一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒。

背景技术：

核酸适体(aptamer)是经体外筛选技术selex(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。核酸适体作为一种新型的分子识别工具，与传统的抗体相比不仅具有亲和力高，特异性好，还具有易合成、易修饰、稳定性好等优点，在蛋白质、分子检测领域具有良好的应用潜力。近年来，结合核酸适体的分子特性，将蛋白质的检测转换为特异识别的核酸适体的检测，不仅避免了传统蛋白质检测方法中操作复杂、常需对蛋白质进行标记、不易保持活性等缺点，还有效地提高了蛋白质检测的效率与灵敏度。

现有基于核酸适体的检测方法，一般比较复杂，难以通过变更核酸适体序列的方式实现对不同物质的检测，导致其设计较为困难，限制了其使用范围。开发出一种具有良好通用性的检测试剂盒具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供克服现有技术的不足，提供一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒，包括可区分单链和双链dna荧光染料，核酸外切酶ⅲ，反应缓冲液，dna1、dna2和茎环结构核酸h1，其中：

dna1为待测分子的核酸适体；

dna2与dna1部分互补，互补配对后dna2的3’末端具有凸起；

h1包含a、b、c、b*以及d五个部分，a部分为5'端凸起，d部分为3'端凸起，b及b*互补形成h1茎环结构的茎，c为h1茎环结构的环；d可与dna2的5'端部分互补配对形成双链dna，并在h1的3’端形成3'平末端或3'凹陷末端。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，h1的a与dna2的3’端部分互补配对形成双链dna，并在dna2的3’端形成凸起。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，dna1和dna2互补配对后，dna1的3’端具有凸起。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，互补配对后dna2的3’末端至少6个碱基是凸起的。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，a部分的碱基数为8到12个。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，c部分的碱基数为12到21个。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，d部分的碱基数为10到15个。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，b以及b*部分的碱基数为7到12个。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，dna1和dna2互补的碱基数为16～27个。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，反应缓冲液包含15mmtris-hcl，50mmnacl，10mmmgcl2,ph7.0。

一种马拉硫磷残留检测试剂盒，包括：

(1)核酸dna1、dna2、茎环结构核酸h1，其序列如下：

马拉硫磷适体dna1：5'-atccgtcacacctgctcttatacacaattgtttttctcttaacttcttgactgctggtgttggctcccgtat-3'(seqidno：1)；

dna2：5'-aagttaagagaaaaacaattgacacac-3'(seqidno：2)；

h1：5'-caattgttt-gcttacggt-atacctacgtcgatcgca-accgtaagc-ttctcttaactt-3'(seqidno：3)；

(2)核酸外切酶ⅲ

(3)马拉硫磷标准溶液

(4)反应缓冲液，含15mmtris-hcl，50mmnacl，10mmmgcl2,ph7.0。

本发明的有益效果是：

1)无需使用抗体，以核酸适体为分子识别元件，易于保存，稳定性好，便于制备试剂盒，可在室温下长期保存；

2)灵敏度高，加入核酸外切酶iii进行信号扩增，可提高检测灵敏度，有利于检测痕量分子，特别是农药残留；

3)无需标记，以双链dna荧光染料为荧光信号指示剂，大大简化了操作，降低了成本，反应过程无需洗涤分离过程，简单混合即可检测，适合大多数企业和单位快速检测不同样品中的待测物质含量。

附图说明

图1是本发明检测试剂盒的检测原理图；

图2是是不同浓度马拉硫磷检测结果图；

图3是特异性实验结果。

具体实施方式

一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒，包括核酸外切酶ⅲ，反应缓冲液，dna1、dna2和茎环结构核酸h1，其中：

dna1为待测分子的核酸适体；

dna2与dna1部分互补，互补配对后dna2的3’末端具有凸起；

h1包含a、b、c、b*以及d五个部分，a部分为5'端凸起，d部分为3'端凸起，b及b*互补形成h1茎环结构的茎，c为h1茎环结构的环；d可与dna2的5'端部分互补配对形成双链dna，并在h1的3’端形成3'平末端或3'凹陷末端。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，h1的a与dna2的3’端部分互补配对形成双链dna，并在dna2的3’端形成凸起。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，dna1和dna2互补配对后，dna1的3’端具有凸起。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，互补配对后dna2的3’末端至少6个碱基是凸起的。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，a部分的碱基数为8到12个，优选的为9个。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，c部分的碱基数为12到21个，优选的为18个。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，d部分的碱基数为10到15个，优选的为12个。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，b以及b*部分的碱基数为7到12个，优选的为9个。这样既可以保证h1茎环结构中茎的稳定，也可以保证荧光染料可以很好地插入在dna双链中。

作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，dna1和dna2互补的碱基数为16～27个，优选的为18个。这样可以避免在没有核酸适体底物存在的情况下，dna1和dna2可以形成较为稳定的双链复合物。

检测试剂盒对反应缓冲液没有特殊要求，一般而言，只要能保持反应ph的稳定，具有核酸外切酶ⅲ反应时所需要的离子，且不与待测物质发生反应即可。作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，反应缓冲液包含15mmtris-hcl，50mmnacl，10mmmgcl2,ph7.0。

以马拉硫磷残留的检测为例，本发明检测试剂盒的检测原理如图1所示。

1)dna1是马拉硫磷的核酸适体，dna2与dna1部分互补，dna2的3'端凸起。当检测体系存在马拉硫磷时，马拉硫磷与dna1结合，从而把dna2置换下来；

2)茎环结构的h1包含五个部分，分别是a、b、c、b*以及d，a部分位于5'端凸起，d部分位于3'端凸起。步骤(1)置换下来的dna2可与h1的a部分和d部分互补，使h1的3'端变成平末端，同时dna2的3'末端是凸起的；

3)加入核酸外切酶ⅲ，核酸外切酶ⅲ只能切割双链dna中的3'平末端或3'凹陷末端，不能切割3'凸起，也不能切割单链dna。因此，加入核酸外切酶ⅲ后，可从h1的3'平末端开始切割h1，释放单个碱基，切割后h1的a-b-c部分被释放，同时dna2也被释放

4)释放的dna2可不断循环与h1结合，进行信号扩增

5)加入sybrgreeni进行染色检测，由于sybrgreeni跟单链结合后荧光强度很弱，只有跟双链dna结合，才能发出强荧光。没有马拉硫磷时，体系核酸存在很多双链dna结构(图1左下角图示)，体系具有较强的荧光；当体系纯在马拉硫磷，双链结构被核酸外切酶ⅲ切割变成单链结构，此时荧光强度达到下降，马拉硫磷的浓度与sybrgreeni的荧光强度成反比，从而达到检测马拉硫磷的目的。

sybrgreeni可以使用其他可区分单链和双链dna的荧光染料替代，可区分单链和双链dna的荧光染料包括但不限于eb、genefinder等。

实施例1：

一种马拉硫磷残留检测试剂盒，包括：

(1)核酸dna1、dna2、茎环结构核酸h1，其序列如下：

马拉硫磷适体dna1：5'-atccgtcacacctgctcttatacacaattgtttttctcttaacttcttgactgctggtgttggctcccgtat-3'；

dna2：5'-aagttaagagaaaaacaattgacacac-3'；

h1：5'-caattgttt(a)-gcttacggt(b)-atacctacgtcgatcgca(c)-accgtaagc(b*)-ttctcttaactt(d)-3'；

(2)核酸外切酶ⅲ

(3)马拉硫磷标准溶液

(4)反应缓冲液，含15mmtris-hcl，50mmnacl，10mmmgcl2,ph7.0。

检测方法如下：

1)先用反应缓冲液(15mmtris-hcl，50mmnacl，10mmmgcl2,ph7.0)分别溶解dna1、dna2、h1；

2)300nm的dna1和dna2充分混匀，室温反应30分钟，形成dna1-dna2混合物；

3)加入不同浓度的马拉硫磷于步骤(2)中，充分混匀，室温反应40分钟；

4)500nm的h1加入到步骤(3)中，充分混匀，室温反应30分钟；

5)在步骤(4)中加入20u的核酸外切酶ⅲ，充分混匀，室温反应90分钟；

6)加入可区分单链和双链dna的荧光染料1xsybrgreeni，充分混匀，室温反应15分钟后于荧光分光光度计上检测，激发峰为495nm，发射峰为525nm。随着马拉硫磷浓度的增加，荧光强度逐渐下降，二者具有很好的相关性，从而可实现定量检测马拉硫磷。

不同浓度马拉硫磷的检测实验：

配制马拉硫磷标准溶液，浓度分别为10pm、100pm、1nm、10nm、100nm、200nm、400nm

马拉硫磷溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度。如图2所示，随着马拉硫磷浓度的增加，对应的荧光强度逐渐下降，当马拉硫磷浓度超过100nm时，体系逐渐达到饱和，荧光下降至平稳。以马拉硫磷浓度的对数(lgc)为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，二者具有很好的线性关系，线性范围是从10pm到100nm，线性方程是：f＝40-8lgc(r²＝0.994)(f为荧光强度，c为马拉硫磷浓度)，按照3倍信噪比标准(3s/n)，检测限为5pm。

特异性实验：

选取其他农药残留为对照物，考察检测体系的特异选择性，包括啶虫脒、ddt、氯丹、乐果、敌百虫、西维因、毒杀酚。

将100nm的啶虫脒、ddt、氯丹、乐果、敌百虫、西维因、毒杀酚标准溶液和100nm的马拉硫磷标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图3所示，100nm的啶虫脒、ddt、氯丹、乐果、敌百虫、西维因、毒杀酚的荧光强度与空白样品相比，变化不大，对检测不产生影响。只有当加入马拉硫磷时才会使荧光强度显著下降，这证明该方法对马拉硫磷的检测具有很好的特异性，其他农药残留类似物对检测不产生影响。

序列表

<110>广东省生态环境技术研究所

<120>一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>72

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atccgtcacacctgctcttatacacaattgtttttctcttaacttcttgactgctggtgt60

tggctcccgtat72

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aagttaagagaaaaacaattgacacac27

<210>3

<211>57

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caattgtttgcttacggtatacctacgtcgatcgcaaccgtaagcttctcttaactt57