一种双通道荧光成像检测活细胞中微量Fe3+、Hg2+和Cu2+的方法与流程

本发明涉及一种双通道荧光成像检测活细胞中微量离子的方法，特别是一种双通道荧光成像分别检测活细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法。

背景技术：

在细胞生物学和医学研究中，荧光探针因其高空间分辨能力和最小限度扰动活体的特征，能够允许研究者实时监测到发生于活细胞及生物活体中的事件，作为最强有力的工具之一，被越来越重视和使用。探针作为研究金属离子传输载体以及在药物传输系统中细胞膜的跨越行为尤为重要。荧光成像检测细胞内离子能够提供生命体系中离子的时空分布最直接的信息，由于它的无创性、高灵敏、高选择等特征，在生物体系中是追踪金属离子最可靠的技术之一。

铁是人体中重要的基本元素，是大多数生物体必不可少的，也是人体中最丰富的过渡金属。在生理过程中起着氧的传输，电子转移和酶催化等重要作用，能够提供亚铁血红素中氧的运载能力，在很多酶反应中作为一种辅因子。原位检测铁的水平和氧化状态对阐明其作用是非常有意义的。由于Fe³⁺的顺磁性导致会导致荧光猝灭，因此Fe³⁺的荧光成像通常是困难的。

汞污染遍及全球，其残留对人体健康和环境安全影响极大。无论是单质汞还是无机汞都能通过环境中的细菌转变成甲基汞，进而通过食物链产生生物积累。而且，汞及其衍生物的极端毒性归因于其在蛋白质和酶中的高硫醇基亲和性，使细胞功能紊乱导致健康问题。由于汞的危害性，简单，灵敏和快速的测定微量水平的汞的分析方法是必须的。

铜作为人体中含量位于铁、锌之后的最丰富的基本元素，在各种生理过程中起着重要作用。铜离子在酶催化反应中作为辅酶因子，具有取代置换其他金属离子的能力，当其含量水平超过细胞所需就会对生物体系产生毒性。超过正常水平含量的铜离子会导致中毒并产生氧化应激和精神障碍等包括阿尔茨海默症、帕金森氏症疾病。

作为细胞成像检测微量金属离子的探针已有很多报道，但大多是单探针对单一目标离子检测，存在检测不方便，选择性差，不能实现单一探针对细胞中多目标离子的高效检测等问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种双通道荧光成像分别检测活细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法，本发明方法能实现对多目标离子的检测，本发明中的探针与Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺在细胞内分别形成探针-Fe³⁺、探针-Hg²⁺、探针-Cu²⁺配合物，发射不同波长强烈荧光，检测方便，可视性好，灵敏度高、选择性好，能实现实时在线检测细胞内Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺离子。

本发明的技术方案：一种双通道荧光成像分别检测活细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法，是以一种三胺乙基胺衍生物作为探针，通过双通道荧光成像分别检测活性细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺；所述的探针的化学结构式为：

前述的双通道荧光成像分别检测活细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法中，所述的以一种三胺乙基胺衍生物作为探针，通过双通道荧光成像分别检测活性细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺；是先用探针与细胞孵化使探针进入细胞内，再将孵化有探针的细胞分别与Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺孵化，使探针分别与Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺在细胞内结合生成能发射特征波长荧光的探针-Fe³⁺、探针-Hg²⁺、探针-Cu²⁺配合物，实现探针对细胞内离子染色成像，用荧光倒置显微镜观测孵化后的活性细胞荧光像；具体包括以下步骤：

(1)细胞培养：活性细胞经复苏接种于培养液中，在温度为37℃，5％CO2及饱和湿度为100％的培养箱中培养，传代后，接种于12孔板中培养，密度为2×10⁴个/ml，次日用新鲜培养液清洗细胞；所述的培养液含10％胎牛血清、1％双抗以及89％改良型RPMI1640培养基；

(2)探针对细胞孵育：将步骤(1)的细胞中加入含5～40μM探针的孵育培养液中，该孵育培养液的组成为90％培养液，8％H2O，2％乙腈，培养箱内孵育30～80min，吸出含探针的孵育培养液，用新鲜的培养液清洗细胞，置于荧光倒置显微镜下分别进行明场和暗场拍照，明场下观察到细胞清晰的图像，暗场下没有观察到细胞图像；

(3)Fe³⁺对细胞染色：在步骤(2)的细胞中加入含30～80μMFe³⁺的染色培养液，该染色培养液的组成为95％培养液和5％H2O，培养箱内孵育30～80min，吸出含Fe³⁺的染色培养液，用新鲜的培养液清洗细胞，置于荧光倒置显微镜的红色通道下观察探针对细胞内Fe³⁺染色后的荧光像，细胞呈现明亮的红色荧光，拍摄得到清晰的红色荧光细胞轮廓影像；再将上述经探针和Fe³⁺分别染色后的细胞置于荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探针对细胞内Fe³⁺染色后的荧光像，细胞呈绿色荧光，拍摄得到绿色荧光细胞轮廓影像，探针在活性细胞中检测到微量Fe³⁺离子；

(4)Hg²⁺对细胞染色：在步骤(2)的细胞中加入含30～80μMHg²⁺的染色培养液，该染色培养液的组成为95％培养液和5％H2O，培养箱内孵育30～80min，吸出含Hg²⁺的染色培养液，用新鲜的培养液清洗细胞，置于荧光倒置显微镜的红色通道下观察探针对细胞内Hg²⁺染色后的荧光像，细胞呈现明亮的红色荧光，拍摄得到清晰的红色荧光细胞轮廓影像；再将上述经探针和Hg²⁺分别染色后的细胞置于荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探针对细胞内Hg²⁺染色后的荧光像，细胞呈绿色荧光，拍摄得到绿色荧光细胞轮廓影像，探针在活性细胞中检测到微量Hg²⁺离子；

(5)Cu²⁺对细胞染色：在步骤(2)的细胞中加入含30～80μMCu²⁺的染色培养液，该染色培养液的组成为95％培养液和5％H2O，培养箱内孵育30～80min，吸出含Cu²⁺的染色培养液，用新鲜的培养液清洗细胞，置于荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探针对细胞内Cu²⁺染色后的荧光像，细胞呈明亮的绿色荧光，拍摄得到清晰的绿色荧光细胞轮廓影像，探针在活性细胞中检测到微量Cu²⁺离子。

前述的双通道荧光成像分别检测活细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法中，所述的荧光倒置显微镜；是绿色通道的激发波长为450nm～490nm，红色通道的激发波长为510nm～550nm的荧光倒置显微镜。

前述的双通道荧光成像分别检测活细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法中，所述的改良型RPMI1640培养基；是RPMI为英文RoswellParkMemorialInstitute的缩写，代指洛斯维·帕克纪念研究所，RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。

前述的双通道荧光成像分别检测活细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法中，所述的活性细胞是；人体前列腺癌细胞，简称PC3细胞。

前述的双通道荧光成像分别检测活细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法中，所述的探针；是按下述合成路线合成的：

前述的双通道荧光成像分别检测活细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法中，所述的探针；是这样制备的：在100ml的三口烧瓶中，加入三(2-氨乙基)胺25-30mmol、罗丹明B2-5mmol和55-65ml的无水乙醇，氮气保护下回流33-39h，减压蒸去乙醇，分别用100ml二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，蒸去溶剂，得红色粘稠状物，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为9/1/1的甲醇/三氯甲烷/三乙胺，得无色粘稠状中间体1；在250ml的三口瓶中，加入中间体1、115-125ml三氯甲烷和2-8mmol4-氯-7-硝基苯并呋咱，氮气保护冰浴下反应1.5-2.5h，蒸去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为100/3的三氯甲烷/甲醇，得浅黄色固体中间体2；在100ml的三口瓶中，加入中间体2、0.66-0.85mmol7-羟基-8-香豆素甲醛和55-65ml甲醇，氮气保护下回流反应7-9h，蒸去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为100/2的三氯甲烷/甲醇，得橙色固体探针。

前述的双通道荧光成像分别检测活细胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法中，所述的探针；是这样制备的：在100ml的三口烧瓶中，加入三(2-氨乙基)胺27.36mmol、罗丹明B3.42mmol和60ml的无水乙醇，氮气保护下回流36h，减压蒸去乙醇，分别用100ml二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，蒸去溶剂，得红色粘稠状物，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为9/1/1的甲醇/三氯甲烷/三乙胺，得1.71g无色粘稠状中间体1；在250ml的三口瓶中，加入6.01mmol中间体1、120ml三氯甲烷和5.01mmol4-氯-7-硝基苯并呋咱，氮气保护冰浴下反应2h，蒸去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为100/3的三氯甲烷/甲醇，得浅黄色固体中间体2；在100ml的三口瓶中，加入中间体2、0.748mmol7-羟基-8-香豆素甲醛和60ml甲醇，氮气保护下回流反应8h，蒸去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为100/2的三氯甲烷/甲醇，得橙色固体探针。

发明人对本发明方法进行了长期的大量的试验研究，以下是部分试验：

1、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为97/3的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为20μM的溶液，分别不加金属离子或加入400μM金属离子Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Fe³⁺后的荧光光谱。见图1，Fe³⁺、Hg²⁺的加入使探针在585nm处出现新的荧光峰，且荧光显著增强；Cu²⁺的加入使探针在525nm处的荧光显著增强，而其他上述实验金属离子的加入均不改变探针的荧光光谱和强度，表明在此条件下，探针能选择性检测Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺。测试的激发波长为470nm，发射波长为585nm、525nm。

2、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为97/3的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为20μM的溶液，分别加入不同浓度Fe³⁺测得的荧光光谱滴定曲线。随Fe³⁺浓度增大，在585nm处的荧光强度线性增强。测试的激发波长为470nm。见图2。

3、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为97/3的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为20μM的溶液，分别加入不同浓度Fe³⁺，测定585nm处荧光强度获得校正曲线。纵坐标为荧光强度值，横坐标为Fe³⁺的浓度。激发波长为470nm。见图3。

4、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为97/3的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为20μM的溶液，分别加入400μM的金属离子Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Fe³⁺后，测定585nm处的荧光强度值。再分别向探针-Fe³⁺混合溶液中加入400μM上述其他金属离子后，测定585mn处的荧光强度值的变化。见图4，黑色条表示在探针-Fe³⁺混合溶液中再分别加入金属离子后在585mn处的荧光强度值；白色条表示在探针溶液分别加入上述其他共存金属离子后在585nm处的荧光强度值的变化。表明探针检测Fe³⁺的荧光强度除受Hg²⁺影响外，不受上述其他离子共存的影响。测试的激发波长为470nm。

5、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为97/3的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为20μM的溶液，分别加入不同浓度Hg²⁺测得的荧光光谱滴定曲线。随Hg²⁺浓度增大，在585nm处的荧光强度线性增强。测试的激发波长为470nm。见图5。

6、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为97/3的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为20μM的溶液，分别加入不同浓度Hg²⁺，测定585nm处荧光强度获得校正曲线。纵坐标为荧光强度值，横坐标为Hg²⁺的浓度。激发波长为470nm。见图6。

7、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为97/3的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为20μM的溶液，分别加入400μM的金属离子Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Fe³⁺后，测定585nm处的荧光强度值。再分别向探针-Hg²⁺混合溶液中加入400μM上述其他金属离子后，测定585mn处的荧光强度值的变化。见图7，黑色条表示在探针-Hg²⁺混合溶液中再分别加入金属离子后在585mn处的荧光强度值；白色条表示在探针溶液分别加入上述其他共存金属离子后在585nm处的荧光强度值的变化。表明探针检测Hg²⁺的荧光强度不受上述离子共存的影响。测试的激发波长为470nm。

8、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为97/3的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为20μM的溶液，分别加入不同浓度Cu²⁺测得的荧光光谱滴定曲线。随Cu²⁺浓度增大，在525nm处的荧光强度线性增强。测试的激发波长为470nm。见图8。

9、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为97/3的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为20μM的溶液，分别加入不同浓度Cu²⁺，测定525nm处荧光强度获得校正曲线。纵坐标为荧光强度值，横坐标为Cu²⁺的浓度。激发波长为470nm。见图9。

10、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为97/3的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为20μM的溶液，分别加入400μM的金属离子Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Fe³⁺后，测定525nm处的荧光强度值。再分别向探针-Cu²⁺混合溶液中加入400μM上述其他金属离子后，测定525mn处的荧光强度值的变化。见图10，黑色条表示在探针-Cu²⁺混合溶液中再分别加入金属离子后在525mn处的荧光强度值；白色条表示在探针溶液分别加入上述其他共存金属离子后在525nm处的荧光强度值的变化。表明探针检测Cu²⁺的荧光强度不受上述离子共存的影响。测试的激发波长为470nm。

11、探针对活性PC3细胞中Fe³⁺的荧光成像检测照片，见图11；图11-a、图11-d是经浓度为20μM的探针孵育50min后的PC3细胞的荧光倒置显微镜的明场照片，细胞贴壁正常，呈饱满状态，证明探针在该测试条件下对PC3细胞没有毒性；图11-b、图11-e为上述经探针孵育过的PC3细胞的暗场荧光显微照片，显示无细胞荧光成像；图11-c为上述先经20μM的探针孵育50min的PC3细胞，再用50μM的Fe³⁺孵育50min后，在荧光倒置显微镜红色通道下拍摄的细胞图片，观测到清晰的红色荧光细胞分布，证明探针与Fe³⁺离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像，红色通道激发波长为510nm～550nm。图11-f为上述先经20μM的探针孵育50min的PC3细胞，再用50μM的Fe³⁺孵育50min后，在荧光倒置显微镜绿色通道下拍摄的细胞图片，观测到清晰的绿色荧光细胞分布，证明探针与Fe³⁺离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像，绿色通道的激发波长为450nm～490nm。

12、探针对活性PC3细胞中Hg²⁺的荧光成像检测照片，见图12；图12-a、图12-d是经浓度为20μM的探针孵育50min后的PC3细胞的荧光倒置显微镜的明场照片，细胞贴壁正常，呈饱满状态，证明探针在该测试条件下对PC3细胞没有毒性；图12-b、12-e为上述经探针孵育过的PC3细胞的暗场荧光显微照片，显示无细胞荧光成像；图12-c为上述先经20μM的探针孵育50min的PC3细胞，再用50μM的Hg²⁺孵育40min后，在荧光倒置显微镜红色通道下拍摄的细胞图片，观测到清晰的红色荧光细胞分布，证明探针与Hg²⁺离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像，红色通道激发波长为510nm～550nm。图12-f为上述先经20μM的探针孵育50min的PC3细胞，再用50μM的Hg²⁺孵育40min后，在荧光倒置显微镜绿色通道下拍摄的细胞图片，观测到清晰的绿色荧光细胞分布，证明探针与Hg²⁺离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像，绿色通道的激发波长为450nm～490nm。

13、探针对活性PC3细胞中Cu²⁺的荧光成像检测照片，见图13；图13-a是经浓度为20μM的探针孵育50min后的PC3细胞的荧光倒置显微镜的明场照片，细胞贴壁正常，呈饱满状态，证明探针在该测试条件下对PC3细胞没有毒性；13-b为上述经探针孵育过的PC3细胞的暗场荧光显微照片，显示无细胞荧光成像；13-c为上述先经20μM的探针孵育50min的PC3细胞，再用50μM的Cu²⁺孵育50min后，在荧光倒置显微镜绿色通道下拍摄的细胞图片，观测到清晰的绿色荧光细胞分布，证明探针与Cu²⁺离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像，绿色通道的激发波长为450nm～490nm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)选择在乙腈/水混合介质中，以470nm为激发波长，探针选择性识别Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺。探针-Fe³⁺、探针-Hg²⁺发射585nm橙色荧光，探针-Cu²⁺发射525nm绿色荧光，据此利用探针实现细胞内Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺荧光成像；

(2)激发波长为470nm而发射波长为585nm、525nm，斯托克斯位移(Stokesshift)，大，不仅消除了激发波长对发射波长的影响，同时使成像细胞的荧光波长接近近红外波段且可以实现双通道检测；

(3)作为一种细胞内微量Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺的荧光成像方法，能同时在荧光激发波长为510nm～550nm的红色通道和荧光激发波长为450nm～490nm的绿色通道下实现荧光成像。作为一种活细胞内微量Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺的成像试剂，具有检测方便、可视性强、灵敏度高、选择性好受其他离子的干扰小，可实现实时在线检测。

(4)通过发明人合成的一种对Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺高灵敏、高选择性检测的荧光探针，探针先与细胞孵育，使探针渗透进入细胞内，再用孵育有探针的细胞分别对Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺进行孵育，使探针与Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺在细胞内形成配合物，在荧光倒置显微镜下进行荧光成像检测，分别在两个激发通道下都能实现对活细胞中多种微量金属离子Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺的不同颜色的荧光染色和成像检测。

因此，本发明方法中探针与Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺的配合能力好，检测方便，可视性好，灵敏度高、选择性好，受其他离子的干扰小，且能实现实时在线检测。

附图说明：

图1是探针检测Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺的荧光光谱图；

图2是不同浓度的Fe³⁺对探针的荧光滴定光谱图；

图3是探针检测Fe³⁺的荧光光谱法校正曲线；

图4是共存金属离子对探针检测Fe³⁺的荧光强度影响图；

图5是不同浓度的Hg²⁺对探针的荧光滴定光谱图；

图6是探针检测Hg²⁺的荧光光谱法校正曲线；

图7是共存金属离子对探针检测Hg²⁺的荧光强度影响图；

图8是不同浓度的Cu²⁺对探针的荧光滴定光谱图；

图9是探针检测Cu²⁺的荧光光谱法校正曲线；

图10是共存金属离子对探针检测Cu²⁺的荧光强度影响图；

图11是探针对活性PC3细胞中Fe³⁺的荧光成像检测照片；a、d是细胞经探针溶液孵育后的明场照片；b是对应于a的细胞在荧光倒置显微镜红色通道下的荧光照片；e是对应于d的细胞在荧光倒置显微镜绿色通道下的荧光照片；c为先经探针孵育的细胞，再经Fe³⁺孵育后，在荧光倒置显微镜红色通道下拍摄的细胞照片；f为先经探针孵育的细胞，再经Fe³⁺孵育后，在荧光倒置显微镜绿色通道下拍摄的细胞照片。

图12是探针对活性PC3细胞中Hg²⁺的荧光成像检测照片；a、d是细胞经探针溶液孵育后的明场照片；b是对应于a的细胞在荧光倒置显微镜红色通道下的荧光照片；e是对应于d的细胞在荧光倒置显微镜绿色通道下的荧光照片；c为先经探针孵育的细胞，再经Hg²⁺孵育后，在荧光倒置显微镜红色通道下拍摄的细胞照片；f为先经探针孵育的细胞，再经Hg²⁺孵育后，在荧光倒置显微镜绿色通道下拍摄的细胞照片。

图13是探针对活性PC3细胞中Cu²⁺的荧光成像检测照片；a是细胞经探针溶液孵育后的明场照片；b是对应于a的细胞在荧光倒置显微镜绿色通道下的荧光照片；c为先经探针孵育的细胞，再经Cu²⁺孵育后，在荧光倒置显微镜绿色通道下拍摄的细胞照片。

具体实施方式

实施例1：

探针的合成路线：

探针的具体合成方法：

1)中间体1的合成：在100ml的三口烧瓶中，加入27.36mmol的三(2-氨乙基)胺、3.42mmol的罗丹明B和60ml的无水乙醇，氮气保护下回流36h，减压蒸去乙醇，分别用100ml二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，蒸去溶剂，得红色粘稠状物，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为9/1/1的甲醇/三氯甲烷/三乙胺，得1.71g无色粘稠状中间体1；

2)中间体2的合成：在250ml的三口瓶中，加入中间体1、120ml三氯甲烷和5.01mmol的4-氯-7-硝基苯并呋咱，氮气保护冰浴下反应2h，蒸去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为100/3的三氯甲烷/甲醇，得浅黄色固体中间体2；

3)探针的合成：在100ml的三口瓶中，加入中间2，0.748mmol的7-羟基-8-香豆素甲醛，60ml甲醇，氮气保护下回流反应8h，蒸去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为100/2的三氯甲烷/甲醇，得橙色固体探针。结构表征数据如下：IR(KBr,νcm^-1):3422(-OH),2025(C＝O),1599(C＝C),1388(N-CH3),1360(C-O-C),764(Ar-H),624(Ar-H),¹HNMR(500M,CDCl3,ppm)δ:10.60(s,1H,-OH),8.68(s,1H,-CH＝N),8.32(s,1H,Ar-H),8.02(s,1H,Ar-H),7.66(d,J＝10Hz,1H,Ar-H),7.52(m,J＝6Hz,2H,Ar-H),7.45(d,J＝9.5Hz,2H,Ar-H×2),7.1(d,J＝6.5,1H,Ar-H),7.08(d,J＝9Hz,1H,Ar-H),6.4(m,J＝8.5Hz,2H,Ar-H),6.3(m,J＝10.5Hz,4H,Ar-H),6.1(d,J＝9.5Hz,1H,Ar-H),3.34～3.29(m,8H,NCH2CH3×4),3.25(s,2H,NCH2CH2-),2.85(s,2H,CH2CH2N),2.70(s,2H,-CH2CH2N),1.75(bs,CH2NH2).¹³CNMR(500M,CDCl3,ppm)δ:206.83,190.61,166.68,159.85,159.49,156.30,148.22,145.47,144.86,144.20,143.62,137.60,135.75,133.65,130.96,128.67,123.89,122.42,120.59,119.30,108.29,107.68,104.96,104.78,103.08,98.94,97.13,78.98,64.42,52.20,51.57,50.76,49.24,45.72,43.73.MS(ESI/TOF-Q)计算值[C50H51N9O8]:m/z905.39215，测定值:m/z906.39436[M+H]⁺。

2、试剂的配制：

(1)探针溶液的配制：称取按上述方法制备的探针9.1mg，用乙腈溶解，配制成100mL(CH3CN/H2O,1/4)探针浓度为1.00×10^-4M的溶液。

(2)Hg²⁺离子储备液配制：称量三水合高氯酸汞45.35mg，用超纯水溶解，配制成浓度为1mM的溶液100mL。

(3)Cu²⁺离子储备液配制：称量六水合高氯酸铜37.05mg，用超纯水溶解，配制成浓度为1mM的溶液100mL。

(4)Fe³⁺离子储备液配制：称取高氯酸铁35.41mg，用超纯水溶解，配制成浓度为1mM的溶液100mL。

(5)75％的乙醇溶液：无水乙醇75mL加超纯水至100mL，混匀，室温保存备用。

(6)磷酸盐缓冲溶液(D-hanks平衡盐溶液)：0.4gKCl、0.06gKH2PO4、8.0gNaCl、1.0g葡萄糖、0.35gNaHCO3、0.152gNa2HPO4·12H2O、10万IU双抗，调整pH为7.2～7.4，去超纯水定容至1000mL，针式滤器(0.22um进口微孔滤膜)过滤除菌，分装备用。

(7)1万单位(IU)/mL双抗溶液：将80万单位青霉素钠溶于40mLD-hanks溶液中，配成终浓度2万单位/mL；将160万单位硫酸链霉素溶于80mLD-hanks溶液中，配成终浓度2万单位/mL。分别取等体积的青霉素钠溶液和硫酸链霉素溶液混合，得到青霉素钠和硫酸链霉素的终浓度均为1万单位/mL的溶液；针式滤器(0.22um进口微孔滤膜)过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

(8)0.25％胰蛋白酶：称取0.25g胰蛋白酶，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器(0.22um进口微孔滤膜)过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

(9)0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)：将0.02gEDTA，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器(0.22μm进口微孔滤膜)过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

(10)培养液：用无菌移液管量取10mL已灭活的胎牛血清、90mL改良型RPMI-1640培养基，以及1mL双抗液混合于100mL的无菌培养瓶中，2～8℃保存备用。

本发明所用荧光分光光度计型号为CaryEclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司生产；ThermoFisher8000储水型CO2细胞培养箱；IX-71型荧光倒置相差显微镜，日本Olympus公司；AR1530/C电子天平；25cm²细胞培养瓶，美国Corning公司立式压力蒸汽灭菌器(LS-B75)；DHG-9230A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

3、荧光光谱法检测Fe³⁺、Cu²⁺、Hg²⁺

在10mL容量瓶中加入探针溶液(1mM，200μL)，用乙腈/水稀释，使探针溶液的组成为乙腈/水的体积比是97/3，摇匀。在1cm的比色皿中加入3ml稀释后的溶液，以470nm为荧光激发波长，进行荧光光谱测定。

在体积比为97/3的乙腈/水溶液中，浓度为20μM的探针溶液在525nm波长处有弱荧光发射。分别加入400μM的金属离子Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Pb²⁺，Al³⁺，Cr³⁺，Ag²⁺时，没有观察到荧光光谱明显的变化，只有加入400μM的Fe³⁺、Hg²⁺使探针在585nm处的出现新的荧光峰且荧光显著增强；加入400μM的Cu²⁺使探针在525nm处的荧光增强(见图1)。

在体积比为97/3的乙腈/水溶液中，对浓度为20μM探针溶液分别用不同浓度的Fe³⁺离子，进行荧光光谱滴定(见图2)。测定Fe³⁺浓度变化时探针在585nm处的荧光强度，获得荧光校正曲线(见图3)。由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针荧光法检测Fe³⁺的浓度线性范围和检出限列于表1。

探针检测Fe³⁺在585nm处的荧光强度在上述其他金属离子分别作为共存离子存在于探针-Fe³⁺混合溶液中，当浓度与Fe³⁺相同时，除Hg²⁺有影响外，其他共存金属离子对探针检测Fe³⁺的荧光强度的不干扰(见图4)。

在体积比为97/3的乙腈/水溶液中，对浓度为20μM探针溶液分别用不同浓度的Hg²⁺离子，进行荧光光谱滴定(见图5)。测定Hg²⁺浓度变化时探针在585nm处的荧光强度，获得荧光校正曲线(见图6)。由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针荧光法检测Hg²⁺的浓度线性范围和检出限列于表1。

探针检测Hg²⁺在585nm处的荧光强度在上述其他金属离子分别作为共存离子存在于探针-Hg²⁺混合溶液中，当浓度与Hg²⁺相同时，共存金属离子对探针检测Hg²⁺的荧光强度的不干扰(见图7)。

在体积比为97/3的乙腈/水溶液中，对浓度为20μM探针溶液分别用不同浓度的Cu²⁺离子，进行荧光光谱滴定(见图8)。测定Cu²⁺浓度变化时探针在525nm处的荧光强度，获得荧光校正曲线(见图9)。由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针荧光法检测Cu²⁺的浓度线性范围和检出限列于表1。

探针检测Cu²⁺在525nm处的荧光强度在上述其他金属离子分别作为共存离子存在于探针-Cu²⁺混合溶液中，当浓度与Cu²⁺相同时，共存金属离子对探针检测Cu²⁺的荧光强度的不干扰(见图10)。

表1探针荧光法检测Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺的分析参数

4、活性PC3细胞的荧光成像

(1)复苏细胞

从-80℃冰箱内取出PC3细胞，置于37℃的水中快速晃动细胞冻存管，于1-2分钟内完全解冻，在无菌操作台内，将其吸入离心管内，加11ml培养液，混均，并将此细胞悬液于1000r/min离心机上离心5min，去除上层清液，将底部沉淀的细胞加培养液轻吹、打散、混均、转移到培养瓶内，使培养瓶中培养液体积在5～7mL内，并置入37℃，含5％CO2，饱和湿度为100％的培养箱内进行培养。

(2)观察→传代→接板

每日更换一次培养液，并在显微镜下观察细胞生长情况，直至PC3细胞贴壁长满于整个培养瓶壁上，即可传代，在无菌操作台内倒掉旧培养液，加入1mL的EDTA液侵入细胞30s后倒掉，再加入1mL的胰蛋白酶液进行消化，在显微镜下观察直至细胞缩小变圆后，拍打培养瓶使细胞脱落并立即加入适量培养液阻止消化，将它一分为二培养于2个培养瓶中，待传代后的细胞贴壁铺满于整个培养瓶壁上时，与传代操作相同，加入EDTA和胰蛋白酶后使细胞消化脱落并立即加入3mL的培养液阻止消化，准备接种于12孔板内。在每个孔板内加入200μL的已阻止消化的细胞液，再加适量新培养液混均后将孔板置入培养箱内进行培养。

(3)细胞染色

次日观察孔板内的细胞生长状况，待细胞贴壁生成，弃去旧培养液，用新鲜培养液洗涤2次，备用。

1)Fe³⁺细胞成像

将上述PC3细胞孔板内加入含10μM探针的染色培养液，该染色培养液由90％培养液，8％H2O，2％乙腈组成，置于培养箱内孵育50min后，用新鲜的培养液清洗孔板内的细胞三次后，分别置于荧光倒置显微镜的明场成像拍照(见图11-a、11-d)和激发波长为510nm～550nm的红色通道暗场拍照(见图11-b)、激发波长为450nm～490nm的绿色通道暗场拍照(见图11-e)，细胞无荧光。

往上述孔板内细胞中再加入0.5mL含50μM的Fe³⁺的染色培养液，该染色培养液的组成为95％培养液和5％H2O，在培养箱内孵育50min后用新鲜的培养液洗三次，置于荧光倒置显微镜的激发波长为510nm～550nm的红色通道下观察，细胞呈现明亮的红色荧光影像(见图11-c)；置于荧光倒置显微镜的激发波长为450nm～490nm的绿色通道下观察拍照，细胞呈明亮的绿色荧光影像(见图11-f)。

2)Hg²⁺细胞成像

将上述PC3细胞孔板内加入含10μM探针的染色培养液，该染色培养液由90％培养液，8％H2O，2％乙腈组成，置于培养箱内孵育50min后，用新鲜的培养液清洗孔板内的细胞三次后，分别置于荧光倒置显微镜的明场成像拍照(见图12-a、12-d)和激发波长为510nm～550nm的红色通道暗场拍照(见图12-b)、激发波长为450nm～490nm的绿色通道暗场拍照(见图12-e)，细胞无荧光。

往上述孔板内细胞中再加入0.5mL含50μM的Hg²⁺的染色培养液，该染色培养液的组成为95％培养液和5％H2O，在培养箱内孵育40min后用新鲜的培养液洗三次，置于荧光倒置显微镜的激发波长为510nm～550nm的红色通道下观察，细胞呈现明亮的红色荧光影像(见图12-c)；置于荧光倒置显微镜的激发波长为450nm～490nm的绿色通道下观察拍照，细胞呈绿色荧光影像(见图12-f)。

3)Cu²⁺细胞成像

将上述PC3细胞孔板内加入含10μM探针的染色培养液，该染色培养液由90％培养液，8％H2O，2％乙腈组成，置于培养箱内孵育50min后，用新鲜的培养液清洗孔板内的细胞三次后，分别置于荧光倒置显微镜的明场成像拍照(见图13-a)和激发波长为450nm～490nm的绿色通道暗场拍照(见图13-b)，细胞无荧光。

往上述孔板内细胞中再加入0.5mL含50μM的Cu²⁺的染色培养液，该染色培养液的组成为95％培养液和5％H2O，在培养箱内孵育50min后用新鲜的培养液洗三次，置于荧光倒置显微镜的激发波长为450nm～490nm的绿色通道下观察拍照，细胞呈明亮的绿色荧光影像(见图13-c)。