阪崎肠杆菌胶体金试纸条的制备方法及应用与流程

本发明涉及一种胶体金试纸条的制备方法及应用。

背景技术：

阪崎肠杆菌(c.sakazakii)是一种广泛存在于自然界中，感染后会引发新生儿脑膜炎、败血症、菌血症、坏死性小肠结肠炎以及神经系统后遗症的革兰氏阴性细菌。其繁殖能力及对环境因素的抗逆性非常强，婴儿感染后死亡率高达20％-50％。c.sakazakii的快速检测对控制阪崎肠杆菌危害具有重要意义。

传统检测方法不仅步骤繁琐、检测周期长，而且检测结果不稳定，不能真正起到对致病菌的监测和控制作用。分子生物学检测方法易受试剂和环境影响较大，检测费用相对昂贵；而且在检测过程中仍然需要增菌培养，与免疫学检测方法相比没有速度上的优势。

技术实现要素：

本发明是要解决现有阪崎肠杆菌检测方法检测周期长，而且检测结果不稳定的问题，提供阪崎肠杆菌多克隆抗体的制备方法及应用。

本发明阪崎肠杆菌胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：

一、阪崎肠杆菌抗原的制备；

二、抗血清的制备；

三、通过辛酸-硫酸铵方法对制备的抗血清进行纯化；

四、多克隆抗体的特异性检测；

五、多克隆抗体的二次纯化；

六、胶体金的制备与阪崎肠杆菌多克隆抗体的标记

七、胶体金试纸条的组装

进一步的，步骤一中阪崎肠杆菌抗原为阪崎肠杆菌菌体抗原。

阪崎肠杆菌菌体抗原的制备方法为：

将阪崎肠杆菌活化接种于lb固体培养基，37℃恒温培养24h，挑取单菌落接种到5mllb液体培养基，于37℃，180r/min摇床培养12h，再按1％的接种量扩大培养接种至3l的lb液体培养基中，37℃，180r/min摇床培养24h，得到菌体培养液；其中所述阪崎肠杆菌为购买得到，菌株编号为atcc29544。

5000r/min离心菌体培养液10min，收集菌体，用0.01mol/lph7.4pbs缓冲溶液洗涤3次后，将沉淀用5ml的0.01mol/lph7.4pbs缓冲溶液重悬，加入15μl福尔马林溶液，室温下放置18h，然后于4℃，5000r/min离心10min，将沉淀用0.01mol/lph7.4pbs缓冲溶液洗涤3次后，用0.01mol/lph7.4pbs缓冲溶液重悬，-20℃保存备用。

进一步的，步骤五中利用杂菌抗原反向吸附法二次纯化多克隆抗体。

进一步的，步骤五中用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金颗粒。其中胶体金颗粒的平均直径为30nm。

上述方法制备的阪崎肠杆菌胶体金试纸条在奶粉样品检测中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过免疫清洁级大白兔，制备抗c.sakazakii多克隆抗体。对所得到的抗体行纯化，并通过胶体金标记抗体的形式研制c.sakazakii胶体金免疫层析检测试纸条，并对其进行特异性、灵敏度、保质期进行评价，以期为c.sakazakii的快速检测提供依据。

通过辛酸-硫酸铵法所得到的抗血清进行纯化，得到较纯的抗体。经抗原反向吸附后，有效消除多克隆抗体与s.typhimurium之间交叉反应，所制备的高免兔抗c.sakazakii多克隆抗体纯度较高，特异性良好。

选用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。制备出直径为30nm的胶体金溶液，该溶液澄清、透明，呈红色，适合阪崎肠杆菌抗体标记。

本发明调整柠檬酸三钠浓度，制备30nm胶体金颗粒，利于阪崎肠杆菌多克隆抗体标记，可裸露阪崎肠杆菌多克隆抗体多个表位，应答被测阪崎肠杆菌，灵敏度更佳，标记后的样品不易沉淀，抗体浓度均匀，与抗原结合速度快、灵敏。

通过c.sakazakii、s.aureus、s.typhimurium、s.flexneri、l.monocytogenes、e.coli几株菌的稀释液来检测试纸条特异性，得出所制备的试纸条与c.sakazakii呈阳性反应，与其他几株菌均呈阴性反应，特异性良好。制备的试纸条的检出限为10⁵cfu/ml。检测结果稳定，能够快速获得检测结果。

通过加速试验来确定胶体金试纸条的保质期，依据试纸条在37℃保存1d，相当于常温保存一个月，判定试纸条常温保质期约为10个月。

附图说明

图1为菌体抗原免疫生多抗免疫应答曲线；

图2为破碎抗原免疫生多抗免疫应答曲线；

图3为菌体抗原免疫产生多抗血清效价曲线；

图4为破碎抗原免疫产生多抗血清效价曲线；

图5为纯化后的c.sakazakii多克隆抗体sds-page电泳图；

图6为辛酸-硫酸铵纯化后抗体经斑点杂交法分析多克隆抗体特异性；

图7为抗原反向吸附法处理后的多克隆抗体经斑点杂交法分析多克隆抗体特异性；

图8为柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金溶液；

图9为胶体金溶液紫外扫描图；

图10为胶体金透射电镜图；

图11为验证金标抗体溶液稳定性；

图12为胶体金免疫层析试纸条结构示意图；

图13为阪崎肠杆菌试纸条特异性试验；

图14为阪崎肠杆菌试纸条检出限试验；

图15为阪崎肠杆菌试纸条检测食品模拟样品；

图16为37℃加速保藏试验确定试纸条保质期。

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

试验一、制备兔抗c.sakazakii多克隆抗体

选用c.sakazakii全菌免疫原和c.sakazakii菌体破碎免疫原分别免疫清洁级大白兔制备兔抗c.sakazakii多克隆抗体。通过辛酸-硫酸铵法对所制备抗血清纯化，并通过sds-page电泳对所纯化结果进行分析。通过elisa法检测所制备多克隆抗体效价。通过斑点杂交法和杂菌抗原反向吸附法检测所制备多克隆抗体特异性。

(一)c.sakazakii免疫原制备

将c.sakazakii活化接种于lb琼脂培养基，37℃恒温培养24h，挑取单菌落接种到5mllb液体培养基，37℃，180r/min摇床培养12h，按1％接种比例扩大培养接种至3l的lb液体培养基中，37℃，180r/min摇床培养24h。其中c.sakazakii为购买得到，菌株编号为atcc29544。

菌体抗原(wholecellantigen,wcag)制备：取1mlc.sakazakii培养液，涂布到lb琼脂平板中，进行平板计数。5000r/min离心剩余菌体培养液10min，收集菌体。用0.01mol/lph7.4pbs缓冲溶液洗涤3次后，将沉淀用5ml的0.01mol/lph7.4pbs缓冲溶液重悬，加入15μl福尔马林溶液，室温下放置18h。4℃，5000r/min离心10min，将沉淀用0.01mol/lph7.4pbs缓冲溶液洗涤3次后，用0.01mol/lph7.4pbs缓冲溶液重悬，-20℃保存备用。

菌体破碎细胞抗原(celldebrisantigen,cdag)制备：将c.sakazakii培养液5000r/min离心10min，收集菌体。将沉淀用0.01mol/lph7.4pbs缓冲溶液洗涤3次后，5000r/min离心10min，将沉淀用20ml0.01mol/lph7.4pbs缓冲溶液重悬，超声破碎仪超声破碎(工作时间3s，间歇时间6s，工作40次，200hz，总工作时间6min)，4℃，5000r/min离心10min，0.01mol/lph7.4pbs缓冲溶液洗涤沉淀3次后，收集沉淀即为菌体细胞破碎抗原，-20℃保存备用。

(二)c.sakazakii多克隆抗体制备

首免一周前，动物免疫前耳缘静脉取血作为阴性对照血清，而后足底免疫注射卡介苗，500μl/只。第一次免疫，免疫原与等量福氏完全佐剂混合，充分乳化后皮下四点注射；第二、三、四次免疫，免疫原与等量的福氏不完全佐剂混合，充分乳化后皮下四点注射免疫，总免疫体积控制在1ml/只左右。每次免疫后第7d和14d耳缘静脉取血，测量效价。免疫结束后心脏取血，收集抗血清。

表1菌体破碎抗原免疫方案

(三)c.sakazakii多克隆抗体纯化

通过辛酸-硫酸铵方法对制备的兔抗血清进行纯化。在偏酸条件下正辛酸可以沉淀血清中其他蛋白质，使上清中不含有除igg外其他蛋白质。而硫酸铵是一种中性盐，具有溶解度高且受温度影响最小的优点，加入硫酸铵后抗体表面电荷被大量中和，从而降低蛋白溶解度，使抗体分子聚集沉淀。

取1ml抗血清，4℃，10000r/min离心5min，吸取上清液；用0.06mol/lph5.0的hac-naac缓冲液稀释2倍，用1mol/l的hcl调整ph至4.5。置于4℃不断搅拌，按照60μl正辛酸/1ml血清的比例逐滴加入正辛酸，持续搅拌0.5h后静置2h；4℃，10000r/min离心30min，取上清；向上清中加入1/10上清体积的0.1mol/lph7.4的pbs，用1mol/l的naoh调节ph至7.4；4℃下不断搅拌，逐滴加入等体积的ph7.4的硫酸铵，4℃静置过夜。4℃，10000r/min离心30min，弃上清，将沉淀用0.1mol/lph7.4pbs重悬，在4℃下透析除盐3d，每隔12h更换一次透析液。peg20000浓缩后吸取透析袋内溶液，即为所得抗体。

并对所得抗体进行紫外分光光度测定，测定a280nm值和a260nm值，计算igg含量，计算公式为：

igg含量＝1.45×a280nm－0.74×a260nm

(四)sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳

生物大分子尤其是蛋白质具有不同的电荷和分子质量，sds-page根据蛋白相对分子质量亚基的不同而分离蛋白。sds作为变性剂和助溶试剂，断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子结构；二硫苏糖醇作为强还原剂使半胱残基间二硫键断裂，蛋白质被解聚成多肽链，在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同的蛋白质按照分子质量的大小进行分布。

(五)c.sakazakii多克隆抗体效价测定

采用间接elisa方法测定多克隆抗体效价，这是一种最常使用且灵敏可靠的检测方法，可以通过颜色深浅判断有无抗体或抗原的存在及量的多少。基本步骤如下：

(1)包被以c.sakazakii作为抗原，按照100μl/孔的包被浓度加入聚苯乙烯96孔反应板的每个小孔中，37℃放置孵育1h。

(2)洗涤倾倒小孔内的液体，用320μl/孔pbst洗涤液反复清洗3次，尽量拍干聚苯乙烯96孔反应板。

(3)封闭为防止非特异性结合，每个小孔中加l00μlbsa封闭液以封闭孔壁上的空隙，37℃放置1h。

(4)洗涤倾倒小孔内的液体，用320μl/孔pbst洗涤液反复清洗3次，尽量拍干聚苯乙烯96孔反应板。

(5)加入抗血清将抗血清用0.1mol/lph7.4的pbs连续倍比稀释，按照100μl/孔加到已包被的板上，37℃放置孵育1h。

(6)洗涤倾倒小孔内的液体，用320μl/孔pbst洗涤液反复清洗3次，尽量拍干聚苯乙烯96孔反应板。

(7)加酶标抗体按照100μl/孔加入羊抗兔igg-hrp，37℃放置孵育30min。

(8)洗涤倾倒小孔内的液体，用320μl/孔pbst洗涤液反复清洗5次，尽量拍干聚苯乙烯96孔反应板。

(9)显色按照100μl/孔加入新鲜配制的tmb底物溶液，37℃避光15min。

(10)终止反应、比色按照50μl/孔加入h2so4终止液终止反应，颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔吸光值，阳性反应的最大稀释度判断为待测样品效价。

(六)c.sakazakii多克隆抗体特异性测定

通过斑点杂交法检测兔抗血清特异性，具体操作步骤如下：

(1)将c.sakazakii、staphylococcusaureus、salmonellatyphimurium、shigellaflexneri、escherichiacoli、listeriamonocytogenes活化接种于lb培养基中，37℃振荡培养24h。5000r离心10min收集菌体，用0.1mol/lph7.4pbs洗涤三次并重悬，将菌液浓度调整为10⁸cfu/ml。

其中s.aureus、s.typhimurium、s.flexneri、e.coli、l.monocytogenes均为购买得到，s.aureus的菌株编号为atcc25923，s.typhimurium的菌株编号为atcc14028，s.flexneri的菌株编号为atcc29931，e.coli的菌株编号为atcc25922，l.monocytogenes的菌株编号为atcc19114。

(2)将pvdf膜用铅笔划分为多个小格后，浸泡于盛有甲醇的平皿中活化30s。活化后立即取出，用0.1mol/lph7.4pbs浸泡15min。

(3)用滤纸吸干pbs溶液，在已划分好的小格中央分别点各菌液2μl，室温下阴干，用0.1mol/lph7.4pbs洗涤三次。

(4)将膜在5％的脱脂乳溶液中浸泡，37℃水平摇床封闭1h后，弃去封闭液，用0.1mol/lph7.4pbs洗涤三次。

(5)在每个小格中央分别加入2μl兔抗血清，37℃水平摇床反应1h后，用0.1mol/lph7.4pbs洗涤三次。

(6)向平皿中加入10ml稀释5000倍的hrp-igg，37℃水平摇床反应1h，用0.1mol/lph7.4pbs洗涤三次。

(7)将pvdf膜浸泡在新鲜配制的dab显色液中显色，置于37℃避光显色10min，用0.1mol/lph7.4pbs洗涤三次，室温风干观察结果。

(七)杂菌抗原反向吸附法纯化多克隆抗体

取一定量杂菌抗原于离心管中，4℃，12000r/min离心5min，弃上清液，将沉淀用0.1mol/lph7.4pbs重悬，混合均匀。4℃，12000r/min离心5min，并用0.1mol/lph7.4pbs反复清洗3次。重悬清洗好的抗原，转移到新的离心管中，加入兔抗c.sakazakii多克隆抗体，混合均匀，37℃，150r/min孵育1h。4℃，12000r/min离心10min，弃去抗原抗体复合物沉淀，上清液即为杂菌抗原反向吸附法纯化所得抗体，将纯化后的多克隆抗体与杂菌再次进行斑点杂交法检测。

试验结果：

本试验选用c.sakazakii菌体抗原和c.sakazakii菌体破碎细胞抗原分别免疫清洁级大白兔，通过间接elisa法监测抗血清效价，并绘制效价曲线及免疫应答曲线，如图1、2所示。菌体抗原免疫得到血清效价一直以平稳趋势上升，菌体破碎细胞抗原免疫得到血清效价前期增长缓慢，从第4周开始明显上升，两组试验兔抗血清效价均在第7周开始无明显上升且效价较高，故心脏取血，收集血清。

由图3可知(图3中曲线1为抗血清，曲线2为空白血清)，菌体抗原免疫得到的血清终效价约为256000；由图4可知(图4中曲线1为抗血清，曲线2为空白血清)，菌体破碎细胞抗原免疫得到的血清终效价约为64000。结果表明，菌体抗原免疫得到的抗血清终效价明显高于菌体破碎细胞免疫得到的抗血清终效价。

本试验选用辛酸-硫酸铵法纯化c.sakazakii全菌免疫原免疫制备的抗血清，sds-page分析纯化后的多克隆抗体，如图5所示。结果表明辛酸-硫酸铵法纯化后，得到较纯的条带，达到纯化igg的目的。而igg经过巯基乙醇解链为重链和轻链，分子质量分别在55kd和25kd左右。

由于蛋白质分子中的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基所带的苯环具有紫外吸收的性质，而且在其280nm波长吸收峰处，溶液的蛋白含量与其光吸收值成正比例关系，所以利用紫外吸收法对蛋白质进行定量测量。先通过紫外分光光度测定纯化后的抗体的a280值和a260值，代入公式，得到igg含量为2mg/ml。

将纯化后的兔抗c.sakazakii多克隆抗体与s.aureus、s.typhimurium、s.flexneri、l.monocytogenes、e.coli进行斑点杂交，以检测所制备抗体特异性，如图6所示。结果表明所制备兔抗c.sakazakii多克隆抗体与s.aureus、s.typhimurium、e.coli、s.flexneri、l.monocytogenes没有交叉反应，与s.typhimurium有轻微交叉反应。图6中a1,a2:c.sakazakii；b1,b2:e.coli；c1,c2:s.flexneri；d1,d2:l.monocytogenes；e1,e2:s.aureus。

利用杂菌抗原反向吸附法，对多克隆抗体进行进一步纯化，将纯化后的多克隆抗体与s.typhimurium再次进行斑点杂交，如图7所示。结果表明杂菌抗原反向吸附法可以有效消除多克隆抗体与s.typhimurium之间交叉反应，所制备的兔抗c.sakazakii多克隆抗体与其他菌株没有交叉反应。所制备抗体与s.typhimurium有交叉反应原因可能是s.typhimurium抗原结构复杂易与革兰氏阴性细菌抗血清有交叉反应，且s.typhimurium是肠道杆菌，与肠道菌群存在共同抗原表位，共同抗原决定簇刺激机体产生抗体与共同抗原发生结合反应，产生交叉反应。图7中a1-5:c.sakazakii；f1-5:s.typhimurium。

试验二、建立胶体金免疫层析方法

选用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金溶液，通过肉眼判断、紫外扫描光谱和透射电镜分析判断胶体金质量。通过肉眼判断和a580探索胶体金标记兔抗c.sakazakii多克隆抗体时的最佳ph值和最佳蛋白标记量。通过探索最佳复溶液组合及低温超速离心法制备稳定的金标抗体溶液。并对胶体金免疫层析试纸条的t线和c线最佳抗体包被浓度进行探索，为胶体金免疫层析试纸条制备奠定基础。

(一)胶体金制备

选用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。于泡过铬酸洗液的250ml三角瓶中加入99mlddh2o，磁力搅拌加热。待有细小气泡冒出加入1ml1％haucl4溶液。待到液面有大量气泡冒出时，立即向其中加入1.2ml1％柠檬酸三钠溶液，继续磁力搅拌。溶液的颜色由浅黄、灰色、深灰色、蓝色、深蓝色、酒红色、红色依次变化，直至完全变为透亮红色，关闭加热，冷却平衡至室温，4℃保存备用。

(二)胶体金质量分析

金标免疫快速试验的成功与否取决于胶体金质量，而胶体金颗粒均一性则是金标免疫快速试验的重中之重。如果金颗粒形状不规则，结合的蛋白就不稳定容易解离，进而导致本底过高现象和假阴性结果；如果金颗粒直径变异范围太大就会影响到试验稳定性和重复性。胶体金质量不好，在免疫层析试验中胶体金结合物就不能快速完整的从玻璃纤维上解离，从而影响试验质量。

本试验选择冷却透亮红色的胶体金溶液，通过紫外可见分光光度计检测在可见光400-700nm范围内连续光谱吸光度，确定最大吸光峰的波长。通过透射电镜观察胶体金颗粒的形状及粒度分布、均匀度及分散度。根据透射电镜放大倍数及照片中胶体金颗粒的直径估算胶体金平均直径。

(三)金标抗体制备

取1ml胶体金溶液于1.5ml离心管内，加入0.2mk2co3溶液3μl，充分混匀后静置30min。缓慢加入10μg所制备的兔抗c.sakazakii多克隆抗体，充分混匀后静置30min。加入终浓度1％的bsa进行封闭，充分混匀后静置30min。4℃，12000r/min，离心30min，弃上清，将沉淀用100μl胶体金复溶液重悬。

(四)胶体金免疫层析条件

标记ph值为9.5；蛋白标记量：每1ml胶体金溶液添加10μg抗体；离心条件：4℃，12000r/min，30min；复溶液组合为tris-cl+bsa+蔗糖+海藻糖；选择t线的抗体包被浓度为1mg/ml；选择c线的抗体包被浓度为1mg/ml。

试验结果：

选用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金，如图8所示，通过肉眼观察所制备的胶体金溶液均一透明，内无肉眼可见杂质，颜色鲜艳，呈亮红色，初步判定适合用于标记多克隆抗体。

通过紫外可见分光光度计在400-700nm可见光范围内对胶体金标记抗体之后所形成的金标抗体溶液进行光谱扫描，如图9所示(图9中实线表示胶体金光谱扫描，虚线表示金标抗体光谱扫描)，所形成光谱扫描图与胶体金溶液光谱扫描图整体走向和趋势无明显差异和波动，依旧是单一吸收峰，在530.8nm处有最大吸收峰，od值为0.9196；在449.8nm处有最小吸收峰，od值为0.5103。结果表明，胶体金与抗体之间结合比较稳定。

通过透射电镜观察胶体金颗粒的形状及粒度分布、均匀度及分散度，如图10所示，胶体金颗粒呈圆形分布，粒子大小及分布均匀，且根据透射电镜初步估算胶体金颗粒平均直径为30nm。

所制备的金标抗体效果最好，复溶后金标抗体溶液澄清无肉眼可见颗粒，且沉淀无挂壁出现。将重悬后的金标抗体，点于胶体金垫上，分别检测c.sakazakii菌液、pbs、lb，观察其显色情况，如图11所示(其中1为cronobactersakzakii；2为lb；3为pbs)，1号t线和c线都出现不同程度显色，2号和3号c线出现显色，t线不显色。表明复溶液比例和封闭效果较好。

试验三、制备胶体金免疫层试纸条

组装胶体金免疫层析试纸条，并对所制备试纸条进行评价。通过c.sakazakii、s.aureus、s.typhimurium、s.flexneri、e.coli、l.monocytogenes几株菌的稀释液检测试纸条的特异性。通过将c.sakazakii菌液10倍倍比稀释检测试纸条的检出限。并将所制备的试纸条应用于接种c.sakazakii、s.aureus、s.typhimurium、s.flexneri、e.coli、l.monocytogenes的婴幼儿配方粉检测试纸条应用于食品样品时的特异性。最后通过加速试验确定所制备试纸条的保质期。

(一)试纸条组装

胶体金免疫层析试纸条主要由四部分组成：样品垫(samplepad)、结合垫(conjugatepad)、硝酸纤维素膜(ncmembrane)、吸水垫(absorbentpad)。胶体金免疫层析试纸条结构示意图如图12，其中1为样品垫，2为结合垫，3为检测线，4为质控线，5为硝酸纤维素膜，6为pvc底板。

其中结合垫与吸水垫分别与硝酸纤维素膜的两端相连，样品垫与结合垫另一端相连。这四部分彼此部分重叠，硝酸纤维素膜上喷涂有检测线(t)和质控线(c)，形成完整试纸条体系。当样品加入样品垫后在毛细扩散作用下在层析条上向前泳动，当泳动至结合垫时，如样品中含有待检物质，则发生第一步高度特异性的免疫反应，形成的免疫复合物继续泳动至线状包被区时，发生第二步高度特异性的免疫反应，形成的免疫复合物被截留在包被的线状区，通过标记的胶体金而显示红色条带，第二条线是控制线，由余下的游离标记物形成于膜上，代表测试完成。

(二)胶体金免疫层析试纸条特异性检测

将c.sakazakii菌株及s.aureus、s.typhimurium、s.flexneri、l.monocytogenes、e.coli菌株分别培养，并用0.01mol/lpbs缓冲溶液将菌液浓度稀释至10⁸cfu/ml，分别取100μl加入试纸条中，15min后读取结果。

(三)胶体金免疫层析试纸条检出限检测

将c.sakazakii菌液用0.01mol/lpbs缓冲溶液10倍倍比稀释，分别稀释至浓度为10⁸cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml、10cfu/ml，分别取各浓度菌液100μl加入制备的胶体金免疫层析试纸条中，15min后读取结果。

(四)胶体金免疫层析试纸条应用于食品样品检测

取1g市售婴幼儿配方粉溶解于5ml无菌水中，分别接种c.sakazakii、s.aureus、s.typhimurium、s.flexneri、l.monocytogenes、e.coli，经过12h增菌，紫外分管光度计分别测量其od600值，用无菌水调整各菌液浓度，然后用制备好的胶体金免疫层析试纸条对其进行检测。

表2模拟食品样品列表

(五)胶体金免疫层析试纸条保质期确定

本试验通过加速试验来确定所制备胶体金免疫层析试纸条的保质期。依据试纸条在37℃保存1d，相当于常温保存一个月来确定。将试纸条置于37℃保存，在第7d、第8d、第9d、第10d、第11d分别取试纸条对浓度为10⁴cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁸cfu/ml的c.sakazakii稀释液进行检测，通过判断胶体金免疫层析试纸条c线和t线的显色情况判断试纸条的保质期。

试验结果：

本试验通过分别将c.sakazakii、s.aureus、s.typhimurium、s.flexneri、e.coli、l.monocytogenes稀释液滴加到试纸条来检测试纸条特异性，如图13所示。由图可知，检测c.sakazakii时c线显色，t线显色；检测s.aureus、s.typhimurium、s.flexneri、l.monocytogenes、e.coli时试纸条的c线显色，t线不显色。所制备试纸条与c.sakazakii呈阳性反应，与其他几株菌均呈阴性反应，试纸条特异性良好。

本试验通过将c.sakazakii菌液用0.01mol/lpbs溶液分别10倍倍比稀释至10⁸cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml、10cfu/ml，将几组稀释液分别滴加到所制备的试纸条，来检测试纸条检出限，如图14所示。

由图可知，所制备试纸条检测10⁸cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml时c线、t线都有明显显色，呈阳性反应。检测10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml、10cfu/ml时试纸条c线显色，t线不显色。因此，判定本试验研究的试纸条检出限为10⁵cfu/ml。

本试验分别将c.sakazakii、s.aureus、s.typhimurium、s.flexneri、l.monocytogenes、e.coli接种市售婴幼儿配方粉，并进行增菌，用制备的胶体金免疫层析试纸条进行检测，结果如图15所示。其中1为c.sakazakii；2为s.aureus；3为s.typhimurium；4为s.flexneri；5为l.monocytogenes；6为e.coli。由图可知，检测接种c.sakazakii的婴幼儿配方粉时，试纸条c线和t线都明显显色，显示阳性；而检测接种其他菌的婴幼儿配方粉时，t线都不显色，显示阴性。因此，所制备试纸条对食品样品进行检测，特异性良好。

本试验通过将试纸条置于37℃保存，依据试纸条在37℃保存1d，相当于常温保存一个月，通过加速试验来确定胶体金试纸条保质期，如图16所示。可知将试纸条置于37℃保存7d，t线和c线显色正常；置于37℃保存10d，t线和c线显色情况有微弱下降，但不影响试纸条质量；置于37℃保存11d，t线和c线显色情况下降，且10⁶cfu/ml组试纸条t线不显色。因此判定试纸条常温保质期约为10个月。