一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法与流程

本发明属于生物医药
技术领域：
，尤其涉及各种蛋白质的超敏检测，具体为一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体lamp方法。
背景技术：
：蛋白质是生命活动得以实现的最关键的生物分子，生物体内蛋白质类型和含量的变化往往反映出生命活动状态的改变，因此蛋白质的检测是生命科学和医学领域里最基本的一种研究分析手段。在各种生物标本中，蛋白质的类型和含量往往差别较大，有些蛋白质含量丰富，而有些蛋白质则含量甚微。蛋白质的含量与其功能有关，但不代表含量低的蛋白质就不能发挥生理功能，现在我们已证实很多微量蛋白质在生物的各种生命活动中发挥着非常重要的作用，所以痕量蛋白质检测不仅在基因功能分析等基础性研究中有着重要作用，而且在疾病的诊断、治疗和预后等临床活动中也有着十分重要的意义。蛋白质的检测根据检测的特异性可分为总蛋白的检测和特异蛋白质检测。总蛋白的检测是非特异性，通常是根据各种蛋白质共有的特性(如含氮量)来进行检测，目前常用的总蛋白检测方法包括凯氏定氮法、紫外吸收法、染料法和双缩脲法等。此外，还有针对白蛋白或球蛋白的检测方法，如检测白蛋白的溴甲酚绿法和溴甲酚紫法，检测球蛋白的乙醛酸法等。特异蛋白质检测指某种蛋白质的检测，通常采用特异性抗体或其它特异结合物来进行检测，目前常用的检测方法包括酶联免疫吸附法(elisa)、化学发光法、电化学法和荧光免疫法等。痕量蛋白质的检测一般指某种特定蛋白质的检测，其检测方法也可称为蛋白质超敏检测方法，目前常用的蛋白质超敏检测方法包括超敏elisa、免疫pcr、纳米探针技术、化学发光法和放射免疫分析法等。超敏elisa和化学发光法的灵敏度虽然高于普通的蛋白质检测方法，但是其分析灵敏度远不如它超敏检测方法；放射免疫分析法灵敏度较好，但因使用放射性元素而逐渐被其它方法所取代；免疫pcr通过将蛋白质检测转换为核酸检测，显著提高了蛋白质检测的灵敏度，但因标记的核酸初始时即暴露于反应体系中，容易产生较高的本底值而影响检测的准确度；纳米探针技术以纳米粒子共振光散射体系为基础实现蛋白质的超敏检测，虽然具有操作简便、灵敏度高和利于后续分析等优点，但是纳米粒子的制备过程中影响因素较多，因此该技术检测痕量蛋白质的稳定性和重复性尚不够理想。鉴于上述现有的蛋白质超敏技术都存在某些方面的不足，研发一种新的简便、快速、灵敏和准确的痕量蛋白质检测新方法迫在眉睫。脂质体是一种主要由脂类构成的纳米颗粒，其脂质双分子层结构与生物体的细胞膜类似，脂质层外表面可进一步连接蛋白质、核酸等其它分子，其包裹的核心可容纳酶类、核酸、染料和药物等各种物质，因此脂质体作为一种药物载体在药物研发应用中发挥了十分重要的作用。另一方面，脂质体作为一种信号转换和放大载体在各种检测方法的构建中也起到了非常关键的作用。因此，如果用免疫脂质体包裹dna，那么就能够将蛋白质检测转换为dna检测，再通过后续具有超强信号放大能力的核酸扩增技术，就能够很好地实现各种蛋白质的超敏检测，而这正是本发明所要研发的新痕量蛋白质检测方法的理论假设。技术实现要素：有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体lamp方法，该方法可用于细胞培养液、血液、脑脊液等标本中微量蛋白质的准确检测。本发明提供方法的基本原理是(如图1)：用抗靶蛋白的抗体1标记磁珠制备免疫磁珠，用抗靶蛋白的抗体2标记包裹dna的脂质体制备免疫脂质体；在待测标本中先后加入免疫磁珠和免疫脂质体，待测标本中的靶蛋白会先后与免疫磁珠和免疫脂质体形成免疫磁珠-靶蛋白-免疫脂质体复合物，接着进行磁性分离并加入破膜剂破坏脂质体膜，然后对脂质体释放出的模板dna进行等温扩增；在固定时间内扩增产物量与模板dna量成正比，而模板dna的量则与待测标本中的靶蛋白含量成正比，也即是扩增产物量与待测靶蛋白的量成正比，这样通过检测扩增产物量就可以计算出待测标本中靶蛋白的含量。具体而言，为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体lamp方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)免疫磁珠-待测蛋白质复合物的形成：取待测标本(血清、细胞培养液等)于微量离心管中，加入混匀的免疫磁珠，室温放置20-40min后即可形成免疫磁珠-待测抗原复合物；(2)免疫磁珠-待测蛋白质-免疫脂质体复合物的形成：向步骤(1)中形成的免疫磁珠-待测抗原复合物中加入免疫脂质体复合物，轻轻混匀后室温放置20-40min，形成免疫磁珠-待测蛋白质-免疫脂质体复合物；(3)磁性分离：将微量离心管放置在磁力架上2-10min进行磁吸附，然后用移液器吸走管内液体；(4)人工破膜：向微量离心管中加入破膜剂，脂质体破坏后释放出包裹的dna模板；(5)lamp检测：取适量dna模板进行lamp检测，通过分析模板dna的量来确定标本中待测蛋白质的含量。优选地，步骤(1)所述的免疫磁珠由能特异性结合待测蛋白质的抗体和羧基化磁珠偶联形成。优选地，步骤(2)所述的免疫脂质体由能特异性结合待测蛋白质的抗体和脂质体膜嵌合形成。优选地，步骤(4)所述的破膜剂为triton-x-100。优选地，步骤(5)所述的免疫脂质体包裹的dna为斑马鱼细胞周期蛋白a1编码基因部分序列。优选地，步骤(5)所述优选的lamp检测引物组包括的引物如下：外引物f3:5’-ccgagaatgagcagcataa-3’(seqidno:1)；外引物b3:5’-cttcttcatcagccaatgaatg-3’(seqidno:2)；内引物fip:5’-acagtggctgtctcaatcacactccaggaggtgtctaagc-3’(seqidno:3)；内引物bip:5’-tccaacattattagtgttcgcttccaacacaagaacacgag-3’(seqidno:4)；环引物lf:5’-tcaccaattgacgctctgaa-3’(seqidno:5)；环引物lb:5’-ctgctagtactcgacgatgc-3’(seqidno:6)。所述的lamp检测可采用两种方式进行，即蛋白质定量检测时采用荧光检测方式，蛋白质定性检测时采用肉眼观察方式；荧光检测方式需在反应体系中加入sybrgreen荧光染料，肉眼观察方式需在反应体系中加入钙黄绿素。所述的lamp检测扩增条件为：63℃等温反应60min进行扩增，然后90℃等温反应2min终止反应。所述的lamp检测结果通过分析荧光定量pcr仪的实时荧光检测数据来进行判断，或通过观察pcr管内液体颜色的变化来判断结果。肉眼观察结果，橙色为扩增阴性，黄绿色为扩增阳性，只有阴阳性对照结果符合才能判读样本扩增结果。与现有一些方法相比，本发明的有益效果如下：(1)操作简便：试验过程与elisa类似，但无需进行多次洗板；等温扩增无需pcr仪等特殊设备；(2)检测快速：抗原抗体反应整个过程只需60min，等温扩增只需60min，扩增完成后结果可直接判读，整个检测过程所需时间在2.5h以内。(3)高特异性：采用双抗体夹心方式来特异检测靶蛋白，反应不会受到白蛋白、免疫球蛋白等血清高丰度蛋白的影响。(4)高灵敏性：能检测出的最低值可达fg/ml，为elisa方法的1500倍。(5)高准确性：反应的高特异性是方法高准确性的基础，加上操作简便快速，能够有效防治各种因素的干扰；另外，抗原抗体反应和等温扩增反应定量计算技术的成熟也是高准确性的保证。附图说明图1是本发明所提供方法的检测原理图(以检测afp为例)。如图1中b部分，首先在反应管中加入免疫磁珠(磁珠标记抗afp抗体1)，接着加入待测标本，待测标本中如果含有afp抗原，该抗原就会与免疫磁珠上的相应抗体结合；进行磁性分离后再加入免疫脂质体(脂质体标记抗afp抗体2)和dna酶，免疫脂质体通过其外部抗afp抗体与抗原结合，而dna酶则会降解反应溶液中的dna来消除外源污染；然后再次进行磁性分离，至此反应体系中只有免疫磁珠-afp抗原-免疫脂质体反应复合物(如图1中a部分)和未结合的免疫磁珠存在；最后加入破膜剂tritonx-100破坏脂质体，以释放出的dna(斑马鱼ccna1基因部分序列)作为模板进行lamp反应(如图1中a部分)，通过肉眼观察反应溶液的颜色变化来判断标本中是否含有afp抗原；此外，还可通过荧光定量pcr仪来进行定量检测，由于扩增产物量与标本中抗原量成正比，所以通过制作标准曲线即可得到抗原含量。图2是制备免疫磁珠的电镜检测图。黑色圆形物体为磁珠，周围灰色物质为连接的抗体。图3是包裹dna免疫脂质体的电镜检测图。脂质体直径为数百纳米至一千纳米。图4是lamp体系构建的扩增结果图。扩增靶基因为斑马鱼的ccna1基因。该体系扩增mtb、ntm标准株和人基因组dna时结果均为阴性，说明该体系不会受到各种分枝杆菌和人基因组dna的干扰，具体结果见图4。上排的pcr八连管(从管1至管8)分别为mtb、bcg、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌的基因组扩增管；下排的pcr八连管管1为斑马鱼基因组扩增管，管2至管6为人基因组扩增管，管7为阳性对照管，管8为阴性对照管。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但所描述的实例只是本发明的部分实施例，而不是全部实施例，故不应该理解为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，在无创造性劳动前提下对本发明方法、步骤或条件的修改或替换，都属于本发明保护的范围。实施例1：免疫磁珠的制备1、磁珠的活化：取0.5mg羧基化磁珠于1.5ml微量离心管中，加入500μlpbst活化缓冲液(ph＝6.0)，漩涡振荡混匀后置于磁分离架上，1min后弃去上清液。再加入500μl活化缓冲液，重复洗涤两次后加入485μl活化缓冲液，接着加入15μl0.1g/mledc/nhs溶液，混匀后室温放置30min。2、抗体偶联：用pbst活化缓冲液洗涤活化的磁珠三遍，再用pbst偶联缓冲液(ph＝7.4)洗涤两遍。吸附磁珠并弃去上清液，加入475μl偶联缓冲液重悬磁珠和25μl一定浓度的抗体溶液(采用afp作为靶抗原，故此处为抗人afp抗体1)，混匀后室温放置一段时间。由于抗体浓度和偶联时间对抗体偶联效果影响较大，故分别设置不同的抗体浓度和偶联时间进行优化。3、封闭与保存：将已偶联的磁珠用500μl偶联缓冲液洗涤两遍，然后加入500μl含1％牛血清白蛋白的偶联缓冲液，混匀后室温放置30min。吸附磁珠并弃去上清液，再重复封闭两次，最后用500μl含0.02％na3n、0.1％牛血清白蛋白的pbst溶液(ph＝7.4)重悬磁珠，放置4℃保存备用。制备好的免疫磁珠可通过透射电镜进行观察(如图2)。实施例2：免疫脂质体的制备1、将胆固醇、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺溶于乙醚、氯仿混合溶剂中，在旋转蒸发器上减压蒸发形成薄膜。再加入乙醚、氯仿混合物和含兔抗人afp抗体(此处为抗人afp抗体2)和dna片段(斑马鱼ccna1基因部分序列)的tris-hcl缓冲液，超声处理直至混合溶液形成均匀的w/o型反相乳(即油包水型)。然后将混合乳液在30水浴中旋转蒸发至粘性凝胶状，减压蒸发凝胶转相至液态，再补充一定量的tris-hcl缓冲液，超声处理后得到免疫脂质体。2、将免疫脂质体溶液于20000r/min、4℃条件下离心30min，弃去上清液后用tris-hcl缓冲液重复洗涤2遍。弃去上清液后用3mltris-hcl缓冲液重悬免疫脂质体，并置4℃保存保存备用。制备好的免疫脂质体可通过透射电镜进行观察(如图3)。实施例3：lamp体系的构建1、lamp检测扩增的靶基因为斑马鱼ccna1基因。引物组包括的引物如下：外引物f3:5’-ccgagaatgagcagcataa-3’seqidno:1；外引物b3:5’-cttcttcatcagccaatgaatg-3’seqidno:2；内引物fip:5’-acagtggctgtctcaatcacactccaggaggtgtctaagc-3’seqidno:3；内引物bip:5’-tccaacattattagtgttcgcttccaacacaagaacacgag-3’seqidno:4；环引物lf:5’-tcaccaattgacgctctgaa-3’seqidno:5；环引物lb:5’-ctgctagtactcgacgatgc-3’seqidno:6。2、蛋白质定量检测时采用荧光检测方式，蛋白质定性检测时采用肉眼观察方式；荧光检测方式需在反应体系中加入sybrgreen荧光染料，肉眼观察方式需在反应体系中加入钙黄绿素。lamp检测扩增条件为：63℃等温反应60min进行扩增(若使用荧光定量pcr仪进行扩增，则为1个循环1min，共60个循环)，然后90℃等温反应2min终止反应。3、lamp检测结果通过分析荧光定量pcr仪的实时荧光检测数据来进行判断，或通过观察pcr管内液体颜色的变化来判断结果。肉眼观察结果，橙色为扩增阴性，黄绿色为扩增阳性，只有阴阳性对照结果符合才能判读样本扩增结果。实施例4：人血清标本中afp的检测1、免疫磁珠-待测蛋白质复合物的形成：取50μl待测血清标本于1.5ml微量离心管中，加入50μl混匀的抗afp免疫磁珠，室温放置30min后即可形成免疫磁珠-待测抗原复合物；2、免疫磁珠-待测蛋白质-免疫脂质体复合物的形成：加入100μl抗afp的免疫脂质体复合物，轻轻混匀后室温放置30min；3、磁性分离：将微量离心管放置在磁力架上5min进行磁吸附，然后用移液器吸走管内液体；有残余液体的情况下可加入tris-hcl缓冲液洗涤一次后再次进行磁性分离。4、人工破膜：加入50μl破膜剂tritonx-100，脂质体破坏后释放出包裹的dna模板(ccna1基因部分序列)；5、lamp检测：取2μldna模板进行lamp检测，反应体系见下表；反应条件为：63℃等温反应60min进行扩增(若使用荧光定量pcr仪进行扩增，则为1个循环1min，共60个循环)，然后90℃等温反应2min终止反应；通过分析模板dna的量来确定标本中待测蛋白质的含量。扩增体系如表一所示：表一组分名称加入量(μl)组分名称加入量(μl)反应液10bstdna聚合酶0.8内引物4荧光染料/显色剂0.4外引物0.5样品dna2环引物2加水补齐至20lamp检测结果通过分析荧光定量pcr仪的实时荧光检测数据来进行判断，或通过观察pcr管内液体颜色的变化来判断结果。肉眼观察结果，橙色为扩增阴性，黄绿色为扩增阳性，只有阴阳性对照结果符合才能判读样本扩增结果。扩增靶基因为斑马鱼的ccna1基因。如果图4所示，该体系扩增mtb、ntm标准株和人基因组dna时结果均为阴性，说明该体系不会受到各种分枝杆菌和人基因组dna的干扰，具体结果见图4。上排的pcr八连管(从管1至管8)分别为mtb、bcg、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌的基因组扩增管；下排的pcr八连管管1为斑马鱼基因组扩增管，管2至管6为人基因组扩增管，管7为阳性对照管，管8为阴性对照管。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<110>蔡,慧娜<120>一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体lamp方法<130>2017<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ccgagaatgagcagcataa19<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cttcttcatcagccaatgaatg22<210>3<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3acagtggctgtctcaatcacactccaggaggtgtctaagc40<210>4<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tccaacattattagtgttcgcttccaacacaagaacacgag41<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tcaccaattgacgctctgaa20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ctgctagtactcgacgatgc20当前第1页12