β-1,3-葡聚糖酶蛋白质在水稻干旱抗性检测中的应用的制作方法

本发明属于生物技术检测领域，具体地说，本发明涉及到一种β-1，3-葡聚糖酶在水稻干旱抗性检测中的应用。

背景技术：

中国淡水资源匮乏，尤其是北方稻区春旱发生的机率为60％～80％，随着水资源的日益匮乏和旱灾的日趋严重，水资源短缺正成为制约中国农业发展的重要因素，限制了农业生产的可持续发展，如何节约淡水资源已成为当今农业生产发展的一个焦点问题。水稻是世界重要粮食作物之一，培育抗旱性水稻品种并实现品种的节水抗旱栽培，不但可较大程度地节约水资源，而且有利于水稻生产的稳产、增产，故水稻的抗旱性研究显得愈来愈重要，也成为目前水稻研究的热点问题之一。

近年来，水稻的抗旱基因工程取得了一定的进展，获得了一大批转基因的抗旱植株。上海市农业生物基因中心在水稻抗旱研究领域内的科研成果处于全球领先地位，选育了一批以‘旱优3号’、‘旱优2号’、‘旱优5号’、‘旱优8号’为代表的适宜在长江流域和华南稻区种植的旱稻新品种，在生产上有广泛的应用前景。

有关水稻抗旱性机理机制较为复杂，国内外学者提出了一系列与抗旱性有关的形态、发育、生理与生化等的鉴定方法与指标，且有的已利用分子标记对一些指标进行了基因定位和功能基因鉴定，均获得与水稻抗旱性相关的特征信息。但是，生物体从dna到性状的最终表达是一个十分复杂的过程，中间要经历一系列的修饰和变化，仅仅从基因组水平上很难将性状和基因直接联系起来；而基因所表达的蛋白质是生物体内生理生化反应的直接参与者，也是和性状直接的“联系人”。随着高分辨质谱的出现和稳定同位素标记定量蛋白质组学的技术的出现，从蛋白质组水平上对水稻抗旱性进行研究已成为热点。所以，如何对这些水稻品种的干旱抗性进行合理的筛选以及抗性种质资源的有效利用具有十分重要的意义。

正是基于以上原因，本项目采用了现代生物质谱结合稳定同位素标记定量蛋白质组学的方法来寻找在具有抗旱性的水稻中高表达的蛋白质，以期能够更为快速的鉴定水稻品种的抗旱性，并为传统的田间育种工作提供支持。

β-1，3-葡聚糖酶(beta-1，3-glucanase)的uniprot的登录号为q9sxy7，ncbi登录号为4884528。β-1，3-葡聚糖酶催化水解β-1，3-葡聚糖(β-1，3键连接的葡聚糖多聚体)。在植物、细菌、真菌、藻类及软体动物中都有报道，属于pr类蛋白，pr类蛋白是由植物在病理或逆境条件下诱导产生的蛋白质，与植物系统诱导性抗性密切相关。

研究表明，该类蛋白在植物的生长发育、抗病性及抵御逆境胁迫等方面具有重要作用(beftaandmeins，1996；蒋选利等，2005；何江峰等，2006)。β-1，3-葡聚糖酶依其蛋白特性可分为4类：i类葡聚糖酶为碱性，主要存在于液泡中，体外具有较强的抑菌活性；ii-iv类为酸性蛋白，存在于细胞外，逆境下其受诱导表达(zhuetal.，1994)。迄今为止，在逆境胁迫下，烟草(nicotianatabacum)、猕猴桃(actinidiachinensis)、油菜(b.campestris)及苜蓿(medicagofalcata)等转β-1，3-葡聚糖酶基因植株均表现出良好的抗性。目前，有关β-1，3-葡聚糖酶基因的研究主要集中在植物的抗病方面，而关于植物的抗旱研究相对较少。

文献报道β-1，3-葡聚糖酶在植物的抗病过程中扮演着重要角色。β-1，3-葡聚糖是真菌细胞壁的重要结构成分，许多真菌的β-1，3-葡聚糖暴露在菌丝尖端表面，能够直接受到β-1，3-葡聚糖酶的攻击。体外抑菌实验表明，β-1，3-葡聚糖酶对菌丝生长具有抑制作用。不过，只有液泡定位的碱性葡聚糖酶能够降解菌丝壁，从而抑制生长，而分泌到胞外的类型则没有抑菌活性。

另外，在逆境条件下，尤其是干旱、低温、盐等非生物条件或者是aba/sa的诱导下，β-1，3-葡聚糖酶在植物的不同部位的表达量也会发生不同的变化。

综合以上发现，β-1，3-葡聚糖酶的作用方式可归纳为：由植物信号因子或病原诱导，经过一系列的反应，植物β-1，3-葡聚糖酶(包括液泡定位的碱性类型和分泌到胞外的酸性类型)大量合成。从而对抗逆境条件或者病虫害产生应答机制。到目前为止，没有β-1，3-葡聚糖酶与水稻抗旱的有关报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种β-1，3-葡聚糖酶在水稻抗旱抗性中检测中的应用，以解决现有技术的瓶颈。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

s1.通过同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification，itraq)蛋白质组学技术筛选在四叶期的ap2基因超表达植株水稻叶片以及非转基因水稻叶片中差异表达的蛋白质；

s2.找到一种在ap2基因超表达植株中特异上调表达的蛋白质——β-1，3-葡聚糖酶；

s3.通过对所述β-1，3-葡聚糖酶对应肽段的显著性分析其p值；

s4.β-1，3-葡聚糖酶在待检水稻品种中呈上调表达幅度越高，则提示该待检水稻品种的干旱抗性越强。

本发明的这一发现将为水稻抗旱的抗性检测提供一条全新的途径。采用β-1，3-葡聚糖酶检测水稻抗旱抗性与现有的鉴定的方法相比，具有时间快、成本低、可靠性高、特异性好等特点，可以缩减传统检测的成本，减少检测的假阳性率，提高检测的准确度。

附图说明

图1：s2中a和b定量比值分布

图2：s2中a2和a3样本蛋白质定量值的散点图

图3：s2中鉴定得到的β-1，3-葡聚糖酶的2个肽段的在a和b中的比值分布图

图4：s2中β-1，3-葡聚糖酶鉴定得到的2个肽段中ddqesgqk肽段的二级质谱图

图5：s2中β-1，3-葡聚糖酶鉴定得到的2个肽段中ddqesgqk肽段的二级质谱图中同位素标记定量局部放大图

图6：s3中运用商品化抗体对itraq技术进行转基因和非转基因水稻叶片差异表达蛋白质β-1，3-葡聚糖酶的表达量的变化的蛋白的免疫印迹验证图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1999)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

s1.ap2基因超表达植株和非转基因水稻叶片蛋白质样品的制备

本实施例中所使用的三氯乙酸(tca)、丙酮、hcl均购自国药公司；二硫苏糖醇(dtt)、十二万基磺酸钠(sds)、三羟甲基氨基甲烷(tris)均购自biorad公司。

本实施例以tca-丙酮以及sdt裂解的方法制备水稻叶片蛋白质样品。具体如下：

水稻在出苗30天后取所有叶片(两组品种各取3个重复)，立即在清水中洗净，吸水纸吸干水分，然后用铝箔纸包裹，于-80℃冰箱备用。称取1.2g左右叶片，用液氮研磨成粉末并转入50ml离心管中，加入25mltca/丙酮(1∶9)，65mmdtt，-20℃沉淀过夜。离心14000g，30分钟，去除上清。沉淀加入25ml纯丙酮，-20℃沉淀1小时，离心14000g，30分钟，去除上清。沉淀加入25ml纯丙酮，-20℃沉淀1小时，离心14000g，30分钟，去除上清。空气干燥，粉末-80℃保存。取0.5g粉末于1.5ml离心管中，加入lmlsdt裂解液中(4％sds，1mmdtt，150mmtris-hclph8.0)，沸水浴5min，再进行冰浴超声处理(40w，超声3s，间歇7s，共30次)，超声后样品离心，14000g，20℃离心1h，取上清。上清浓度测定采用bcaproteinassayreagent(beyotime碧云天)进行总蛋白定量，制备好的蛋白质样品进行分装，-80℃保存备用。取制备好的超表达和非转基因水稻叶片蛋白质样本每个重复各300μg；超表达样本用a1/a2/a3表示，非转基因样本用b1/b2/b3表示。

s2.运用itraq技术进行超表达和非转基因水稻叶片差异表达蛋白质的筛选

本实施例中所使用尿素(urea)、三羟甲基氨基甲烷(tris)、碘乙酰胺(iaa)购自bio-rad公司；胰酶(trypsin)购自promega公司；标记试剂盒itraqreagent-8plexmultiplexkit购自absciex公司；反相色谱仪为hplc1100series，购自agilent；色谱柱为gemini-nx4.6x150mmcolumn(3μm，)购自phenomenex公司；超滤管购自sartorius公司；orbitrapelite^tm组合式质谱仪和proteomediscoverer软件购自thermofisher^tm公司

取s1得到的2对3重复共6个超表达和非转基因蛋白质样本，结合fasp酶解和质谱技术进行品种间的差异蛋白质的筛选，具体如下：

将s1中的6个样本各取300μg并同时进行如下操作：首先加入200μluabuffer(8murea，150mmtrishclph8.0)混匀，转入30kd超滤离心管，离心14000g30min。加入200μluabuffer离心14000g30min，弃滤液，重复2次。加入100μliaa(50mmiaainua)，600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14000g10min。加入100uluabuffer，离心14000g10min重复3次。加入100μldissolutionbuffer，离心14000g10min重复3次。加入40μltrypsinbuffer(6μgtrypsinin40μldissolutionbuffer)，600rpm振荡1min，37℃16-18h。换新收集管，离心14000g10min，取滤液，od280肽段定量。

按照abi公司说明书取等量肽段(100μg)进行同位素标记，s1标记方案如表2。

表2s1的同位素标记方案

分别取s1中所有标记样品合并，合并样进行反相色谱柱hph分级，收集穿流及洗脱fraction约40份，根据反相色谱图合并成15份，冻干。

样品采用纳升流速hplc液相系统easynlc进行分离，上样量为5μl。缓冲液：a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为100％)。色谱柱以95％的a液平衡。样品由自动进样器上样到上样柱thermoscientificeasycolumn(2cm*100μm5μm-c18)，再经分析柱thermoscientificeasycolumn(75μm*250mm5μm-c18)分离，流速为250nl/min。相关梯度如下：0分钟---40分钟，b液线性梯度从5％到28％；40分钟---42分钟，b液线性梯度从28％到90％；42分钟----60分钟，b液维持在90％。样品经毛细管高效液相色谱分离后用orbitrap-elite质谱仪进行质谱分析。分析时长：60min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：350-2000m/z，一级质谱分辨率：60,000atm/z200，agctarget：1e6，一级maximumit：10ms，numberofscanranges：1，dynamicexclusion：30.0s。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(fullscan)后采集16个碎片图谱(ms2scan)，ms2activationtype：hcd，isolationwindow：2m/z，二级质谱分辨率：15,000atm/z100，microscans：1，二级maximumit：100ms，agctarget：5e4，normalizedcollisionenergy：35ev，underfillratio：0.1％。

数据处理使用的数据库为uniprot水稻数据库(uniprot_rice_168354_20161009.fasta)。数据库文件经用内置软件mascot(version2.3)的proteomediscoverer2.1(thermoscientific)进行查库鉴定及定量分析。结果过滤参数为：peptidefdr≤0.01；psmfdr≤0.01。搜库结果的定量分析如下：抽提肽段报告离子峰强度值信息，并以各标签通度值的中位数对信号强度进行归一化处理。肽段定量结果为参考样品所在标签的信号强度值与其他标签的信号强度值的比值。蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数。最终定量结果再以各标签比值中位数进行归一化处理，以消除实验中人为因素引入的上样量误差。

本实施例中对s1中的样品总共鉴别出了5051个蛋白质，差异表达的蛋白质有624个。其中，超表达水稻叶片组织中高表达的为318种蛋白质；非转基因水稻叶片组织中高表达的为306种蛋白质。在这624个蛋白质中，通过a组和b组的比值取log2对数分布作蛋白个数统计和直方图(附图1)可以看出，有87.6％的蛋白质数据分布于±0.26之间(0.8-1.2倍之间)。在s1中样品的质谱结果中，以a组和b组各三个重复的蛋白定量数据做pearson相关性分析，其中a2与a3的相关系数图见附图2。从表4中可以看出，相关系数r分别为0.911、0.899和0.931，均超过0.85。

在本实施例中对s1中的样品所鉴定出来的624个差异蛋白质中，β-1，3-葡聚糖酶在转基因植株中上调表达，转基因植株和非转基因植株的比值为1.80，p为1.4e-04(极显著)。数据库搜索得2个肽段(peptidefdr≤0.01；psmfdr≤0.01)，具体结果详见表5。各个肽段定量值的分布图如附图3，a组和b组肽段基本可以分开，两组各自肽段定量值进行t-test计算，p值为4.17e-05，达到极显著水平(以第1条肽段为例，其二级质谱图见附图4，定量信息见附图5)。

表4s1中a组质谱差异蛋白鉴定结果的相关性分析

表5β-1，3-葡聚糖酶质谱鉴定结果

s3.运用蛋白的免疫印迹验证itraq技术进行转基因和非转基因水稻叶片差异表达蛋白质β-1，3-葡聚糖酶的表达量的变化

为确认蛋白质β-1，3-葡聚糖酶的差异表达，取s1中的两组6个样本的水稻叶片组织蛋白质样品，用抗体进行免疫印迹分析，具体过程简述如下：每个样本取20ug蛋白质样品用12％sds-apge分离，再电转印至pvdf膜(购自gehealthcare公司)上，一抗使用兔源抗蛋白质β-1，3-葡聚糖酶多克隆抗体(购自上海经科化学科技有限公司公司，1∶1000)，4℃孵育过夜，使用tbst(每升含tris2.42g，氯化钠8g，tween201ml，用hcl调节ph到7.6)洗涤三次，每次5分钟，二抗为抗兔抗体(购自cst公司1∶3000)，室温孵育1小时，再使用tbst洗涤三次，每次10分钟，最后用supersignal^tmwestpicopluschemiluminescentsubstrate试剂(购自thermofisher)反应2分钟后，以x光片曝光检测，检测结果如图6所示。

图6的免疫印迹结果显示，两组6个样本中呈现这样的现象：ap2基因超表达植株叶片组织中的蛋白质β-1，3-葡聚糖酶的杂交条带的浓度都明显高于非转基因植株叶片组织中的蛋白质β-1，3-葡聚糖酶浓度；可见蛋白质β-1，3-葡聚糖酶在ap2基因超表达植株水稻叶片组织中存在高表达。

综上所述，在s2中，ap2基因超表达植株和非转基因植株叶片组织中的蛋白质变化趋势分析结果发现87％以上蛋白变化倍数在0.8-1.2倍之间；组内三次重复实验的相关系数r值均在0.85以上，说明本次实验数据的可靠和严谨。同时β-1，3-葡聚糖酶在两个品种中存在显著差异高表达(p＝1.40e-04、ratio＝1.80)；对其所检测到的肽段数据分析发现两个品种间也存在及显著差异表达(2.8e-04)，同时，s3将两个品种中的蛋白进行免疫印迹分析所得的数据也与实施例2中蛋白定量趋势变化相一致。

鉴于以上实验数据和结果，β-1，3-葡聚糖酶蛋白与水稻抗旱性有着密切的相关性，因此其表达量可以作为一个指标用于检测水稻品种的干旱抗性。

虽然有关β-1，3-葡聚糖酶蛋白与水稻抗旱性的相关机制还有待进一步研究，但是将其作为用于检测水稻品种的抗旱性的一个指标是肯定的。