本发明涉及一种利用紫外分光光度法测定壳聚糖酸水解率的方法，属于大分子水解技术领域。
背景技术：
甲壳素(chitin)是虾、蟹等甲壳类、甲虫等的外骨骼及蘑菇等菌类的细胞壁成分，广泛存在于自然界。壳聚糖(chitosan)是甲壳素脱去乙酰基的产物，是一种为数不多的、天然的、商品化的碱性多糖，其资源量仅次于纤维素。由于壳聚糖具有良好的成膜性、生物可降解性和一定的抗菌消炎及促进伤口愈合作用，在纺织、印染、造纸、食品、医药、环保等诸多领域得到广泛应用。在医疗方面，可制作外科手术线，人造血管和人造皮肤，止血海绵及创伤专用敷料；在药物制剂方面，可做缓释药物及抗癌药物等。另外壳聚糖还具有促进人体肠内双歧杆菌的生长、防止人体胆固醇的蓄积，促进体液免疫和细胞免疫等功能。
d-氨基葡萄糖盐酸盐又称葡萄糖胺盐酸盐(d-glucosaminehydrochloride，gah)，是壳聚糖水解的最终产物。gah在体内具有重要的生理意义：参与肝肾解毒，发挥抗炎、护肝、抗反应性、抗低氧的作用；刺激婴儿肠道中双歧杆菌的增生等。d-氨基葡萄糖的用途十分广泛，具有巨大的科学价值、社会效益和经济利益，国内外需求正日益增加。目前，gah大多数以甲壳素或壳聚糖为原料制备，但由于在敞开式水解过程中，壳聚糖分子间与分子内部的氢键断裂后会被空气中的氧气破坏而影响显色反应，测定值偏低，回收率30％～40％。又由于酸水解过程中采用单一酸进行水解。酸的浓度不高，普遍需要长时间水解才能得到较高的水解产率，水解效率低。gah含量测定方法有很多，在壳聚糖测定中常用的测定还原糖的方法主要有高效液相色谱法、苯酚-硫酸法、elson-morgan法、dns法等。其中，elson-morgan法是经典的测定氨基葡萄糖的方法，游离的氨基葡萄糖在碱性条件下与乙酰丙酮缩合生成生色原2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物，生色原再与对-二甲氨基苯甲醛在浓盐酸乙醇溶液中显色，对氨基葡萄糖有很好的专一性。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有的壳聚糖的水解产物收率低、水解效率低、质量差的不足之处，提供一种高效、绿色环保、产率高的氮气保护下酸水解壳聚糖的方法。本发明以壳聚糖水解液中gah的产率为指标，在氮气保护的环境下对壳聚糖水解条件进行优化，将采用乙酰丙酮法对水解条件进行筛选，优选最佳水解条件。
一种利用紫外分光光度法测定壳聚糖酸水解率的方法，其包括下述步骤：
1)称取300mg壳聚糖加入烧瓶，量取40ml无机酸溶液加入烧瓶，密封装置，用真空泵抽尽空气，再通入氮气，重复3次。启动恒温磁力搅拌器，控制反应温度100℃、转速200r/min，反应时间为12h～48h，用取样针分别在不同时间取出适量水解液分别密封保存，作为样品，放置冰箱备用；
2)紫外分光光度法测定氨基葡萄糖的含量：
a)绘制a和不同浓度的氨基葡萄糖标准液的标准曲线：分别吸取1.5ml一定浓度梯度的氨基葡萄糖标准液于10ml比色管中用水定容至2ml，分别加入乙酰丙酮溶液1.5ml，摇匀，80℃水浴30min。取下冷却至室温，分别加对二甲氨基苯甲醛溶液5.0ml，加无水乙醇至10ml，60℃水浴60min，取下冷却至室温，以空白管作对照，在紫外分光光度计上测定波长534nm时吸光值。分别做三组平行试验，测各管吸光度。以测得吸光度a为纵坐标，氨基葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线；
b)样品工作液的制备：取步骤1)中水解液样品1.0ml于50ml容量瓶，用水定容至50ml后充分摇匀，即得样品工作液；
c)样品中氨基葡萄糖的含量确定：取步骤b)中样品工作液1.5ml，按步骤a)检测方法进行测定，在534nm处测定其吸光度值a，将a代入线性回归方程求得样品中氨基葡萄糖的含量；
3)壳聚糖水解液中氨基葡萄糖产率的计算公式为：
式中：m1是由标准曲线计算得出盐酸氨基葡萄糖的含量，单位是μg/ml；
m2是壳聚糖样品的含量，单位是μg/ml；
0.8309是盐酸氨基葡萄糖折算为氨基葡萄糖的系数。
如上所述的一种利用紫外分光光度法测定壳聚糖酸水解率的方法，所述壳聚糖的脱乙酰度为80％以上；壳聚糖的分子量范围在2万～30万。
如上所述的一种利用紫外分光光度法测定壳聚糖酸水解率的方法，所述无机酸是盐酸，磷酸和硫酸中的一种或两种以上。
如上所述的一种利用紫外分光光度法测定壳聚糖酸水解率的方法，所述无机酸是浓度为6mol/l的盐酸。
如上所述的一种利用紫外分光光度法测定壳聚糖酸水解率的方法，步骤a)中氨基葡萄糖的含量范围是3μg/ml～24μg/ml。
试验例：
1.水解生成氨基葡萄糖的验证
称取300mg壳聚糖加入烧瓶，量取40.00ml6mol/lhcl溶液加入烧瓶，密封装置，用真空泵抽尽空气，再通入氮气，重复3次。启动恒温磁力搅拌器，设置参数(t＝100℃、n＝200r/min)，开始水解。分别在第12、24、36、48小时抽取水解液与氨基葡萄糖标准品溶液在薄层硅胶板上进行点样，点样后置于装有层析液的层析缸，上行法展开。展开完成后，用电吹风吹干硅胶板，用0.1％茚三酮溶液进行着色，再用电吹风热风使硅胶板显色。结果如图1所示，从左往右水解时间依次为12、24、36、48h，水解液在硅胶板上显色逐渐明显(左：氨基葡萄糖标准品右：壳聚糖水解液)，表明水解液中氨基葡萄糖的含量随着水解时间的增加而增加。且36小时后显色明显拉长，是因为壳聚糖水解生成的氨基葡萄糖开始逐渐被降解破坏，故后续实验的水解液可以取24-36h来进行检测。
2.标准曲线的绘制
分别吸取120μg/ml氨基葡萄糖标准液0、0.25、0.5、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00ml于10ml比色管中用水加至2ml，分别加入乙酰丙酮溶液1.5ml，摇匀，80℃水浴30min。取下冷却至室温，分别加对二甲氨基苯甲醛溶液5.0ml，加无水乙醇至10ml，60℃水浴60min，取下冷却至室温，以空白管作对照，在紫外分光光度计上测定波长534nm时吸光值。分别做三组平行试验，测各管吸光度。以测得吸光度(a)为纵坐标，gah含量(μg/ml)为横坐标(标准曲线中所取的点从左往右浓度依次为3、9、15、18、24μg/ml)，绘制标准曲线。得出回归方程：y＝0.0113x-0.0012，r2＝0.9943，表明测定gah含量在3～24μg/ml之间，在波长为534nm时吸光值与氨基葡萄糖的量线性关系良好。
3.不同反应时间条件下水解产率的比较
称取300mg壳聚糖于烧瓶中，量取40ml6mol/lhcl溶液于烧瓶中，密闭，抽真空，填充氮气，重复3次。恒温磁力搅拌器设置参数t＝100℃，持续恒温水解。分别取适量第24、30、36、42、48小时水解液，备用。
分别取第24、30、36、42、48小时水解液1.0ml于50ml容量瓶，用水定容至50ml，分别吸取1.5ml稀释液于10ml比色管，处理同标准溶液，以空白管作对照，在紫外分光光度计上测定波长534nm时吸光值。分别做三组平行试验。
表1不同反应时间水解产率的比较结果(n＝3)
结果表明，随着水解时间越长，gah的产率缓慢增加，水解时间达到48小时，gah产率仍在上升，48小时是否是最佳反应时间有待进一步验证。
4.盐酸和混合酸(中强酸)各比例条件下水解产率的比较
称取300mg壳聚糖并量取40.00ml6mol/lhcl溶液加入烧瓶，密封装置，抽尽空气，再通入氮气，重复3次。设置恒温磁力搅拌器参数(t＝100℃、n＝200r/min)，持续恒温水解。分别在第24、30、36小时抽取水解液，备用。
称取300mg壳聚糖于烧瓶中，分别量取20ml9.0mol/lhcl溶液和20ml3.0mol/lh3po4(3∶1)、20ml8.0mol/lhcl溶液和20ml4.0mol/lh3po4(2∶1)、20ml6.0mol/lhcl溶液和20ml6.0mol/lh3po4(1∶1)溶液于烧瓶中，恒温磁力搅拌器设置参数(t＝100℃、n＝200r/min)。持续恒温水解。分别在第24、30、36小时抽取水解液，备用。
分别取6mol/lhcl、混合酸水解壳聚糖第24、30、36小时水解液1.0ml于50ml容量瓶，其余处理同标准溶液。以空白管作对照，在紫外分光光度计上测定波长534nm时吸光值。分别做三组平行试验。
表2盐酸和混合酸水解产率的比较结果(n＝3)
结果表明，水解相同时间，在磷酸比例较小时水解效果不如单独hcl水解的回收率高，而hcl-h3po4的比例为1∶1时水解效果变得更差，可能是因为混合酸酸度不够，壳聚糖此时水解不完全，故使用hcl水解的gah的产率都高于使用hcl-h3po4水解的产率，盐酸的水解效果较好。
5.盐酸和混合酸(强酸)条件下水解产率的比较
称取300mg壳聚糖于烧瓶中，分别量取20ml9.6mol/lhcl溶液和20ml2.4mol/lh3so4(4∶1)、20ml9.0mol/lhcl溶液和20ml3.0mol/lh2so4(3∶1)、20ml8.0mol/lhcl溶液和20ml4.0mol/lh2so4(2∶1)、20ml6.0mol/lhcl溶液和20ml6.0mol/lh2so4(1∶1)溶液于烧瓶中，恒温磁力搅拌器设置参数(t＝100℃、n＝200r/min)。持续恒温水解。分别在第24、30、36小时抽取水解液，备用。
分别取6mol/lhcl、混合酸水解壳聚糖第24、30、36小时水解液1.0ml于50ml容量瓶，余处理同标准溶液。以空白管作对照，在紫外分光光度计上测定波长534nm时吸光值。分别做三组平行试验。
表3盐酸和混合酸水解产率的比较结果(n＝3)
结果表明，水解相同时间，当强酸比例较小时(如hcl-h2so4(4∶1))，其回收率接近单独使用盐酸的水解回收率，但水解产率依然是盐酸较高，而当强酸比例较大时(如hcl-h25o4(1∶1))，其水解效果明显不及盐酸，可能是因为硫酸浓度过高，而使大部分壳聚糖被碳化破坏，或是因为大部分水解生产的氨基葡萄糖在强酸下被降解破坏。可见，使用hcl水解的gah的产率普遍都高于hcl-h2so4水解的产率，盐酸的水解效果较好。
6.盐酸和混合酸(强酸)24h水解产率的比较
通过上述结果可见，短时间内即24h水解条件下，盐酸与强酸混合比例为3∶1、4∶1时水解产率较高。
表4盐酸和混合酸24h水解产率的比较结果(n＝3)
结果表明，当盐酸-强酸比例3∶1时，其短时间的回收率高于单独使用盐酸时的回收率，水解24小时，水解产率可达72.8％。因而，从缩短水解时间，降低水解成本角度上考虑，调整混合酸的配比，当盐酸-硫酸比例3∶1时，水解24小时能够较大提高水解产率。
本发明与现有技术相比具有如下技术优势：
1)本实验在水解阶段，密封装置，用真空泵抽尽空气，并通入氮气，重复3次，在氮气保护下对壳聚糖进行水解，避免壳聚糖水解断链过程与氧气发生反应，对氨基葡萄糖的分子结构进行较好的保护。
2)实验探讨了壳聚糖水解方法，分别对其考察了酸的选择、酸的浓度、反应时间、反应温度对水解效果的影响，采用紫外分光光度法测得氨基葡萄糖产率评价不同水解条件的效果，最终得出壳聚糖在氮气保护下水解最佳工艺。
3)紫外分光光度法测定氨基葡萄糖的含量线性好、专一性好：在最佳实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的氨基葡萄糖对应的a，绘制标准曲线，结果表明，氨基葡萄糖在浓度3μg/ml～24μg/ml范围内与a存在良好的线性关系；并且紫外分光光度法(乙酰丙酮法)测定氨基葡萄糖对游离的氨基葡萄糖具有较好的专一性。
附图说明
图1壳聚糖水解液与氨基葡萄糖标准品对比tlc图。
图2吸光度和不同浓度的氨基葡萄糖标准液的标准曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述发明并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例1
一种利用紫外分光光度法测定壳聚糖酸水解率的方法，其包括下述步骤：
1)称取300mg壳聚糖加入烧瓶，量取40ml6mol/l的盐酸溶液加入烧瓶，密封装置，用真空泵抽尽空气，再通入氮气，重复3次。启动恒温磁力搅拌器，控制反应温度100℃、转速200r/min，反应时间为48h，用取样针取出适量水解液密封保存，作为样品，放置冰箱备用；
2)紫外分光光度法测定氨基葡萄糖的含量：
a)绘制a和不同浓度的氨基葡萄糖标准液的标准曲线：分别吸取1.5ml一定浓度梯度的氨基葡萄糖标准液于10ml比色管中用水定容至2ml，分别加入乙酰丙酮溶液1.5ml，摇匀，80℃水浴30min。取下冷却至室温，分别加对二甲氨基苯甲醛溶液5.0ml，加无水乙醇至10ml，60℃水浴60min，取下冷却至室温，以空白管作对照，在紫外分光光度计上测定波长534nm时吸光值。分别做三组平行试验，测各管吸光度。以测得吸光度a为纵坐标，氨基葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线；
用标准液按实验方法绘制样品曲线，结果为标准品的线性回归方程是a＝0.0113c-0.0012，表明测定gah含量在3～24μg/ml之间，在波长为534nm时吸光值与氨基葡萄糖的量线性关系良好；
b)样品工作液的制备：取步骤1)中反应48小时的水解液样品1.0ml于50ml容量瓶，用水定容至50ml后充分摇匀，即得样品工作液；
c)样品中氨基葡萄糖的含量确定：取步骤b)中样品工作液1.5ml，按步骤a)检测方法进行测定，在534nm处测定其吸光度值a，将a代入线性回归方程求得样品中氨基葡萄糖的含量；
取样品工作液1ml，按实验方法进行测定，在534nm处测定其吸光度值a，将a代入线性回归方程求得样品中氨基葡萄糖的含量，结果见表5；
3)壳聚糖水解液中氨基葡萄糖产率的计算公式为：
将m1、m2代入壳聚糖水解液中氨基葡萄糖产率的计算公式求得样品中氨基
葡萄糖的产率，结果见表5；
式中：m1是由标准曲线计算得出盐酸氨基葡萄糖的含量，单位是μg/ml；m2是壳聚糖样品的含量，单位是μg/ml；0.8309是盐酸氨基葡萄糖折算为氨基葡萄糖的系数。
表5反应48小时水解产率的比较结果(n＝3)
线性范围与检出限
在最佳实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的氨基葡萄糖对应的a，绘制标准曲线，结果表明，gah含量在3μg/ml-24μg/ml范围内与a存在良好的线性关系，线性回归方程为a＝0.0113c-0.0012，相关系数0.9943，方法线性范围宽，检出限0.9206μg/ml。