一种检测汞离子的目视比色传感器的制作方法

本发明涉及一种基于核酸外切酶iii辅助目标循环利用和dna催化酶共同放大信号的目视比色传感器检测汞离子的方法，属于分析化学领域。

背景技术：

汞及汞化合物的分布非常广泛，是对人类和人类所生存环境危害最大的有毒重金属之一。由于工业上利用汞的毒理性将其应用于防腐剂、农药、抗菌剂等工业产品中，使得人们接触汞及汞化合物的概率大大增加。汞离子即使在浓度很低也会对人的身体健康造成巨大威胁。随着人们生活水平和健康意识的提高，越来越多的人开始关注汞对人体健康的危害。有研究表明，汞是有可能会导致人的运动机能和记忆能力变差的重金属元素，吸入过量的汞有可能会导致人的肾脏系统、神经系统、免疫系统、生殖系统等受损；此外，汞及汞化合物可以通过如空气、水、食物等多种途径进入人体，而且汞具有生物富集性，进入人体的汞也很难排出，因此对人体危害很大。

随着现代分析测试技术的快速发展，越来越多的汞离子检测方法问世，目前常用的汞离子分析测试方法主要是仪器分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱法（icp-aes）、电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法（aas）、冷蒸气原子荧光光谱法(cv-afs)等。这些传统检测法由于操作复杂、样品检测环境要求高、仪器昂贵和无法实地检测等原因，使得它们的应用受到了限制。随着现代分析测试技术的快速发展，越来越多的新方法被应用到汞的分析检测中，例如电化学方法、荧光方法和比色检测法等方法已经广泛应用于汞离子的检测。比色法由于其结果明显、简单、快速和灵敏度高等特点受到广泛关注。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测汞离子的目视比色传感器，这种比色传感器检测方法利用核酸外切酶iii辅助目标循环和dna催化酶共同放大信号的策略大大提高检测的灵敏度。设计一种发夹结构的h-dna，在汞离子存在时,其茎干部分会互补配对，引发核酸外切酶iii对其进行剪切，生成的富含鸟嘌呤的单链dna，在氯化血红素存在时可以形成dna催化酶，催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）与h2o2的反应，生成蓝色物质，通过观察溶液颜色的明显变化来判断目标分析物汞离子是否存在，以及含量的多少，可以解决传统分析检测方法检测汞离子的操作复杂、要求高、检测成本高和背景干扰大等问题。本发明的检测方法操作简单、成本低，时间短，能够快速地可视化检测环境水样中的汞离子含量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于核酸外切酶iii和dna催化酶放大信号的目视比色传感器，由发夹结构的h-dna、氯化血红素、核酸外切酶iii、3,3',5,5'-四甲基联苯胺与h2o2组成。

所述h-dna的序列为：

5’-ctttagggtggggagggtggggccccacccttttg-3’。

所述发夹结构h-dna的制备方法是：将h-dna溶于含有100mmnacl和5mmmgcl2的20mmph7.4tris-hcl缓冲液1中，在90℃条件下加热10分钟，自然冷却到室温。所述发夹结构h-dna的浓度为2.5μm。

所述的氯化血红素的浓度为7.75μm，配制方法为：将氯化血红素样品溶于二甲亚砜，然后用tris-hcl缓冲液2稀释到所需浓度；tris-hcl缓冲液2含300mmtris-hcl、10mmtcep、1mnacl、1mmedta和1mmmgcl2，ph7.4。

所述的核酸外切酶iii的浓度为2.5u/μl。

所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为5.0mm，h2o2的浓度为10.0mm；所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺的配制方法为：先将3,3',5,5'-四甲基联苯胺样品溶于纯乙醇中，然后加超纯水定容，用由10mmnah2po4和10mmna2hpo4组成的ph5.5pbs缓冲液稀释到所需浓度。所述的h2o2的配制方法是用超纯水稀释30%过氧化氢到所需浓度。

一种基于核酸外切酶iii辅助目标循环利用和dna催化酶共同放大信号的目视比色传感器检测汞离子的方法，按照以下步骤进行：

（1）分别取45μl浓度为2.5μm的h-dna和45μl不同浓度的hg²⁺标准液，混合均匀，2min后向其中加入10μl浓度为2.5u/μl的核酸外切酶iii(exo-iii)，混匀后放入k30经济型干式恒温器中，在35℃条件下反应40min;

（2）待上述的反应溶液冷却之后，向其中加入100μl浓度为7.75μm的氯化血红素（hemin），混匀后放入冰箱（4℃）反应30min;

（3）向上述的反应体系分别加入100μl浓度为5.0mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）和100μl浓度为10.0mm的h2o2，混匀混合1min后观察溶液颜色变化。

步骤（1）中的h-dna溶液的缓冲液是tris-hcl缓冲液1(tb1)，由20mmtris-hcl,100mmnacl和5mmmgcl2（ph7.4）组成，将h-dna溶于tb1中，在90℃条件下加热10分钟，然后自然冷却到室温。

步骤（2）中的氯化血红素（hemin）的稀释缓冲液是由300mmtris-hcl,10mmtcep，1mnacl,1mmedta和1mmmgcl2组成的tris-hcl缓冲液2（ph7.4）（tb2），先将氯化血红素溶于二甲亚砜（dmso）中，然后用tb2稀释到所需要的浓度。

步骤（3）中的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）的稀释缓冲液是由10mmnah2po4和10mmna2hpo4组成的pbs缓冲液（ph5.5），先将tmb样品溶于纯乙醇中，然后加超纯水定容，用pbs缓冲液（ph5.5）稀释到所需浓度。

所述hg²⁺标准液的配制方法是将hg²⁺标准液储备液用质量分数为0.5%的hno3稀释到所需要的浓度。

实际样品处理是：将环境水样品静置一段时间后，用0.22μm的微孔滤膜过滤，往过滤液中加稀硝酸，使溶液中hno3的最终浓度为0.5%，混合均匀。

本发明的显著优点：

（1）构建了一种基于核酸外切酶iii辅助目标循环利用和dna催化酶共同放大信号的无标记、超灵敏的汞离子目视比色传感器。在汞离子存在时，h-dna的茎干部分完全互补，引发核酸外切酶iii对其剪切，生成富含鸟嘌呤（g）的dna单链，在氯化血红素（hemin）存在时，会形成dna催化酶,可以催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）与h2o2的反应，生成蓝色产物。汞离子浓度不同，溶液颜色的深浅度不同，通过肉眼即可以半定量检测汞离子而不需要借助仪器检测，因此操作简便、成本低；

（2）本发明所使用的h-dna不需要进行修饰和信号标记即可检测汞离子；

（3）本发明所使用的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）是一种性质稳定、无毒无害的物质，比较安全，因此本发明的目视比色传感器是环境友好型的；

（4）本发明的目视比色传感器检测汞离子的最低检出浓度低至2.0fm,检测范围为2.0fm-50nm；

(5)本发明的汞离子目视比色传感器特异性好，反应温和，检测速度快，重现性好，操作简便，可以快速可视化检测汞离子。

附图说明

图1目视比色传感器检测汞离子的原理图，在汞离子存在的条件下，h-dna的3’端和5’端的通过t−hg²⁺−t结构互补配对，使得h-dna的茎干部分完全互补，引发核酸外切酶iii对其剪切，生成富含鸟嘌呤的dna单链，释放出来hg²⁺又可以和h-dna反应，引发酶切反应，如此循环，使得h-dna不断被剪切，生成越来越多的富含g的单链dna，在氯化血红素（hemin）存在时，会形成dna催化酶,催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）与h2o2的反应，生成蓝色产物。

图2本发明的目视比色传感器对不同浓度的汞离子标准溶液的显色图，汞离子标准溶液的浓度依次为0.0fm、2.0fm、20fm、0.2pm、2.0pm、20pm、0.2nm、2.0nm、20nm、50nm，从图2可以看出，随着汞离子标准溶液浓度的增大，溶液蓝色越来越深，因此可以通过肉眼观察溶液颜色的深浅判断汞离子的浓度区间范围。

图3本发明的比色传感器对低浓度的汞离子标准溶液的显色图，浓度依次为0.0fm、2.0fm、20fm、2.0pm、2.0nm，由图3可以明显看出在汞离子低浓度时，溶液的蓝色变化非常明显。

图4是为本发明的比色传感器对汞离子检测的选择性实验。比色传感器对hg²⁺（20nm）和10种不同干扰离子(ca²⁺,mn²⁺,mg²⁺，zn²⁺,cu²⁺,co²⁺,bi³⁺,pb²⁺,ba²⁺,ni²⁺)(2.0μm)有不同反应，只有汞离子才能使溶液变成蓝色，说明该目视比色传感器对汞离子具有良好的选择性。

图5是为本发明的比色传感器对实际样品及不同加标浓度的实际样品的检测试验。从左到右依次是传感器对空白样品、自来水样品、自来水样品+1.0fm、自来水样品+1.0pm、自来水样品+1.0nm、湖水样品、湖水样品+1.0fm、湖水样品+1.0pm、湖水样品+1.0nm的显色图，由图5可知随着实际样品加标浓度的增大，溶液蓝色越来越深，说明本发明的目视比色传感器可以检测出环境水样中的汞离子。

具体实施方式

实施例1

1、发夹结构h-dna的制备：

（1）配置tris-hcl缓冲液1(tb1,ph7.4)，tb1由20mmtris-hcl,100mmnacl和5mmmgcl2组成；

（2）将h-dna溶于tb1中，在90℃条件下加热10分钟，然后自然冷却到室温。

2、氯化血红素（hemin）溶液的制备：

（1）配置tris-hcl稀释缓冲液2(tb2,ph7.4)，tb2由300mmtris-hcl,10mmtcep，1mnacl,1mmedta和1mmmgcl2组成；

（2）先将氯化血红素溶于二甲亚砜（dmso）中，然后用tris-hcl缓冲液2稀释到所需要的浓度。

3、3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）溶液的制备：

（1）配置pbs缓冲液（ph5.5），pbs缓冲液是由10mmnah2po4,10mmna2hpo4组成；

（2）先将tmb样品溶于纯乙醇中，然后加超纯水定容，用pbs缓冲液（ph5.5）稀释到所需浓度。

实施例2

实际样品的前处理：

（1）将环境水样品静置一段时间后，用0.22μm的微孔滤膜过滤，往过滤液中加稀硝酸，使样品溶液中hno3的最终浓度为0.5%，混合均匀。

（2）将自来水样品和湖水样品各分成3份，给它们编号：自来水1号、自来水2号、自来水3号和湖水1号、湖水2号、湖水3号，同时给自来水1号和湖水1号加入标准hg²⁺溶液配成加标浓度为1.0fm，给自来水2号和湖水2号加入标准hg²⁺溶液，配成加标浓度为1.0pm；给自来水3号和湖水3号加入标准hg²⁺溶液，配成加标浓度为1.0nm。

实施例3

实际样品的检测：

（1）分别取45μl浓度为2.5μm的h-dna和45μl水样（或不同浓度的水样加标溶液），混合均匀，2min后向其中加入10μl浓度为2.5u/μl的核酸外切酶iii(exo-iii)，混匀后放入k30经济型干式恒温器，在35℃条件下反应40min;

（2）待上述的反应溶液冷却之后，向其中加入100μl浓度为7.75μm的氯化血红素（hemin），混匀后在放入冰箱（4℃）反应30min;

（3）向上述的反应体系分别加入100μl浓度为5.0mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）和100μl浓度为10.0mm的h2o2，混匀混合1min后观察溶液颜色变化。

实施例4

实际样品检测结果如图5所示，本发明的目视比色传感器对不同加标浓度的样品溶液（左→右：0.0、自来水样品、自来水样品+1.0fm、自来水样品+1.0pm、自来水样品+1.0nm、湖水样品、湖水样品+1.0fm、湖水样品+1.0pm、湖水样品+1.0nm）的显色图，由图5可知，本发明的目视比色传感器可以检测出环境水样中的汞离子。

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