDL结合的影响。如图4所示，确认AP和二聚体以上的原花青素能够抑制L0X-1和氧化型LDL的结合。特别是，三聚体以上的原花青素达到了比AP更高的L0X-1抑制效果。相比之下，单体原花青素未观察到L0X-1抑制作用。[实施例5不同结构原花青素对氧化型LDL的结合抑制评价]对不同结构的原花青素对L0X-1抑制作用的效果是否有差异进行了研究。使用反相色谱，将制备例2中制备的三聚体原花青素按其结构进一步分离纯化， 使用上述物质，按照与实施例4相同的方法，评价其对氧化型LDL的结合抑制。首先，将制备例2中制备的三聚体原花青素溶解在水中，然后上样至柱子 Inertsil 0DS-3 (GL Science 公司制造、4 μ m Cp20><250mM )，以 20 % 甲醇作为流动相， 在流速为12. OmL/min、柱子温度为40°C的条件下进行洗脱。使用UV检测器测定洗脱液在 280nm下的吸光度，检测出保留时间为14 M分钟之间有3个峰，40 55分钟之间有1 个峰。对各峰的级分进行再纯化。首先，将保留时间为14 M分钟的级分浓缩、冷冻干燥，然后使其再次溶解于水中，上样至柱子hertsil ODS-3 (GLScience公司制造、4um920x250mM)上，以15%甲醇作为流动相，在流速为12. OmL/min、柱子温度为40°C 的条件进行洗脱。使用UV检测器测定洗脱液在^Onm下的吸光度，分别检测出保留时间为33 37分钟之间有1个峰(峰1)、40 44分钟之间有1个峰(峰幻、及48 58分钟之间有1个峰(峰3)。与其不同，将第1次的反相色谱中保留时间为40 55分钟之间的级分浓缩、冷冻干燥，然后使其再次溶解于水中，上样至柱子hertsil ODS-3 (GLScience公司制造、 4μπιφ20χ250π Μ)，以20%甲醇作为流动相，在流速为12. OmL/min、柱子温度为40°C的条件进行洗脱。使用UV检测器测定洗脱液在^Onm下的吸光度，检测出保留时间为40 55分钟之间有1个峰(峰4)。分别将峰1 4的各级分浓缩、冷冻干燥，然后使用生物化学用试剂级别的 DMSO(和光纯药公司制造)使其混悬后使用。测定氧化型LDL的结合抑制时，使用超纯水对其进行适当稀释，使反应溶液中DMSO的终浓度为以下。对各峰的三聚体原花青素结构进行研究可知为表1的化合物(J. Agric. Food Chem.，2003，vol. 51, p3806_3813)。表中，“印i”意指表儿茶素，“cat”意指儿茶素， "(4β - 8) ”意指在4-8位的碳之间缩合而成的结构。[表1]
峰 1 epi(4g — 8)epi(4g — 8) cat~ 峰 2 epi(4g 6)epi(4g 8) cat~ 峰 3 epi(4g — 6)epi(4g — 8) epi~ 峰 4 epi (4 β — 8) epi (4 β — 8) epi~然后，对上述4种三聚体原花青素对于L0X-1和氧化型LDL结合的抑制效果进行了评价。具体而言，除了使用通过冷却至4°C的FBS (-)培养基调节至0. 1 μ g/mL的各种三聚体原花青素以外，其他按照实施例4相同的方法进行。图5为表示空白或添加了 4种不同结构的三聚体原花青素时的氧化型LDL结合率 (%)的图。图中的‘‘3mer”和“未诱导”与图4相同。结果表明“对各结构进行纯化了的4 种三聚体原花青素(峰1 4)均显示出高L0X-1抑制效果。特别是，峰2和3的三聚体原花青素的L0X-1抑制作用比峰1和4的三聚体原花青素的L0X-1抑制作用更强，由此可知 具有缩合部位在黄烷-3-醇的4-6位碳之间的缩合结构的原花青素、末端为表儿茶素的原花青素具有较强的L0X-1抑制作用。需要说明的是，峰1 4中的任一种的L0X-1抑制作用均比分离纯化前的三聚体原花青素(图5中“3mer”)的L0X-1抑制作用更强。认为原因在于在分离纯化前的三聚体原花青素中混入了除表1记载的4种三聚体原花青素以外的某些杂质。实际上，在第1 次的反相色谱中，在峰1前、峰3和峰4之间、以及峰4后，无法检测到明确的峰，但在^Onm 下的吸光度高于基线，由此可知，洗脱下来了某些化合物，认为含有原花青素以外的某些杂质。
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[实施例6利用BIAC0RE测定对L0X-1和原花青素的结合进行评价]使用BIAC0RE，对原花青素和L0X-1的直接结合进行了评价。L0X-1蛋白质使用制备例3中制备的蛋白质ex-hLOX-Ι。另一方面，原花青素使用制备例2中制备的各聚合度的原花青素(1 7倍体)、从实施例5中的三聚体原花青素中分离纯化的作为峰3的 θρ (4β — 6)印Η4β — 8) epi (以下将其称作“三聚体峰3”。)。将L0X-1固定在传感器芯片上，以原花青素作为液相进行BIAC0RE测定。使用 BIAC0RE2000 (GE Healthcare社)进行BIAC0RE测定及解析。此外，使用传感器芯片CM5作为传感器芯片，使用胺偶合法，将蛋白质ex-hLOX-Ι在传感器芯片上固定化。将HEPES溶液 (IOmM HEPES、150mMNaCl、2mM CaCl2)脱气后用作电泳缓冲液。对于在芯片中流动的原花青素中的1 7倍体原花青素，使用电泳缓冲液分别将其调节为20 μ Μ，用于测定。另一方面，对于三聚体峰3，同样地使用电泳缓冲液将其分别调节为20、10、5、2· 5,1. 25 μ M的浓度用于测定。此外，原花青素在传感器芯片上发生反应时，在20 μ L/min的流速、结合120秒、解离120秒的条件下测定解离常数。另一方面，再生时，以60 μ L/min的流速，流通50mM NaOH 5秒钟，使原花青素和L0X-1的结合发生解离。各原花青素解离常数的测定结果如表2所示。结果发现单体以外的原花青素与 L0X-1发生结合。此外，聚合度越高，解离常数变小，可知与L0X-1强力地结合。该结果与使用ELISA法、L0X-1表达细胞测定的结果一致。由该结果可知，原花青素类直接与L0X-1结合，抑制了氧化型LDL和L0X-1的结合。
权利要求
1.一种凝集素样氧化型LDL受体抑制用医药品，其以三聚体以上的原花青素作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的凝集素样氧化型LDL受体抑制用医药品，其中，所述原花青素来源于选自苹果、葡萄种子、花生内皮以及松树皮的植物。
3.一种动脉硬化预防医药品，其含有三聚体以上的原花青素作为有效成分，具有凝集素样氧化型LDL受体抑制作用。
4.根据权利要求3所述的动脉硬化预防医药品，其中，所述原花青素来源于选自苹果、 葡萄种子、花生内皮以及松树皮的植物。
5.一种凝集素样氧化型LDL受体抑制用医药品，其以原花青素作为有效成分，所述原花青素具有至少1个缩合部位是在黄烷-3-醇的4-6位碳间发生缩合的结构。
6.一种凝集素样氧化型LDL受体抑制用医药品，其以末端为表儿茶素的原花青素作为有效成分。
全文摘要
本发明鉴定了一种具有优异的凝集素样氧化型LDL受体抑制作用的化合物，本发明提供一种凝集素样氧化型LDL抑制用医药品、以及含有三聚体以上的原花青素为有效成分且具有凝集素样氧化型LDL受体抑制作用的动脉硬化预防医药品，所述凝集素样氧化LDL受体抑制用医药品对于治疗或预防那些以凝集素样氧化型LDL受体作为恶化因素发挥作用的疾病、特别是动脉硬化疾病有用，其以三聚体以上的原花青素(Procyanidin)为有效成分，所述原花青素来源于选自苹果、葡萄种子、花生内皮以及松树皮的植物。
文档编号A61P43/00GK102459218SQ20108002766
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月23日 优先权日2009年6月23日
发明者泽村达也, 西塚太一 申请人:独立行政法人国立循环器病研究中心