技术领域：
：本发明属于食品快速检测领域，涉及到一种利用长波长别藻蓝蛋白荧光检测抗氧化能力的方法。
背景技术：
：：orac是氧化自由基吸收能力(oxygenradicalabsorbancecapacity)的缩写，氧化自由基吸收能力又称为抗氧化能力。orac分析方法是根据自由基破坏荧光探针，使荧光强度产生变化原理，以维生素e水溶性类似物trolox(dro-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid)为定量标准，使用荧光微孔板分析仪进行分析。荧光强度的变化大小反映自由基破坏的程度。在抗氧化剂存在时，其可以抑制由自由基引起的荧光变化。抑制程度反映了其对自由基的抗氧化能力。b-藻红蛋白在早期研究中被使用作为荧光指示剂，虽然其具有水溶性好，荧光强度大和对氧自由基灵敏度高等优点，但是由于其具有光敏性，在光照下会很快自发消退，使其难以进行定量计算。后来人们在实验中还发现，b-藻红蛋白会以疏水或氢键作用。与天然界中的一大类抗氧化物质——多酚类非特异性结合，而且对不同物质不同量表现不同的亲和力，所以现在不常使用。荧光素由于其高稳定性和价格低廉，是迄今为止最常用的方法，然而该荧光指示剂发光波长落于中短波长范围内，受到在400-550nm范围内来自样品基质的静态背景信号的影响，导致最终的测定结果不准确。而使用长波长的荧光指示剂可以有效的解决这一问题。在orac分析方法中，自由基来源主要为偶氮类化合物2,2'-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride(aaph)热分解产生的过氧自由基，产生的自由基可以与荧光指示剂反应形成荧光猝灭。采用抗氧化剂作用下的荧光衰退曲线下面积(areaunderthecurve，auc)与荧光自然衰退曲线下面积的差，即auc净＝auc样品-auc空白,作为衡量抗氧化剂的抗氧化能力指标，将结果以抗氧化物质trolox作为标准进行表达，由此来反映样品的抗氧化能力。本方法选择的别藻蓝蛋白(apc)是一种深蓝色粉末。别藻蓝蛋白属于长波长荧光指示剂，其激发波长为653nm，发射波长为668nm，可以避开实际样品中自发荧光物质的干扰；具有高的ph稳定性；对内外猝灭不敏感。以上优点很大程度上提高了检测灵敏度。技术实现要素：：本发明针对荧光素发光波长落于中短波长范围内，可能会受到来自样品基质的静态背景信号影响的问题，提供一种检测结果稳定，准确率高，精密性好，检测范围宽，适用于快速检测酒水或果汁抗氧化能力的方法。为了实现上述目的，本发明提出了一种利用别藻蓝蛋白这一长波长且具有更强荧光强度的物质作为荧光指示剂来检测抗氧化能力的方法，其特征在于，具体步骤为：(1)配制ph＝7.0的pbs缓冲液，144nm别藻蓝蛋白溶液，128nmaaph溶液，100μmtrolox溶液和实际样品溶液。(2)在96孔酶标板中依次加入适量磷酸缓冲液，apc溶液和trolox溶液或待测样品，在37℃条件下静置15分钟，随后立即加入aaph溶液。将酶标板立即放入多功能读板器并开始检测。(3)导出数据并对数据进行归一化处理，将数据输出至origin软件计算得到荧光衰减曲线下面积(auc净)。附图说明图1为检测的别藻蓝蛋白荧光检测抗氧化能力的示意图图2为本发明荧光指示剂在不同浓度的维生素e的体系中荧光强度随时间衰退曲线以及标准曲线具体实施方式：为了能够更清楚的理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一步说明。(1)pbs缓冲液(ph＝7.0)的制备称取3.1202g磷酸二氢钠和7.1628g十二水合磷酸氢二钠定容至100ml配制而成。将其放置于4℃冰箱中保存。(2)别藻蓝蛋白(apc)溶液的制备量取10μlapc(10mg/ml)溶于500μl缓冲液中，浓度为144nm，将其用锡箔覆盖置于4℃冰箱中保存。(3)aaph储备液的制备称取0.174gaaph溶于5ml缓冲液中，浓度为128nm，将其用锡箔覆盖置于4℃冰箱中保存。(4)trolox储备液的制备量取5.26μl维生素e溶液(800mg/ml)溶于100ml无水乙醇中，浓度为100μm，将其用锡箔覆盖置于4℃冰箱中保存。(5)实际样品的制备使用缓冲液将样品进行稀释溶解，在14000r/min的条件下离心15分钟。取上清液部分，用锡箔覆盖置于4℃冰箱中保存。(6)标准曲线的建立和实际样本的检测实验在96孔酶标板中进行，依次加入适量磷酸缓冲液，apc溶液和trolox溶液或待测样品，在37℃条件下静置15分钟，随后立即加入aaph溶液。将酶标板立即放入多功能读板器并开始检测。每次读数之前，酶标板自动摇动。每5分钟记录一次荧光，持续2小时。所有样品和标准曲线重复进行三次独立测定。(7)数据处理导出数据并对数据进行归一化处理，将数据输出至origin软件计算得到荧光衰减曲线下面积(auc净)。并通过整合auc数据得到标准曲线。利用标准曲线计算得到样品抗氧化能力的trolox当量值。(8)性能分析检测范围本方法标准曲线的线性范围是0.75-10.0μm，决定系数(r2)为0.993。如要准确的确定样品中抗氧化能力的trolox当量值，trolox当量值应不超过0.75-10.0μm的范围，超出此范围的测定结果是通过标准曲线外延得出的计算结果。精密度的检测实例1向96孔酶标板其中一孔依次加入150μlpbs缓冲液，15μl144nmapc溶液，15μl干红葡萄酒稀释液(稀释1500倍)，在37℃条件下静置15分钟，随后立即加入20μlaaph溶液。将酶标板立即放入多功能读板器并开始检测。每次读数之前，酶标板自动摇动。每5分钟记录一次荧光，持续2小时。同时进行三次平行测定。实例2向96孔酶标板其中一孔依次加入150μlpbs缓冲液，15μl144nmapc溶液，15μl葡萄汁稀释液(稀释1000倍)，在37℃条件下静置15分钟，随后立即加入20μlaaph溶液。将酶标板立即放入多功能读板器并开始检测。每次读数之前，酶标板自动摇动。每5分钟记录一次荧光，持续2小时。同时进行三次平行测定。样品orac-apcaorac-fla白酒1.45±0.071.14±0.11干红葡萄酒17.72±0.7011.9±0.78白葡萄酒1.92±0.321.24±0.24黄酒7.35±0.796.12±0.27橙汁5.44±0.684.98±0.09葡萄汁8.76±0.917.48±0.14当前第1页12