本发明涉及一种槐角胰蛋白酶抑制剂的制备、活性测定及抑制常数测定的方法，属于胰蛋白酶抑制剂
技术领域：
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背景技术：
：蛋白酶抑制剂广泛存在于动、植物体内，目前已从许多动、植物材料中纯化出多种蛋白酶抑制剂并对其性质进行研究。其中来自大豆、绿豆、赤豆等种子中的胰蛋白酶抑制剂(STI)包含两个组分，其极性氨基酸含量高，属于Bowman-Brik抑制剂类型。研究表明STI可以抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰脏中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活，故可用于各型胰腺炎的治疗与预防；同时STI能抑制纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原的激活因子，阻止纤维蛋白溶酶原的活化，用于治疗和预防各种纤维蛋白溶解所引起的急性出血等；进一步STI能抑制血管舒张素，从而抑制其舒张血管、增加毛细血管通透性、降低血压；此外，在腹腔手术后直接注STI入患者腹腔，能预防肠粘连。槐角(SophorajaponicaL.)为豆科植物槐的干燥花及花蕾、成熟果实。槐角在医疗方面，不仅用于中医配方，而且是中药工业和医药工业的重要原料。据统计，以槐角为原料生产的降压丸、京万红、槐角丸达30多种；对治疗冠心病、高血压、脑血管栓塞等症，疗效显著；现代研究证明，槐角中含有多种多样的化学成分，包括黄酮、异黄酮、生物碱、三萜皂苷、氨基酸和磷脂类成分等，由于其成份结构与己烯雌酚相似，具有雌激素样活性，因此针对骨质疏松、癌症等疑难病症，治疗效果明显。如何从槐角分离出活性良好的胰蛋白酶抑制剂，是本发明所要解决的技术问题。技术实现要素：为解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种利用亲和层析方法，从槐角种子中分离出STI的槐角胰蛋白酶抑制剂的制备、活性测定及抑制常数测定的方法。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为槐角胰蛋白酶抑制剂的制备方法，取去皮磨碎的槐角粉25g，加入5倍量的丙酮于9.6℃下抽脂8小时，在通风橱中用布氏漏斗抽成干粉，加入5倍量20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液抽提蛋白8小时，然后11000r/min离心20min，取上清，然后再70℃水浴加热10min，再11000r/min离心20min，取上清，用定性滤纸过滤除去杂质，用3kDMWCO(MILLPORE)浓缩至8mL，用亲和层析的方法得到纯化的胰蛋白酶抑制剂。槐角胰蛋白酶抑制剂活性的测定方法，包括槐角胰蛋白酶抑制剂,按照以下步骤进行，a.STI的分子量测定:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,以UnstainedProteinMolecularWeightMarker为对照，分离胶浓度15%,恒流15mA,电泳3h，测定其分子量；b.热稳定性测定：将粗酶液分别置于50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中各保温10min，离心，取上清，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其稳定性；c.活性测定：将STI溶于20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液中,分别在25℃、35℃、45℃和55℃处理10min,迅速冷却,终止反应后，然后以BAPNA为底物，取浓度为33ug/mL的STI30uL,加入浓度为2mg/mL的胰蛋白酶60mL,最后体积用20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液补充至3mL，在37℃保温10min，加浓度为0.15mol/mL的BAPNA溶液40uL，37℃反应10min，立即加入0.5mL33%醋酸溶液终止反应，以不加抑制剂的试样为对照，在410nm处测其吸收值，测定其抑制胰蛋白酶的活性；酶活性单位定义为：在实验条件下，每分钟内水解0.01umol/LBAPNA释放对硝基苯胺的量；抑制剂活性单位定义为：在相同条件下，降解1个酶活单位所需的抑制剂量；d.酸碱稳定性测定:将TBTI加入以下体系:pH5.0,pH6.0,pH7.0,pH8.0,pH9.0,pH10.0的20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液,然后以BAPNA为底物，取浓度为33ug/mL的STI30uL,加入浓度为2mg/mL的胰蛋白酶60mL,最后体积用20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液补充至3mL，在37℃保温10min，加浓度为0.15mol/mL的BAPNA溶液40uL，37℃反应10min，立即加入0.5mL33%醋酸溶液终止反应，以不加抑制剂的试样为对照，在410nm处测其吸收值，测定其抑制胰蛋白酶的活性；酶活性单位定义为：在实验条件下，每分钟内水解0.01umol/LBAPNA释放对硝基苯胺的量；抑制剂活性单位定义为：在相同条件下，降解1个酶活单位所需的抑制剂量；e.蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝法进行测定。槐角胰蛋白酶抑制剂抑制常数Ki的测定方法，以BAPNA为底物，取浓度为0.2mg/mL的胰蛋白酶65uL，加入浓度为0.059mol/L的STI70uL，最后体积用20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液补充至3mL，在37℃保温10min，,分别加入25、30、35.、40、45、50uL的浓度为0.15mol/L的BAPNA，在37℃保温10min，立即加入0.5mL33%醋酸溶液终止反应，对照管以测活缓冲液代替酶液，在400nm处测其吸收值，以1/[S]对1/V作图，与底物影响之双倒数图对照比较，推出其抑制类型，计算出Ki。与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明采用亲和层析方法，从槐角种子中分离出STI，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化产物进行分析得出STI的近似分子量分别为12kD，STI具有较高的热稳定性，在80℃时仍有抑制活性，在37℃时活性达到最高。STI在pH6.5～pH8.5条件下具有较高抑制活性，在pH7.8处活性最高。用Lineweaver-Burk作图法得知，该抑制剂属竞争性抑制类型，Ki值为3.697×1O-6mol/L（以BAPNA为底物）。附图说明图1为本发明中槐角蛋白粗提液及STI亲和层的分析结果图。图2为本发明中槐角蛋白提取液热稳定性检测图。图3为本发明中胰蛋白酶抑制剂的温度曲线图。图4为本发明中胰蛋白酶抑制剂的酸碱度曲线图。图5为本发明中胰蛋白酶抑制剂的竞争性抑制曲线图。具体实施方式为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。一、槐角胰蛋白酶抑制剂的制备方法，取去皮磨碎的槐角粉25g，加入5倍量的丙酮于9.6℃下抽脂8小时，在通风橱中用布氏漏斗抽成干粉，加入5倍量20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液抽提蛋白8小时，然后11000r/min离心20min，取上清，然后再70℃水浴加热10min，再11000r/min离心20min，取上清，用定性滤纸过滤除去杂质，用3kDMWCO(MILLPORE)浓缩至8mL，用亲和层析的方法得到纯化的胰蛋白酶抑制剂。二、槐角胰蛋白酶抑制剂活性的测定方法，包括槐角胰蛋白酶抑制剂,按照以下步骤进行，a.STI的分子量测定:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,以UnstainedProteinMolecularWeightMarker为对照，分离胶浓度15%,恒流15mA,电泳3h，测定其分子量；b.热稳定性测定：将粗酶液分别置于50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中各保温10min，离心，取上清，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其稳定性；c.活性测定：将STI溶于20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液中,分别在25℃、35℃、45℃和55℃处理10min,迅速冷却,终止反应后，然后以BAPNA为底物，取浓度为33ug/mL的STI30uL,加入浓度为2mg/mL的胰蛋白酶60mL,最后体积用20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液补充至3mL，在37℃保温10min，加浓度为0.15mol/mL的BAPNA溶液40uL，37℃反应10min，立即加入0.5mL33%醋酸溶液终止反应，以不加抑制剂的试样为对照，在410nm处测其吸收值，测定其抑制胰蛋白酶的活性；酶活性单位定义为：在实验条件下，每分钟内水解0.01umol/LBAPNA释放对硝基苯胺的量；抑制剂活性单位定义为：在相同条件下，降解1个酶活单位所需的抑制剂量；d.酸碱稳定性测定:将TBTI加入以下体系:pH5.0,pH6.0,pH7.0,pH8.0,pH9.0,pH10.0的20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液,然后以BAPNA为底物，取浓度为33ug/mL的STI30uL,加入浓度为2mg/mL的胰蛋白酶60mL,最后体积用20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液补充至3mL，在37℃保温10min，加浓度为0.15mol/mL的BAPNA溶液40uL，37℃反应10min，立即加入0.5mL33%醋酸溶液终止反应，以不加抑制剂的试样为对照，在410nm处测其吸收值，测定其抑制胰蛋白酶的活性；酶活性单位定义为：在实验条件下，每分钟内水解0.01umol/LBAPNA释放对硝基苯胺的量；抑制剂活性单位定义为：在相同条件下，降解1个酶活单位所需的抑制剂量；e.蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝法进行测定。三、槐角胰蛋白酶抑制剂抑制常数Ki的测定方法，以BAPNA为底物，取浓度为0.2mg/mL的胰蛋白酶65uL，加入浓度为0.059mol/L的STI70uL，最后体积用20mmol/LTris-100mmol/LNaClpH8.0缓冲液补充至3mL，在37℃保温10min，,分别加入25、30、35.、40、45、50uL的浓度为0.15mol/L的BAPNA，在37℃保温10min，立即加入0.5mL33%醋酸溶液终止反应，对照管以测活缓冲液代替酶液，在400nm处测其吸收值，以1/[S]对1/V作图，与底物影响之双倒数图对照比较，推出其抑制类型，计算出Ki。分析结果如下：1、槐角胰蛋白酶抑制剂的纯化：槐角种子STI提取物经亲和层析后，其粗品纯化达429倍，得率为9%。如下表：表1槐角STI的纯化步骤总蛋白/g总活性/U比活性（U/mg）纯化倍数收得率/%粗抽提液0.161921．201100亲和层析3.37×10-517.37515.3342992、抑制剂的分子量测定：用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化产物进行分析得出STI的近似分子量为12kD。如图1所示，其中1为标准蛋白分子量，2为抑制剂粗提物，3为70℃加热处理活性组分，4为3kD浓缩活性组分，5为亲和层析穿透液，6为亲和层析活性部分。3、STI的热稳定性，通过测定不同温度下STI的稳定性，结果表明，STI在80℃的含量没有明显减少，可见STI具有较高的耐热性，如图2所示，其中1为标准蛋白分子量，2为50℃加热处理活性组分，3为60℃加热处理活性组分，4为70℃加热处理活性组分，5为80℃加热处理活性组分。同时测定不同温度下STI对胰蛋白酶的抑制作用，结果表明，STI在25℃~55℃均有较高的抑制活性。在37℃左右抑制活性最高。如图3所示。4、STI的酸碱度稳定性，通过测定不同pH条件下STI对胰蛋白酶的抑制作用，结果表明，STI在pH6.5~pH8.5条件下具有较高抑制活性。在pH7.8处活性最高。如图4所示。5、抑制常数Ki的测定：按Lineweaver-Burk作图法,以BAPNA为底物,在胰蛋白酶的反应初速度范围内进行STI的抑制动力学实验,确定STI为竞争性抑制类型,抑制常数Ki为3.697×1O-6mol/L。如图5所示。在槐角胰蛋白酶抑制剂的纯化前期，更具STI对温度较稳定的特点，用高温变性除去部分杂蛋白。亲和层析纯化以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化产物进行分析得出均一性纯品，STI的分子量近似为12kD。经测定STI对胰蛋白酶有较强的抑制作用，以BAPNA为底物得出抑制常数Ki为3.697×1O-6mol/L。此Ki值高于苦荞麦【8】、绿豆、赤豆等材料中的胰蛋白酶抑制剂，其原因可能是产物对硝基苯胺对酶有抑制作用，或着是后者的STI本身的抑制活性较低。本发明采用亲和层析的方法对槐角种子中STI作简单的提取，并测定了它的最适温度和pH及抑制常数等部分生化性质，旨在探讨槐角种子STI对胰蛋白酶的抑制作用,本实验对于STI的基础研究、抗虫研究及其药用价值有着实际的意义。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包在本发明范围内。当前第1页1 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