本发明涉及疾病诊断试剂盒技术领域，进一步涉及基于基因检测的疾病辅助诊断技术，具体涉及一种类风湿性关节炎辅助诊断试剂盒及检测方法。
背景技术：
类风湿关节炎(ra)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。ra关节炎的病理主要有滑膜衬里细胞增生、间质大量炎性细胞浸润，以及微血管的新生、血管翳的形成及软骨和骨组织的破坏等。症状多表现为手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。ra的发病可能与遗传、感染、性激素等有关，诊断标准包括以下一系列特征：1)晨僵≥30分钟；2)大于3个关节区的关节炎；3)手关节炎；4)类风湿因子(rf)阳性；5)抗ccp抗体阳性。14个关节区包括：双侧肘、腕、掌指、近端指间、膝、踝和跖趾关节；以上特征满足3条以上可诊断为ra。
近年来，随着分子生物学和医学影像学的发展，其他检测依据被引入了ra的诊断中，例如，ra患者自身抗体的检出，是ra有别于其他炎性关节炎，如银屑病关节炎、反应性关节炎和骨关节炎的标志之一，目前临床常用的自身抗体包括类风湿因子(rf-igm)、抗环状瓜氨酸(ccp)抗体、类风湿因子igg及iga、抗核周因子、抗角蛋白抗体，以及抗核抗体、抗ena抗体等，同时，还包括抗ra33抗体、抗葡萄糖-6-磷酸异构酶(gpi)抗体，抗p68抗体等。此外，通过x射线可见软组织肿胀、骨质疏松及病情进展后的关节面囊性变、侵袭性骨破坏、关节面模糊、关节间隙狭窄、关节融合及脱位。mri检查手关节及腕关节的mri检查可提示早期的滑膜炎病变，对发现类风湿关节炎患者的早期关节破坏很有帮助，超声关节超声是简易的无创性检查，对于滑膜炎、关节积液以及关节破坏有鉴别意义。
目前ra缺乏直接、有效的预防和治疗策略，缺乏高敏感性、特异性的诊断指标。临床上关节滑膜组织虽可通过手术或者穿刺留取，由于取材的有创性,使其应用受到一定限制。有研究表明，在ra的发病过程中，伴随着基因表达的改变，在这种情况下，如果能确切获得基因表达情况与ra病理特征间的关系，则有望成为ra诊断的新依据，基于基因表达情况的ra诊断方法，在稳定性和准确性方面更加可靠，然而，由于相关研究的缺失，目前尚不掌握对ra具有确切指向性的基因类别，也不清楚其表达水平与ra病理特征之间的关系。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种类风湿性关节炎辅助诊断试剂盒及检测方法，以解决现有技术中，缺乏一种基于基因检测手段的、ra辅助诊断试剂盒的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是，ra的病理进程与患者自噬性基因表达情况间的关系尚不明显。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种类风湿性关节炎辅助诊断试剂盒，包括：分别包被有atg5抗原、atg8抗原、beclin1抗原的孔板；阳性质控：atg5阳性血清，atg8阳性血清，beclin1阳性血清；阴性质控：健康人阴性血清；工作液r：标记有hrp的抗人atg5抗体，标记有hrp的抗人atg8抗体，标记有hrp的抗人beclin1抗体；稀释液：去离子水；tmb底物；终止液：1mol/l的h2so4溶液；浓缩清洗洗涤液：pbs-tween缓冲液。
作为优选，所述孔板为96孔板。
作为优选，所述atg5阳性血清，atg8阳性血清，beclin1阳性血清各为50μl。
作为优选，所述健康人阴性血清为50μl。
作为优选，所述标记有hrp的抗人atg5抗体，标记有hrp的抗人atg8抗体，标记有hrp的抗人beclin1抗体各为150μl。
作为优选，所述去离子水的体积为工作液r总体积的100倍。
作为优选，所述tmb底物有15份，每份为100μl。
作为优选，所述终止液有15份，每份为50μl。
作为优选，所述浓缩清洗洗涤液有20份，每份为250μl。
一种应用上述试剂盒检测类风湿关节炎的方法，包括以下步骤：
1)加样：将孔板上的孔划分为标准孔，待测样品孔，空白孔，其中所述标准孔有3孔，向3个标准孔中分别加入3种阳性质控，每种阳性质控各50μl，空白孔加50μl阴性质控，待测样品孔中加入待测样品50μl；每孔加工作液r150μl，振动混匀，孔板加覆膜，于37℃温育1小时；
2)弃去孔内液体，每孔用250μl的浓缩清洗洗涤液洗涤，浸泡1分钟，而后清除孔内所有液体；重复洗板3次，最后一次洗涤后，倒出剩余的浓缩清洗洗涤液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干；
3)每孔加tmb底物100μl，酶标板加上覆膜，于37℃避光显色10～30min；
4)每孔加终止液50μl，终止反应。
本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定样本中atg5、atg8、beclin1的含量。将单克隆抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗体的微孔中同时加入生物素标记的抗原和待测抗原(标准品或样本)，待测抗原与生物素标记抗原对特异性抗体进行竞争结合。温育后经洗涤去掉未结合物，然后加入hrp标记的亲和素，经过温育和彻底洗涤后加入底物tmb显色。tmb在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。待测标本浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中待测物质含量呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，计算样品浓度。
本发明提供了一种类风湿性关节炎辅助诊断试剂盒及检测方法，该技术方案以首先探究了ra患者基因表达情况与病理特征之间的关系，研究发现，不同活动期间ra患者外周血单个核细胞中的atg5、atg8、beclin1基因的mrna相对表达水平呈不同程度的表达差异，表现出外周血单个核细胞beclin1和atg8等相关自噬基因的表达变化对ra的预后及活动具有一定的相关性和指向性。基于以上积极的发现，本发明开发了一种基于自噬性基因检测的ra辅助诊断试剂盒，该试剂盒以人的血清、血浆或其它体液作为生物检材，采用竞争抑制elisa法定量测定其中atg5、atg8、beclin1含量，可以此为依据来实现ra的辅助检查，并评价ra的病理特征和发展进程。本发明简便易行，检测过程对人体创伤较小，评价依据更为稳定可靠。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1
1、材料与方法
1.1研究对象
病例组：选择从2014年1月至2015年6月入住福建医科大学附属漳州市医院血液风湿内科的患者60例，女40例，男20例，患者平均年龄为46.75±13.52岁，按类风湿关节炎的诊断标准为美国风湿病学会(acr)和欧洲抗风湿联盟(rular)联合推出2009年最新ra诊断标准。按ra疾病活动指数(das28)分为低度活动期(das28<3.2)、中度活动期(das283.2～5.1)与高度活动期(das28>5.1)，其中低度活动期l组22例，中度活动期m组20例，高度活动期h组18例。对照组：为同期门诊健康体检者，25例，女18例，男7例，平均年龄为45.35±14.02岁。
1.2仪器试剂
real-timepcr仪器,7500型号，abi公司；高速离心机，型号5424r,thermo公司；超纯水系统，型号direct-q5，millipore公司。主要引物序列：atg5(f:5’-agaagctgtttcgtcctgtg-3’,r:5’-aggtgtttccaacattggct-3’atg8:(f:5’-atagaatagaaagtgcatctcc-3’,r:5’-tctatttattggttcagtcg-3’)；beclin1:(f:5’-caagatcctgga-3’,r:5’-ccgtgtca-3’)；gapdh:(f:5’-aatgaaggggtcattgatgg-3’,r:5’-aaggtgaaggtcggagtcaa-3’)，由上海生工公司合成。
1.3方法
采集2ml静脉血，置于经抗凝剂处理过的真空采血管中,用于对照组和实验组pbmcs的分离。总rna的提取参照北京全式金生物技术有限公司(transgen)rna提取试剂盒transzolupplusrnakit(cat.no.:er501-01)说明书操作。采用北京全式金生物技术有限公司(transgen)荧光定量pcr试剂盒2×transstartmtopgreenqpcrsupermix(cat.no.:aq131-02)进行real-timeqpcr检测atg5、atg8、beclin1的mrna，反应结束后，以gapdh为内参基因，2-△△ct法分析基因表达水平，比较各基因的表达差异结果。
1.4统计分析
利用统计学spss软件进行数据处理与临床分析，计量资料以±s表示，组间采用kruskalwallish检验，有统计学差异后用nemenyi检验作两两比较，指标间的相关性分析采用线性回归；检验水准α＝0.05,以p﹤0.05为差异有统计学意义，并探讨它们与疾病的不同活动组之间的联系。
2、结果
2.1各组ra患者pbmc的atg5的mrna表达水平情况：低活动组(l)、中活动组(m)中atg5的mrna均高于健康对照，p分别为0.035、0.013、均小于0.05，差异有统计学意义。高活动组(h)与对照组差别不大，p＝0.078。
2.2各组ra患者pbmc的atg8的mrna表达水平情况：低活动组(l)、中活动组(m)、高活动组(h)中atg8的mrna均高于健康对照0.49±0.09，p分别为0.001、0.002、0.001均小于0.05，差异有统计学意义。中活动组(m)低于低活动组(l)、高活动组(h)，p分别为0.044、0.043。
2.3各组ra患者pbmc的beclin1的mrna表达水平情况
低活动组(l)、中活动组(m)、高活动组(h)中beclin1的mrna均高于健康对照0.76±0.10，p分别为0.012、0.013、0.015均小于0.05，差异有统计学意义。具体数据见表1。
表1ra患者pbmc中atg5、atg8、beclin1的mrna相对表达情况
注：*与健康对照组比较p＜0.05
3、讨论
类风湿关节炎(ra)是一种以滑膜的慢性炎症增生及伴有炎性细胞浸润的全身性自身免疫性疾病。其原因可能为机体内自噬机制的失衡导致自身免疫病以及自身炎症的发生，对自噬分子机制的了解始于在酵母中发现的自噬相关基因(autophagy-relatedgene，atg)。目前，在真核生物中已发现30多种atg。在人体中，自噬基因编码的多种蛋白复合物在自噬体的形成中起重要作用。atg5、atg8、beclin1等自噬基因参与了一系列的自噬调控过程，atg5在自噬过程中起重要的调控作用,主要是通过与保守蛋白atgl2结合,形成atgl2-atg5复合蛋白系统,促进自噬体膜的延伸。atg3在整个自噬过程起e2酶催化作用,atg8与磷脂酰肌醇(ip3)结合,参与了自噬体形成、自噬泡的发育过程。自噬在rasfs的死亡路径中具有双重作用。atg8基因是lc3的同源物,lc3是自噬体的特异性标记蛋白，参与自噬体的形成。这些自噬基因对自噬发生的启动、自噬体的延长、成熟过程具有重要作用，任何一个环节的错误都会导致自噬的异常。本文数据研究也显示，在外周血单个核细胞中atg5、atg8在不同的ra患者活动组中呈不同的变化，各组ra患者pbmc的atg5的mrna表达水平情况：l组、m组中atg5的mrna分别为3.38±0.45、4.46±1.28，均高于健康对照2.06±0.25(p分别为0.035、0.013、均小于0.05，有统计学差异)。h组为2.36±0.96与对照组差别不大，p＝0.078。有研究阐述atg5的缺失会影响死亡细胞的清除和抗原的呈递，可引起自身免疫反应和炎症。而各组ra患者pbmc的atg8的mrna表达水平情况：l组、m组、h组中atg8的mrna分别为1.98±0.28、1.58±0.81、2.07±0.32，均高于健康对照0.49±0.09，p分别为0.001、0.002、0.001均小于0.05，有统计学差异。可见atg5、atg8、beclin1基因均参与了ra患者的自噬行为，实验结果显示不同活动组ra患者外周血单个核细胞中的atg8的mrna和蛋白呈不同程度的表达差异，表明外周血单个核细胞中的atg5、atg8基因可能参与了ra的自身免疫调节，随着ra疾病的进展，atg5、atg8呈逐渐升高趋势，提示自噬可能参与ra的发生。
beclinl基因是ra患者外周血淋巴细胞自噬相关标志物,有研究发现在ra的破骨细胞中，自噬被激活，beclin1和atg8表达增高。beclin1通过与bcl-2结合抑制pi3kc3复合物活性，jnk1和dapk导致beclin1磷酸化，使bcl-2与beclin1解离而诱导自噬。哺乳动物能量缺乏时还可以通过激活腺苷酸环化酶(ampactivatedproteinkinase，ampk)使ulk1磷酸化而激活自噬。有研究表明，在ra的破骨细胞中，自噬激活，beclin1表达增高，过量表达的beclin1能诱导破骨细胞的生成能力和重吸收功能。可通过靶向药物调节基因水平从而抑制自噬，阻碍破骨细胞的进一步分化，从而对tnf-α诱导的骨侵蚀、黏蛋白的丢失和软骨细胞的死亡有保护作用。beclin1的表达量与ra患者的破骨情况密切相关，由此可以作为破骨细胞分化的考察指标。本实验研究结果显示各组ra患者pbmc的beclin1的mrna表达水平情况：l组、m组、h组中beclin1的mrna分别为2.08±0.66、2.19±0.30、1.89±0.55，均高于健康对照0.76±0.10(p分别为0.012、0.013、0.015,均小于0.05，有统计学差异)。自噬在多数情况下对机体具有保护作用，尤其在饥饿、缺氧等应激初期，由于胞内氨基酸的缺乏可激活细胞内mtor启动自噬，使错配蛋白质或损伤细胞器降解，营养物质循环利用，以维持细胞平衡。然而，过度刺激和长时间的应激状态，会使胞质成分过度降解导致细胞的死亡,细胞自噬可能与ra的发生发展有相关性。
自噬调节的异常会导致许多疾病的发生，研究较多的是自噬在肿瘤发生发展中的作用。现在越来越多的证据表明自噬在先天免疫和适应性免疫中扮演重要角色。目前检测滑膜细胞各种自噬基因蛋白主要通过手术或者穿刺获得关节液提取滑膜细胞进行检测，这属于有创、费时、同时也给病人带来痛苦，且有时易并发感染等，本研究通过采集外周血提取单个核细胞中的总rna，检测自噬相关基因atg5、atg8、beclin1的表达差异，针对外周血中相关自噬基因用于ra辅助检查，这种简便易行、无创的检验项目具有一定研究意义。
基于以上研究结果，本发明提供了一种类风湿性关节炎辅助诊断试剂盒，该试剂盒以atg5、atg8、beclin1作为检测对象，该试剂盒包括：分别包被有atg5抗原、atg8抗原、beclin1抗原的孔板；阳性质控：atg5阳性血清，atg8阳性血清，beclin1阳性血清；阴性质控：健康人阴性血清；工作液r：标记有hrp的抗人atg5抗体，标记有hrp的抗人atg8抗体，标记有hrp的抗人beclin1抗体；稀释液：去离子水；tmb底物；终止液：1mol/l的h2so4溶液；浓缩清洗洗涤液：pbs-tween缓冲液。
实施例2
一种类风湿性关节炎辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测人血清、血浆或其他体液中atg5、atg8、beclin1的含量；该试剂盒的成分如以下表2所示：
表2试剂盒成分列表
该试剂盒的使用方法如下：
1)加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。
ⅰ设标准孔3孔，依次加入50μl不同浓度的阳性质控；
ⅱ空白孔加50μl阴性质控；
ⅲ待测孔加待测样品50μl，然后立即每孔加工作液150μl，轻轻振动，混匀，注意不要有气泡，酶标板加上覆膜，37℃，温育1小时。
2)弃去孔内液体，每孔用250μl的洗涤液洗涤，浸泡1分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。
重复洗板3次。最后一次洗涤后，倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。
3)每孔加底物溶液100μl，酶标板加上覆膜，37℃避光显色(反应时间控制在10-20分钟，不要超过30分钟。当标准孔有明显的梯度蓝色，即可终止)。
4)每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序一致。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。