本发明属于烟草及烟草制品中农药残留的理化检验技术领域，主要涉及烟草及烟草制品中2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏等三种氯苯氧羧酸类农药残留量的提取-净化同步法测定。
背景技术：
苯氧羧酸类除草剂对作物的安全性受环境条件、作物生育期的影响较大，应用不当可能会产生较重的药害。在使用过程中，发现对人、畜有一定的内分泌扰乱作用，随着该类除草剂使用量及使用范围的日益增大，其在作物中的残留及对人类健康和环境造成的危害也越来越为人们所关注。我国和其他各国都制定了严格的残留限量,如日本规定 2, 4, 5-涕不得检出, 国际食品法典委员会，日本等制定的2, 4-滴在大多农产品中的限量为0.05 mg/kg。关于对于土壤、水、大米、水稻和纺织品中苯氧羧酸类残留测定的报道较多，而且苯氧羧酸类除草剂多残留分析的报道多采用气相色谱或气质联用测定。由于此类化合物极性较大、稳定性差、不易气化，需用重氮甲烷或三氟化硼丁醇衍生后才能用气相色谱或气质联用法进行测定【分析化学，2006，34(12),1733-1736; 色谱，2008，26(1),116-118; 分析科学学报，2010，26(1),47-50】。衍生化试剂重氮甲烷和三氟化硼丁醇毒性较强，且整个操作步骤较繁琐、分析成本较高、单个样品的检测周期较长。
由于LC-MS/MS法的选择性极大提高，具有很好的抗基质干扰能力，且具备较为丰富的定性和定量信息，灵敏度较高，使得样品前处理过程大大简化。由于基质中某些干扰组分的存在会使待测组分离子生成的速度同标准样品相比有显著不同，使得信号响应值产生较大变异，从而影响检出限、定量限、准确度和精密度等。在样品分析中通常采用优化色谱-质谱分析条件、空白基质匹配标准校正法及内标法对可能的基质效应进行消除或补偿。空白基质匹配标准校正法是将空白样品经过前处理后，加入系列浓度待测物标准作为基质匹配标准溶液，用以对检测结果进行校正，该方法可以在一定程度上补偿基质效应。
技术实现要素：
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本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种快速、高效、无需衍生化等繁琐过程，提取净化同时进行，最后直接以液相色谱-串联质谱测定烟草及烟草制品中2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏等三种苯氧羧酸类农药残留量的测定方法，该分析方法仅耗时4 min，能快速、准确检测烟草及烟草制品中三种苯氧羧酸类农药残留量，测定结果准确、且干扰少、有机溶剂消耗少。本发明方法简便、快速、净化效果较好, 各项技术指标均符合残留检测的要求。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种提取-净化同步法测定烟草中三种苯氧羧酸类农药残留量的方法，用盐酸水溶液对样品进行浸提，并用CH2Cl2进行反萃取，以液相色谱-串联质谱直接测定烟草及烟草制品中2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏农药残留量。具体步骤如下：
a、 样品的提取：称取1.0 g样品，置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL 0.5 moL/L的盐酸水溶液和10 mL的CH2Cl2，涡旋振荡15 min。移取1 mL下层有机相，过滤，进UPLC‒MS/MS检测；
b、空白基质溶液的制备：称取2.0 g空白样品（经检测不含本发明的三种农药的烟草样品），置于50 mL具塞离心管中，加入20 mL 0.5 moL/L的盐酸水溶液和20 mL的CH2Cl2，涡旋振荡15 min。移取下层有机相至储液管中备用；
c、标准工作溶液制备：分别称取0.01g三种农药(2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏)标准品到不同的10 mL容量瓶中，用CH2Cl2稀释并用空白基质溶液最终配制成具有浓度梯度的含三种农药的混合标准工作溶液；具体配制方式如下：分别称取0.01 g 2,4-滴、2,4,5-涕和麦草畏三种农药标准品至不同的10 mL容量瓶中，用CH2Cl2稀释定容，制得1000 μg/mL的标准储备液；分别移取以上三种农药单一标准储备液100 μL于10 mL容量瓶中，用CH2Cl2稀释定容至刻度，配得混合标准储备液（10.0 μg/mL）；分别移取混合标准储备液25 μL, 50μL, 100μL, 250 μL , 500 μL 及1000 μL到6个10 mL容量瓶中并用空白基质溶液定容；各标准工作溶液的浓度分别为0.025 μg/mL, 0.05 μg/mL, 0.1μg/mL, 0.25 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1.0 μg/mL；
d、液相色谱-串联质谱测定:吸取以上配制好的不同浓度的农药标准工作溶液，注入液相色谱-串联质谱仪；
e、农药残留量测定结果的计算
以外标法进行农药残留量的定量分析，即以目标物的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.994,对提取后的样品进行测定，测得检出分析物的定量离子对的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中的2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏等农药的残留量。
采用的液相色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)； 柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流动相为甲醇：水=98%：2%（体积比）；流速：0.3 mL/min。
质谱扫描方式：负离子扫描；离子源：电喷雾电离源(ESI)；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：800 L/h；停留时间：30 ms；毛细管电压：2.4 kV；采集模式: MRM。MRM参数见表1。
本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草样品优化了样品前处理方法和仪器检测条件，与现有技术相比具有如下优良效果：
（1）发明方法样品前处理过程简单，大大缩短了每个烟草样品的萃取前处理时间。行业标准《YC/T 181-2004烟草及烟草制品 有机氯除草剂农药残留量的测定 气相色谱法》，该标准方法采用60 mL二氯甲烷萃取，以三甲基亲氧化硫溶液甲酯衍生化，气相色谱-质谱测定，其前处理过程复杂费时，不利于高通量样品快速检测，且衍生化过程不确定性很大，结果重复性较差。
本发明方法将烟末用10mL的盐酸水溶液提取后用少量的CH2Cl2萃取，避免了样品浓缩、净化、衍生等过程造成的待测农药组分损失，又使实验操作更加简单、快捷，减少了大量有机溶剂的使用。
（2）气相色谱法使用的衍生化试剂对人体健康有害，从而限制了它们的使用；本发明无需衍生化从而使前处理过程变得比较简单。
（3）本发明采用超高效液相色谱和串联质谱联用，定量更加准确、同时也提高了灵敏度及重复性。
①本发明方法的检测限：
将不同浓度的2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏农药标准工作溶液注入UPLC-MS/MS，以3倍信噪比（S/N = 3）计算检测限（LOD），检测限在0.006 μg/g-0.023 μg/g之间。
②本发明方法的重复性和加标回收率：
在烟草样品中加入2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏农药的标准溶液，然后进行前处理和UPLC－MS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表2。由表2可以看出，三种农药的回收率在91.8％－95.6％之间，平均相对标准偏差（RSD）小于6.0%，说明本发明方法的回收率高，重复性好。
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附图说明
图1为本发明的测定方法流程图（该图作为摘要附图）。
图2 为三种苯氧羧酸类农药的选择离子色谱图。
具体实施方式
本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
实例1：
1．仪器与试剂：
农药：2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏均为标准品(纯度大于98%)；甲醇、二氯甲烷均为农残级，盐酸为分析纯。
Waters 液相色谱-串联四极杆质谱仪；涡旋振荡仪(美国Labnet公司)； AE 163电子天平（感量：0.0001g）（瑞士Mettler公司）。
2．样品处理：
称取1.0 g样品，置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL 0.5moL/L的盐酸水溶液和10 mL的CH2Cl2，涡旋振荡15min。移取1 mL下层有机相，过滤，进UPLC-MS/MS检测；
3.准备标准工作溶液：分别称取0.01 g 2,4-滴、2,4,5-涕和麦草畏三种农药标准品至不同的10 mL容量瓶中，用CH2Cl2稀释定容，制得1000 μg/mL的标准储备液；分别移取以上三种农药单一标准储备液100 μL于10 mL容量瓶中，用CH2Cl2稀释定容至刻度，配得混合标准储备液（10.0 μg/mL）；分别移取混合标准储备液25 μL, 50μL, 100μL, 250 μL , 500 μL 及1000 μL到6个10 mL容量瓶中并用空白基质溶液定容；各标准工作溶液的浓度分别为0.025 μg/mL, 0.05 μg/mL, 0.1μg/mL, 0.25 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1.0 μg/mL；
4.测定方法: 以外标法进行农药残留量的定量分析，即以目标物的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.994,对提取后的样品进行测定，测得检出分析物的定量离子对的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中的2,4-滴，2,4,5-涕含量量分别为0.40mg/kg和0.08mg/kg。
采用的液相色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7μ m)； 柱温：40 ℃；进样量：10μL；流动相为甲醇：水=98%：2%（体积比）；流速：0.3 mL/min。质谱扫描方式：负离子扫描；离子源：电喷雾电离源(ESI)；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：800 L/h；停留时间：30 ms；毛细管电压：2.4 kV；采集模式: MRM。
为判断方法的准确性，在此样品中加入0.5 µg/g的2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏标准溶液，进行同上的样品前处理，以UPLC‒MS/MS测得2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏选择离子峰面积，代入标准曲线，求得此时样品中2,4-滴和2,4,5-涕含量分别为0.88 μg/g和0.56 μg/g即2,4-滴，2,4,5-涕和麦草畏的加标回收率为97.7％，96.6%，说明此方法是准确的。
实例2： 按照实例1所述方法，选择另一烟叶样品，样品中麦草畏检出量为0.11 mg/kg。