本发明涉及血清ca2蛋白在制备肝癌诊断或预后评估试剂盒中的应用及试剂盒。
(二)
背景技术：
肝癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，其恶性程度高、预后差、发病率呈逐年上升趋势。我国是肝癌高发区，据最新中国癌症统计显示，我国肝癌的新增病例和死亡人数均居世界首位，严重威胁人们的健康和生命。目前以手术切除为主的综合治疗，仍然是肝癌治疗的主要模式和最有效手段，然而肝癌术后极易转移复发，术后1年内的复发转移率高达20％-30％，5年内的复发转移率更是高达50％-70％。因此肝癌易转复发移的生物学特性是目前进一步提高肝癌治疗效果、降低肝癌死亡率、提高肝癌远期生存率的瓶颈问题。若能在hcc复发转移前，及早预测、诊断并及时采取积极有效的措施进行防治，对进一步提高肝癌的治疗效果，将具有重要意义。
碳酸酐酶ii(carbonicanhydraseii，ca2)是酸酐酶家族中活性最强的一员，参与机体气体运输、酸碱调节和组织的分泌等功能，在维持内环境的稳定方面发挥重要作用。由于ca2能高效催化co2的水合反应，生成h+和hco3-，hco3-与细胞内cl-交换来维持细胞内碱性环境，细胞内h+通过h+-na+离子泵方式运输到细胞外，将细胞外变为酸性环境。因此，ca2有可能是通过可逆性催化co2和hco3-的相互转化，参与细胞外微环境的酸化。这表明ca2能通过调节肿瘤细胞微环境的ph影响肿瘤的发生；而胞外微环境的低ph则一般被认为是肿瘤富于侵袭性和预后差的一种标志，因此ca2表达水平的改变对肿瘤发生及其生物学行为有重要影响。
(三)
技术实现要素：
本发明目的是对ca2能否作为肝癌诊断和预后标志物进行研究，提供血清ca2蛋白在制备肝癌诊断或预后评估试剂盒中的应用及试剂盒。
本发明采用的技术方案是：
血清ca2(carbonicanhydraseii)蛋白在制备肝癌诊断或预后评估试剂盒中的应用。
本发明还涉及一种肝癌诊断或预后评估试剂盒，所述试剂盒以血清ca2蛋白的特征肽段为检测标志物，主要包括：根据血清ca2蛋白的特征肽段合成的重标肽段(重标精氨酸或赖氨酸13c，15n)、检测试剂以及ca2蛋白的elisa试剂盒。
具体的，所述血清ca2蛋白的特征肽段序列为：ggpldgtyr或sadftnfdpr。
所述检测试剂为本领域质谱检测中的常用试剂，包括pbs(ph7.4)、胰酶(测序级)、碳酸氢铵(500mm)、水(质谱级)、乙腈(色谱级)、甲酸。
所述ca2蛋白的elisa试剂盒可自行制备，也可采用市购商品。
本发明利用itraq(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，itraq)结合ms/ms技术检测肝癌病人癌组织、癌旁组织和远癌组织分泌蛋白和利用itraq结合ms/ms技术检测肝癌病人术后复发前随访血清，共同发现生物标志物ca2。其在肝癌组织和癌旁组织中的分泌量明显高于远癌组织，且肝癌组织的分泌显著高于癌旁组织，并且ca2蛋白在肝癌病人复发前血清中浓度明显高于未复发病人的血清浓度，经elisa和平行反应监测(parallelreactionmonitoring，prm)验证表明ca2蛋白在肝癌病人血清中浓度明显高于健康人，其在复发病人中血清浓度明显高于未复发病人。
本发明的有益效果主要体现在：本发明采用基于itraq标记的定量蛋白质组学技术，整合体外分泌蛋白质组学和体内血清蛋白质组学数据对肝癌病人进行全面系统的研究，提供了血清ca2蛋白作为肝癌病人血清诊断和预后标志物的新用途和试剂盒，该标志物经过elisa和质谱prm验证，结果更为可靠，可为临床应用提供有价值的信息。
(四)附图说明
图1为肝癌组织分泌蛋白质组工作流程图；
图2为ca2蛋白的肽段ggpldgtyr和sadftnfdpr的psm图谱；
图3为ca2质谱prm验证结果；
图4为prm检测肝癌病人和健康人血清中的ca2浓度；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图5为ca2在肝癌诊断中灵敏度和特异性的roc曲线评估；
图6为elisa检测复发/未复发肝癌病人血清ca2浓度；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图7为ca2诊断肝癌术后复发的roc曲线；
图8为kaplan-meier法分析ca2血清浓度与肝癌病人术后复发的关系。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中试剂来源：
主要仪器
实施例1：
分泌蛋白组技术检测肝癌病人癌组织的分泌蛋白ca2浓度明显高于癌旁组织和远癌组织分泌浓度。
1.检测样本：
选取福建医科大学孟超肝胆医院肝胆外科2013年11月～2014年12月收治的术前未经过手术治疗或化疗的初治肝癌病人的组织培养上清提取的分泌蛋白。
2.检测方法：
(1)置换裂解液，进行fasp酶解；
(2)上述病人组织培养上清提取分泌蛋白酶解肽段定量100μg，按照itraq试剂盒说明书分别用itraq试剂113标记所有远癌组织分泌蛋白的混合物，用于内参校正，114-119用于个体样本的标记(肝癌组织，癌旁组织和远癌组织，2个生物学重复)，共进行5个itraq试剂盒标记，共计10个生物学重复，10个技术重复，然后混合、冻干；
(3)用sep-pakvacc18萃取柱对标记后的肽段进行脱盐；
(4)脱盐后的肽段用95％h2o+5％acn，ph＝10重悬，然后采用连接到c18反相柱的hplc(高效液相色谱)系统进行高ph值下分离，收集80管馏分；
(5)每个馏分用32μl0.1％fa+99.9％h2o进行重悬，纳升液相分离，并用在线电喷雾串联质谱仪分析；
(6)质谱数据采用thermoscientificproteomediscovererversion1.4软件搜索，与uniprotkb人类蛋白质组数据库进行匹配；
(7)生物信息分析用secretomep2.0server软件检测信号肽、预测分泌蛋白；用scaffold_4.3.2软件获取定量蛋白质列表和各分泌蛋白各组样品表达量，绘制蛋白差异性表达谱，筛选显著性差异表达分泌蛋白。
3.检测结果：
ca2在c/f组(肝癌组织比远癌组织)、p/f组(癌旁组织比远癌组织)中均表达上调，在两组共同表达差异分泌蛋白中肽段比值分别为2.50、3.09，表明ca2表达水平的改变对肝癌的发生及其生物学行为有重要影响。
实施例2：
血清蛋白质组学技术检测肝癌病人复发前血清蛋白ca2浓度明显高于未复发病人浓度。
1.检测样本：
分别收集福建医科大学孟超肝胆医院4例肝癌病人(a、b、c、d)根治术后1，3，6，9月随访血清。对符合要求的病人抽取空腹静脉血5ml至生化管，冰盒取回后3000rpm，4℃离心10分钟，取上层血清分装后保存于-80℃冰箱。
2.检测方法：
(1)采用安捷伦多重亲和去除系统mars-human14液相色谱柱去除血清中的高丰度蛋白；
(2)每组血清定量100μg，按照itraq试剂盒说明书进行胰蛋白酶酶解。用2个itraq试剂盒，病人a、b低丰度蛋白肽段用一个itraq试剂盒，病人c、d低丰度蛋白肽段用一个itraq试剂盒。病人a4次随访血清分别标记为113、114、115、116，病人b4次随访血清分别标记为117、118、119、121；病人c4次随访血清分别标记为113、114、115、116，病人d4次随访血清分别标记为117、118、119、121。
(3)混合干燥的itraq标记样品用95％h2o+5％acn，ph＝10复溶，通过c18反相色谱柱将混合样品分80个馏份；
(4)每个馏份分别进行低ph值纳升液相色谱串联质谱鉴定。
(5)质谱数据采用thermoscientificproteomediscovererversion1.4软件搜索，与uniprotkb人类蛋白质组数据库进行匹配；
3.检测结果：
质谱结果显示，肝癌病人复发前血清蛋白ca2浓度明显高于未复发病人浓度。
实施例3：prm技术检测肝癌病人血清ca2浓度明显高于健康人浓度。
1.检测样本：
取hbv相关性肝癌病人术前血清及配对健康人血清行prm分析。其中肝癌病人共49例，包括24例复发病人和25例未复发病人。术前均未行任何抗肿瘤治疗，随访资料完整。同时收集23个配对健康人血清作为对照。
2.检测方法：
(1)根据前期肝癌组织分泌蛋白质组学的数据，选取ca2唯一表达的特征性肽段ggpldgtyr和sadftnfdpr，合成重标肽段(重标精氨酸13c15n)。ca2蛋白的特征性肽段ggpldgtyr(左)和sadftnfdpr(右)的psm图谱参见图2。
(2)利用高效液相色谱仪及agilent公司去除人14种高丰度蛋白的多重亲和排除系统(human14multipleafinityremovalsystem，mars)，去除上述肝癌病人和健康人群的血清样本中的白蛋白、igg和抗胰蛋白酶等14种高丰度蛋白，得到低丰度蛋白，并进行胰酶消化。
(3)将合成的重标肽段作为内标掺入到去除高丰度蛋白的血清样本中，利用靶向定量蛋白质组学技术-平行反应监测(parallelreactionmonitoring,prm)进行质谱鉴定和定量，检测肝癌病人中ca2的血清浓度。ca2质谱prm验证结果参见图3。
(4)数据分析：将prm得到的原始数据用thermoscientificproteomediscoverer2.1软件进行搜库，匹配uniprot人源蛋白质组数据库(http://www.uniprot.org/uniprot)，其结果可以作为新的数据库，再将prm得到的原始数据导入skyline软件进行结果分析，置信度为99％，分析目标肽段与重标肽段的含量比，进而进行比较各组间目标肽段的绝对定量值。
3.检测结果：
结果发现(参见图4)，ca2在肝癌病人的血清中浓度均值为13.72pg/ml，ca2在健康人群的血清中浓度均值为6.357pg/ml，ca2在肝癌病人的血清中的浓度分别显著高于其在正常人血清中的浓度(p<0.01)。
ca2在肝癌诊断中灵敏度和特异性的roc曲线评估结果参见图5，如图5所示，roc分析ca2诊断的曲线下面积为0.715，具有统计学意义(p＜0.05)。诊断方法显示出高灵敏度和良好的诊断特异性。
实施例4：elisa检测肝癌病人复发前血清ca2浓度明显高于未复发病人同时期浓度
1.检测标本：
血清样本取自于2014年2月至2016年9月之间在福建医科大学孟超肝胆医院行根治性切除手术并规律随访的hcc病人术后血清。共收集了82个肝癌临床样本，其中未复发肝癌病人23人，复发肝癌病人59人。2.检测方法：
(1)将ca2蛋白的elisa试剂盒试剂缓慢均衡至室温。
(2)按照试剂盒配制标准品：1管标准品加入标准品稀释液1ml，轻轻混匀，室温静置10分钟，配成20ng/ml标准品浓缩液。按说明书方法依次倍比稀释标准品。标准品稀释液组成：samplediluent(lifespanbiosciences,inc.humanca2/carbonicanhydraseⅱelisakit(sandwichelisa)catalogno.ls-f4349)。
(3)二抗工作液制备：1管二抗冻干粉中加入150μl二抗稀释液配成100×浓缩液，临用前用二抗稀释液100倍稀释二抗浓缩液成二抗工作液。二抗稀释液组成：assaydiluenta(lifespanbiosciences,inc.humanca2/carbonicanhydraseⅱelisakit(sandwichelisa)catalogno.ls-f4349)。
(4)streptavidinhrp工作液制备：临用前用hrp稀释液100倍稀释streptavidinhrp浓缩液，混匀。hrp稀释液组成：assaydiluentb(lifespanbiosciences,inc.humanca2/carbonicanhydraseⅱelisakit(sandwichelisa)catalogno.ls-f4349)。
(5)洗涤液配制：用475ml蒸馏水将25ml浓缩洗涤液稀释至500ml。
(6)用样品稀释液将血清稀释60倍，取100μl标准品及血清依次加入96孔酶标板上，盖上封闭纸，37℃孵育2小时。浓缩洗涤液组成：washbuffer(30×)(lifespanbiosciences,inc.humanca2/carbonicanhydraseⅱelisakit(sandwichelisa)catalogno.ls-f4349)。
(7)吸弃所有液体，洗涤3次。
(8)每孔加100μl二抗工作液，盖上封闭纸，37℃孵育1小时。
(9)吸弃所有液体，洗涤3次。
(10)每孔加入100μlhrp工作液，盖上封闭纸，37℃孵育30分钟。
(11)吸弃所有液体，洗涤3次。
(12)每孔加入100μl底物，液体慢慢变为蓝色，室温下孵育10分钟。
(13)每孔加入100μl终止液，液体由蓝色变为黄色。
(14)酶标仪用450nm波长测od值。
(15)计算：根据标准品浓度和相应的od值，利用curveexpert软件算出标准曲线的直线回归方程，利用样品od值再在回归方程上计算出样品的ca2浓度。
3.检测结果：
结果显示复发组病人复发前血清中ca2浓度明显高于未复发病人，ca2在未复发病人术后血清中的浓度平均为29.96±10.9ng/ml，而在复发病人术后的血清中，则高达48.96±30.4ng/ml，经统计二者具有显著差异(p<0.05)，参见图6。
ca2诊断肝癌术后复发的roc曲线参见图7(将复发与未复发病人血清中的ca2含量进行roc分析，结果显示ca2在预测肝癌术后复发方面具有统计学意义(p<0.05)，其曲线下面积(auc)为0.723)，ca2血清浓度与肝癌病人术后复发的关系参见图8(通过kaplan-meier生存曲线分析ca2术后的血清浓度与hcc病人术后的无复发生存率是否相关。结果(图8)显示ca2低浓度组(ca2<41.8ng/ml)，10个月、20个月、30个月的无复发生存率分别为50.0％、44％、44％，而ca2高浓度组(ca2≥41.8ng/ml)10个月、20个月、30个月的无复发生存率分别为17％、15％、15％，两组比较具有统计学意义(p<0.001)。