本发明属于分析化学领域，具体涉及一种通过测定起始原料sm2含量来完成替格瑞洛中间体1的合成反应程度测定的方法及其应用。
背景技术：
：替格瑞洛是抗血小板聚集药，可用于急性冠脉综合征(不稳定性心绞痛、非st段抬高心肌梗死或st段抬高心肌梗死)患者，包括接受药物治疗和经皮冠状动脉介入(pci)治疗的患者，降低血栓性心血管事件的发生率。本公司生产的原料药替格瑞洛由起始原料sm1和起始原料sm2发生取代反应生成中间体1，中间体1与亚硝酸钠发生环合反应生成未分离中间体2，未分离中间体2与sm3发生取代反应生成未分离中间体3，未分离中间体3经盐酸水解得到中间体4，即粗品，中间体4经乙腈精制后得到替格瑞洛成品。替格瑞洛合成路线如下：从上述合成路线可知，sm1分子式为：4,6-二氯-2-(丙硫基)-5-氨基嘧啶，化学结构式如下：sm2分子式为：2-[[(3ar,4s,6r,6as)-6-氨基四氢-2,2-二甲基-4h-环戊并-1,3-二恶茂-4-基]氧基]-乙醇(2r,3r)-2,3-二羟基丁二酸盐，化学结构式如下：替格瑞洛中间体1分子式为：2-((3ar,4s,6r,6as)-6-(5-氨基-6-氯-2-(丙巯基)-嘧啶-4-胺基)-2,2-二甲基-四氢-3ah-环戊并[d][1,3]二氧戊环-4-氧基)乙醇：化学结构式如下：从上述结构式可知，sm2无发色基团，而因考虑到生产成本，制备替格瑞洛中间体1时，sm1为过量反应物，为保证本步反应能够反应充分，最大程度的生成中间体1，从而最终保证成品的收率，本步反应需对sm2进行定量检测。考虑到sm2无发色基团，无紫外吸收，常规的高效液相色谱法配备紫外检测器，采用面积归一化法，无法监控反应过程中sm2的剩余量，即无法实时有效的监控本步反应的进行程度。常规的气相色谱法用于监控中间体1的反应过程因反应液中溶剂较多，对所需监控的目标物sm2容易产生干扰，另外若采用高效液相色谱-配备示差检测器，因示差检测受溶剂前沿峰的干扰使得分析复杂化，并且由于对温度极其敏感使得基线很不稳定，另外，示差检测器的响应灵敏度受限。也就是说，现有技术缺少一种对合成替格瑞洛中间体1所用sm2进行定量测定的有效方法。到目前为止，还没有公开的方法报道可有效对合成替格瑞洛中间体1所用sm2进行定量测定。因此开发一种测定合成替格瑞洛中间体1所用sm2的方法，有助于实现对反应过程的掌控，对于实现替格瑞洛的工艺收率提高，质量控制、安全性保证具有极其重要的意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种替格瑞洛中间体1的合成反应程度测定方法，该方法通过采用高效液相色谱-配备蒸发光散射检测器测定sm2的含量来完成替格瑞洛中间体1的合成反应程度的测定。为实现上述目的，本发明的技术方案为：替格瑞洛中间体1合成反应的反应式为：为降低成本，生产中sm1为过量反应物，因此上述测定方法通过对反应液中sm2进行定量检测来完成，采用高效液相色谱-配备蒸发光散射检测器进行测定。高效液相色谱-配备蒸发光散射检测器以液相色谱作为分离系统，蒸发光散射检测器为检测系统。样品在色谱柱上通过流动相分离，将柱洗脱液雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发，最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测。上述测定方法包括以下步骤：1)反应液经稀释剂稀释，得供试品溶液；2)取供试品溶液通过高效液相色谱柱，流动相洗脱完成分离，并通过蒸发光散射检测器检测得到峰面积y’；3)计算：将测得的sm2的峰面积y’，取对数后lgy’，代入外标法得到的线性方程，求得供试品溶液中sm2的浓度对数lgx’，根据lgx’得到供试品溶液中sm2的浓度x’，进而求得反应液中sm2含量。稀释剂为乙腈的水溶液。其中sm2的含量为其游离态的含量，每1gsm2中含游离态的理论质量数为0.59g。蒸发光散射检测器的散射光的响应值与粒子质量的关系如下：i＝kmb取对数：lgi＝blgm+lgk其中：m：待测组分的粒子质量和；i：待测组分所产生的散射光光强；k,b：常数；可知当进样量相同时，对数浓度lgx与对数峰面积lgy呈线性相关，故需使用log/log双对数方法产生线性曲线，根据三个以上对应数值进行线性回归得到线性方程和相关系数r，所述线性方程的计算包括以下步骤：1)取三个以上浓度的对照品溶液和稀释剂溶液，过高效液相色谱柱完成分离，并通过蒸发光散射检测器检测得到峰面积y；2)使用log/log双对数方法产生线性曲线：不同浓度对照品溶液的对数浓度lgx对对数峰面积lgy进行线性回归，计算得到线性方程和相关系数r，r>0.999。作为优选的方案，上述稀释剂中乙腈的体积含量为50％-80％。作为优选的方案，上述高效液相色谱采用以硅胶为基质、键合烷基酰胺基填料的色谱柱。进一步，色谱柱颗粒粒径为2-5μm，柱长为150-250mm，柱温为25-55℃。作为优选的方案，以含三氟乙酸的醋酸铵溶液和有机溶剂的混合液为流动相，其中有机溶剂的体积含量为50％-80％。进一步，优选的，上述有机溶剂为乙腈，醋酸铵溶液浓度为0.01mol/l-0.03mol/l，醋酸铵溶液中三氟乙酸体积含量为0.1％-0.5％。作为优选的方案，流动相的流速为0.5ml/min-1.5ml/min。蒸发光散射检测器的检测原理为，首先将柱洗脱液雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发，最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测。1、雾化:液体流动相在载气压力的作用下在雾化室内转变成细小的液滴，从而使溶剂更易于蒸发。蒸发光散射检测器，通过对气压和温度的精确控制，确保在雾化室内形成一个较窄的液滴尺寸分布，使液滴蒸发所需要的温度大大降低。2、蒸发:载气把液滴从雾化室运送到漂移管进行蒸发。在漂移管中，溶剂被除去，留下微粒或纯溶质的小滴。蒸发光散射检测器采用低温蒸发模式，维持了颗粒的均匀性。3、检测:光源采用激光，溶质颗粒从漂移管出来后进入光检测池，并穿过激光光束。被溶质颗粒散射的光通过光电倍增管进行收集。作为优选的方案，所述蒸发光散射检测器漂移管温度为40-115℃，优选为80-100℃。作为优选的方案，载气流速为1.5ml/min～3.0ml/min。作为优选的方案，撞击器为on。本发明的目的之二在于提供一种上述的测定方法在替格瑞洛中间体1的合成反应程度测定中的应用，其准确度高，操作简单，能快速准确的测定替格瑞洛中间体1的合成反应程度。为实现上述目的，本发明的技术方案为：通过采用高效液相色谱-配备蒸发光散射检测器测定sm2的含量来完成替格瑞洛中间体1的合成反应程度的测定。将测得的sm2的峰面积代入外标法所得线性方程，求得供试品溶液中sm2的含量，进而求得反应液中sm2含量，即可知替格瑞洛中间体1的合成反应程度。本发明的有益效果在于：本发明提供的高效液相色谱法-配备蒸发光散射检测器，测定合成替格瑞洛中间体1所用sm2剩余量的分析方法，该方法首先建立设定sm2含量的计算模型，通过该模型计算sm2含量准确、简单，该方法能快速准确的测定出合成替格瑞洛中间体1的合成反应程度。对于实现替格瑞洛的工艺收率提高，质量控制及安全性保证具有极其重要的意义。附图说明图1为稀释剂的高效液相色谱图。图2为sm2对照品线性溶液的高效液相色谱图。图3为测定合成替格瑞洛中间体1中剩余sm2含量的高效液相色谱图。图4为线性回归方程图。具体实施方式以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例1合成替格瑞洛中间体1中剩余sm2含量测定1、仪器与条件仪器：高效液相色谱仪shimadzu20a(shimadzu)；色谱工作站：lcsolution；检测器：蒸发光散射检测器；色谱柱：以硅胶为基质，键合烷基酰胺基填料的色谱柱(glsciencesinertsilamide4.6×250mm，5μm)；流动相(v:v)：0.02mol/l醋酸铵溶液(含体积含量为0.15％的三氟乙酸)：乙腈＝30：70；稀释剂(v:v)：乙腈：水＝70:30柱温：30℃；柱流速：1.0ml/min；进样量：30μl；检测器(elsd)：漂移管温度：90℃；气体流速：2.5ml/min；撞击器(impact)：on。2、实验步骤(1)对照品贮备溶液：取sm2对照品约21.2mg，精密称定，置25ml量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(以游离态的sm2计*，浓度约为500μg/ml)。(注*：1gsm2中含游离态的理论质量数为0.59g。)(2)对照品线性溶液：取对照品贮备溶液适量，用稀释剂定量稀释制成浓度(以sm2游离态计)线性梯度的一组溶液，摇匀，即得。所得对照品线性溶液中sm2的浓度分别为20.28μg/ml、50.69μg/ml、101.39μg/ml、202.77μg/ml。(3)供试品溶液：合成替格瑞洛中间体1的反应液适量，加稀释剂溶解并按体积稀释至一定倍数n(如80倍、40倍)，摇匀，滤过，即得(要求：配制所得供试品溶液中游离态sm2峰面积必须在对照品线性范围之内)。(4)分别取对照品线性溶液、供试品溶液、溶剂(乙腈：水＝70:30)，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1-3。3、检测结果取对照品线性溶液30μl进样，记录色谱图，以对数浓度(lgx)对对数峰面积(lgy)进行线性回归，对应数值见表1。计算得到线性方程lgy＝1.5967lgx-2.2098和相关系数r＝0.9999，其线性方程图见图4。表1浓度x与峰面积y及其对数对应值sm2对照品浓度x(μg/ml)20.4851.19102.38204.75lgx1.31131.70922.01022.3112sm2对照品测定峰面积y0.7693.22810.33729.829lgy-0.11410.50891.01441.4746取供试品溶液30μl进样，记录色谱图，将测得的游离态sm2的峰面积(y’)代入上述线性方程，求得供试品溶液中游离态sm2的浓度(x’)，再根据反应液稀释倍数及投料比，求得反应液中sm2残余量(以游离态计，％)，结果见表2。计算公式如下：式中：p——反应液中游离态sm2残余量(以游离态计)，％；x——供试品溶液中游离态sm2的浓度，μg/ml；n——反应液稀释倍数；v——反应液总体积，ml；m——游离态sm2的实际投料量，g；0.59——1g游离态sm2中含游离态的理论质量数为0.59g。表2图3所示样品中sm2残余量结果批号sm2残余量014.0％022.5％可知，批号01和02的样品中替格瑞洛中间体1的合成反应程度分别为96％和97.5％。本发明提供的方法能通过得到的线性方程快速准确的测定出合成替格瑞洛中间体1的合成反应程度，方便对合成替格瑞洛中间体1的反应进程进行监控。对于实现替格瑞洛的工艺收率提高，质量控制及安全性保证具有极其重要的意义。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12