一种基于NMR代谢组学技术解析怀山药营养成分分布的方法与流程

本发明涉及植物代谢组学领域，特别是指一种基于nmr代谢组学技术解析怀山药营养成分分布的方法。

背景技术：

代谢组学(metabonomics或metabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。之后得到迅速发展并渗透到多项领域，比如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学，植物学等与人类健康护理密切相关的领域。其样品主要是动植物的细胞和组织的提取液。主要技术手段是核磁共振（nmr），质谱（ms），色谱（hplc，gc）及色谱质谱联用技术。核磁共振（nmr）由于其灵敏性、无损性以及能够根据特征峰定性的探测代谢物成分等优点，已发展为代谢组学中最常用的化学分析检测技术。核磁测定样品是非破坏性的，且只要很少的样品预处理，就可以获得提取物的结构信息，具有较好的重现性。

怀山药（dioscoreaoppositathunb）是薯蓣科(dioscoreal.)薯蓣属植物，药食兼优，为我国著名的“四大怀药”之一。主产于河南温县、武陟、博爱、沁阳等地，在我国有着悠久的药用历史和广泛的栽培，为河南道地药材，质量居全国之首，以其质坚、粉足、色白而闻名海内外。怀山药性平、味甘，据《神农本草经》记载其具有“主治伤中、补虚赢、除寒邪热、补中益气力，长肌肉、久服耳目聪明、轻身不饥、延年”之功效，怀山药营养丰富，含有多种活性成分。目前，怀山药中化学成分的研究多用传统的hplc、gc-ms等色谱方法，在检测过程中均需要一个分离过程，一些微量成分可能会损失，且研究者仅仅是测定怀山药中的化学成分，对于化学成分是分布在去皮怀山药中还是在怀山药皮中没有进行分析。张敏等（食品工程，2014年第4期）报道了基于nmr代谢组学的技术，分别对生怀山药饮片、麸炒怀山药及食用怀山药的化学成分进行研究，仅检测出30多种化合物，没有对怀山药中的营养成分分布进行分析。

技术实现要素：

本发明提出一种基于nmr代谢组学技术解析怀山药营养成分分布的方法，本发明创新性运用基于¹h-nmr的代谢组学技术，首次检测了怀山药去皮组和带皮组中的化学成分，建立了¹h-nmr指纹图谱，利用偏最小二乘法判别分析opls-da对铁棍怀山药带皮组和去皮组进行分析，最终确定怀山药营养成分在怀山药肉或是怀山药皮中的分布情况。对道地怀山药的代谢网络分析及调控、品种鉴定、道地真假辨别、精准膳食等提供基础数据和科学依据。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种基于nmr代谢组学技术解析怀山药营养成分分布的方法，包括如下步骤：

s1怀山药样本的制备：将怀山药样品清洗干净、晾干，同一根怀山药纵向分为两部分，怀山药带皮组和怀山药去皮组，将两组分别切成薄片，薄片经冷冻干燥后，粉碎得怀山药带皮组冻干粉和怀山药去皮组冻干粉，以待后续分析；

s2怀山药营养成分的提取：分别称取怀山药带皮组冻干粉和怀山药去皮组冻干粉，置于不同的离心管中，加入甲醇溶液后，经震荡、提取、离心后，取上清ⅰ经真空浓缩蒸干得到残渣，然后向残渣中加入氘代甲醇和0.2m的磷酸缓冲溶，混匀后置于离心管中使残渣充分溶解，离心后取上清ⅱ待测定；

s3怀山药营养成分的测定：分别称取两组的上清ⅱ置于测定仪器中，测定仪器采用布鲁克av-600mhz核磁共振光谱仪，5mm多核宽带观测探头，观测频率为600.13mhz，脉冲序列采用noesypr1d实现残余水峰的压制，观测频率为600.13mhz；

s4怀山药营养成分的分析：利用偏最小二乘法判别分析opls-da对怀山药带皮组和去皮组进行分析。

所述步骤s1中薄片的厚度为2-3mm，冷冻干燥处理为先将薄片置于-80℃环境中过夜冷冻，取出后迅速于冷冻干燥机内-90℃真空低温冷冻干燥72小时。

所述步骤s2的具体操作为分别称取500-700mg怀山药带皮冻干粉和怀山药去皮冻干粉，置于不同的50ml离心管中，加入8-15ml70%的甲醇溶液，涡旋振荡器上震荡10-15min，超声提取30-45min，4500rp/m离心8-10分钟，将两组的上清ⅰ移至25ml的圆底玻璃烧瓶中，真空浓缩蒸干得到两组残渣，分别向两组蒸干后的残渣中加入560-700μl氘代甲醇和240-300μl0.2m的磷酸缓冲溶液，混匀后吸出并置于5ml离心管中，涡旋2-5min，超声2-5min，使提取残渣充分溶解，以12000rp/m离心10-15min，分别移取500-700μl两组的上清ⅱ至5mm的核磁管中以待测定。

所述步骤s2中磷酸缓冲溶液由纯重水配置，ph为7.4，含0.05%tsp内标。

所述步骤s2中每个怀山药冻干粉平行制备6-10份。

所述步骤s3中核磁共振光谱仪的实验参数为sw为20.0ppm，o1p为6.175ppm，fidres为0.183hz，ns为64。

本技术方案能产生的有益效果：

1.本发明对怀山药的代谢网络分析及调控、品种鉴定、道地真假辨别、精准膳食等提供基础数据和科学依据。该法操作简单快速、结果准确可靠。

2.本发明建立了铁棍怀山药样本的制备，营养成分的提取、测定、识别，营养成分的分布解析。本发明样品预处理仅为500-700mg怀山药冻干粉，就可以获得提取物的结构信息，具有较好的重现性。本发明的测定和识别采用核磁共振技术，具有灵敏性、无损性以及能够根据特征峰定性的探测代谢物成分等优点。

3.本发明建立了¹h-nmr指纹图谱，利用偏最小二乘法判别（opls-da）对铁棍怀山药带皮组和去皮组进行分析，最终确定怀山药营养成分在怀山药肉或是怀山药皮中的分布情况。

附图说明

图1为带皮铁棍怀山药典型600mnmr指纹图谱。

图2为去皮铁棍怀山药和带皮铁棍怀山药中营养成分的识别。

图3为铁棍怀山药去皮组和带皮组营养成分的opls-da得分图。

图4为铁棍怀山药去皮组和带皮组营养成分分布的的bioplot图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种基于nmr代谢组学技术解析道地怀山药营养成分分布的方法，包括如下步骤：

s1铁棍怀山药样本的制备：将铁棍怀山药清洗干净，晾干，同一根铁棍怀山药纵向分为两部分，一部分带皮，另一部分将皮去除，去皮或带皮的铁棍怀山药用切药机切成2-3mm厚的薄片，把铁棍怀山药薄片置于-80℃环境中过夜冷冻，取出后迅速于冷冻干燥机内-90℃真空低温冷冻干燥72小时，待完全干燥后投入粉碎机中粉碎成铁棍怀山药冻干粉以待后续分析。

铁棍怀山药营养成分的提取：分别称取600mg铁棍怀山药冻干粉（带皮或去皮），置于50ml离心管中，加入10ml70%的甲醇溶液，涡旋振荡器上震荡10min，超声提取40min，4500rp/m离心10分钟，将上清ⅰ移至25ml的圆底玻璃烧瓶中，真空浓缩蒸干得到残渣，在残渣中加入700μl氘代甲醇和300μl0.2m的磷酸缓冲溶液（由纯重水配置，ph=7.4，含0.05%tsp内标），混匀后吸出并置于5ml离心管中，涡旋2min，超声2min，使提取的残渣充分溶解，以12000rp/m离心10min，移取600μl上清ⅱ至5mm的核磁管中以待测定。每批铁棍怀山药样品平行制备8份。

铁棍怀山药营养成分的测定：测定仪器使用布鲁克av-600mhz核磁共振光谱仪，5mm多核宽带观测（bbo）探头，观测频率为600.13mhz，脉冲序列采用noesypr1d（rd-90˚-t1-90˚-tm-90˚-acquire）实现残余水峰的压制，观测频率600.13mhz，详细实验参数如下：sw为20.0ppm，o1p为6.175ppm，fidres为0.183hz，ns为64。

铁棍怀山药营养成分的识别：如图2所示，其中1.脱氢表雄酮，2.异亮氨酸，3.缬氨酸，4.苏氨酸，5.丙氨酸，6.亮氨酸，7.精氨酸，8.谷氨酸，9.γ-氨基丁酸，10.苹果酸，11.柠檬酸，12.天冬氨酸，13.天冬酰胺，14.牛磺酸，15.甲醇，16.甘氨酸，17.1,5-柠檬酸双甲酯，18.葡萄糖，19.β-果糖，20.甘露糖，21.葫芦巴碱，22.半乳糖，23.尿囊素，24.蔗糖，25.腺苷，26.延胡索酸酯，27.富马酸，28.怀山药素，29.环-（苯丙氨酸-酪氨酸），30.酪氨酸，31.组氨酸，32.苯丙氨酸，33.甲酸。

铁棍怀山药带皮和去皮时营养成分分布：利用偏最小二乘法判别分析opls-da对铁棍怀山药带皮组和去皮组进行分析，如图3所示，可以看到去皮组和带皮组两组明显分开，去皮组全部聚集在opls-da得分图左侧，而带皮组则全部聚集在右侧。

铁棍怀山药去皮组和带皮组的bioplot图如图4显示，相对去皮组铁棍怀山药，带皮组铁棍怀山药中牛磺酸、甘氨酸、1,5-柠檬酸双甲酯、蔗糖、富马酸及怀山药素等营养成分含量较高，而脱氢表雄酮、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、苹果酸、柠檬酸、天冬氨酸、葡萄糖、葫芦巴碱、尿囊素等营养成分含量则相对较低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。