本发明涉及一种通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，属于大分子检测领域。
背景技术：
壳聚糖(chitosan)为甲壳素的降解产物。化学名称为聚葡萄糖胺(1,4)-2-氨基-2-脱氧-d-葡聚糖，是甲壳类(虾、蟹)动物、昆虫的外骨骼的主要成分，壳聚糖在自然界中分布广泛，属于高分子绿色材料。有关人类对壳聚糖的认识是从19世纪开始的，到本世纪60年代，对甲壳素/壳聚糖的研究才变得日益活跃。国际上，从1894年以来，已召开过6次有关甲壳素/壳聚糖的会议；亚洲也于1994年举办了首届甲壳素学术会议，现已举办2次。而我国只是在最近几年才对甲壳素/壳聚糖的开发及应用予以重视。1996年10月在大连召开了第一届甲壳素化学学术会议。壳聚糖及其衍生物在食品、医药、环保、化工等行业有着广阔的应用前景。壳聚糖具有很好的生物相容性和生物活性，无毒、无害、无免疫抗原性，对人体具有强化免疫、抑制老化、预防疾病、促使疾病痊愈、调节生理机能五大功能。市面上的壳聚糖产品参差不齐，配方不一，壳聚糖所占的含量直接影响到其功能的发挥。因此，建立准确的定量分析方法，对保障产品质量的稳定性和可控性都至关重要。
目前，壳聚糖分析研究及测定的方法主要有分光光度法、荧光分析法、电化学法、红外光谱法测、液相色谱法、气相色谱法等。如韩美娜]等人研究建立荧光淬灭法测定壳聚糖凝胶膜中壳聚糖的含量，利用壳聚糖在pbs缓冲溶液中对异硫氰酸荧光素(fitc)具有明显的荧光淬灭作用，且荧光淬灭程度与壳聚糖的量在一定范围内呈线性关系，从而建立了荧光淬灭法测定壳聚糖含量。商军和王蓓两人建立高效液相色谱法测定原料和复合预混料中的低聚壳聚糖含量。谭学才，麦智彬等人建立了以茜素红(ar)为电活性探针间接测定无电活性的壳聚糖(壳聚糖)的新方法。由于壳聚糖自身容易降解，且紫外吸收较弱，实验中常采用酸水解间接比色法进行含量分析，此方法中常常用到浓硫酸，操作具有一定的危险性，并且不适合微量壳聚糖含量的分析检测。气相色谱法测定壳聚糖含量时往往需要在测定前对壳聚糖进行衍生化处理，操作较为复杂。hplc法用于壳聚糖含量测定时通常也是先将壳聚糖进行酸水解后再进行测定。这些酸水解或衍生化操作过程对壳聚糖含量的测定结果都会有较大影响，一些直接测定壳聚糖含量的方法逐渐受到关注。
基于此，本发明提供一种通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法。
技术实现要素：
为了克服现有技术中对于成品中壳聚糖的含量难以定量，操作技术繁琐的技术不足，本发明提供一种通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，本发明利用壳聚糖在弱酸性条件下，与诱惑红反应生成缔合物，用分光光度计在500nm处测定其吸光度较诱惑红有明显降低，且吸光度的降低值与壳聚糖的浓度成正比，以此作为壳聚糖的定量基础，建立了测定壳聚糖的褪色分光光度法，本方法测定受壳聚糖的分子量的影响，其具有试剂廉价，灵敏度高重现性好的优点，适合在实际应用中推广使用。
一种通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：
1)绘制△a和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线:
向10ml比色管中加入3.0ml一定浓度梯度的低分子壳聚糖标准溶液，加入1.5ml甘氨酸-盐酸缓冲溶液和2.5ml浓度为2.0×10-4mol/l的诱惑红溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，将其置于80℃水浴加热10min，冷却至室温后于紫外分光光度计上，在体系的最大褪色波长500nm处以水为参比测量吸光度；其中试剂空白记为a0，含壳聚糖的溶液记为a，并计算△a＝a0–a，建立△a与低分子壳聚糖浓度的标准曲线c1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立△a与中分子壳聚糖浓度的标准曲线c2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立△a与高分子壳聚糖浓度的标准曲线c3；
在最佳的实验条件下，考察该体系对不同分子量的壳聚糖的测定结果。分别考察了低分子量、中分子量和高分子量的壳聚糖。经过统计学分析，不同分子量的壳聚糖结果存在显著差异性，该方法测定壳聚糖含量受不同分子量的影响。
2)10μg/ml的样品工作液的制备：称取一定量待检测样品的胶囊壳，使用冰醋酸溶解并将其定容得到样品储备液，用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5ml于100ml容量瓶，定容，得浓度为10μg/ml的样品工作液。
3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)种检测方法绘制△a和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的△a和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；
4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1ml，按步骤1)实验方法进行测定，在500nm处测定其吸光度值a，并计算△a＝a0–a，将△a代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
如上所述的通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，所述的甘氨酸-盐酸缓冲溶液的ph为3.0，申请人通过实验发现，体系在ph＝3.0甘氨酸-盐酸缓冲溶液中灵敏度最高，δa值最大，另外申请人发现甘氨酸-盐酸具有较好的抗干扰作用，能掩蔽部分金属离子，故最佳缓冲溶液选择为ph＝3.0甘氨酸-盐酸缓冲溶液。
如上所述的通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，步骤1中溶液的加入顺序为首先加入壳聚糖标准溶液，其次加入甘氨酸-盐酸缓冲液，再次加入诱惑红溶液。
如上所述的通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，冷却至室温至测定的时间为10min-2h。
如上所述的通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，壳聚糖的浓度范围0.5μg/ml～4.5μg/ml
样品前处理：取待检测胶囊壳，称取一定量胶囊壳，使用冰醋酸溶解定容得到样品储备液，用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5ml于100ml容量瓶，定容，得浓度为10μg/ml的样品工作液；
用样品工作液按实验方法绘制样品曲线，与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的△a和壳聚糖浓度的标准曲线；
取样品工作液1ml，按实验方法进行测定，在500nm处测定其吸光度值a，并计算△a＝a0–a，将△a代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
试验例：
1.cts-诱惑红体系在波长500nm处的线性关系
图1为cts-诱惑红体系的在不同cts浓度下的吸收光谱图，其中以水为参比，体系在波长500nm处出现峰值，并且有明显的梯度变化，从上至下壳聚糖浓度(μg/ml)：0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，4.5，随着壳聚糖浓度增大，诱惑红有褪色的趋势，存在一定的线性关系。
2.不同缓冲液对于体系吸光度的影响
分别考察了的b-r缓冲溶液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，甘氨酸-盐酸缓冲溶液和乙酸-乙酸钠缓冲溶液4种缓冲溶液对体系吸光度的影响。按照实验方法，改变加入不同ph值的缓冲溶液，得到各个缓冲溶液的吸光度值。
结果见图2，加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液与甘氨酸-盐酸缓冲溶液的体系相对稳定，且δa值较大。根据缓冲范围，选择甘氨酸-盐酸缓冲液(ph＝2.5、3.0、3.5)、乙酸-乙酸钠缓冲液(ph＝3.8、4.0、4.2)为缓冲液各做标准曲线(见图3、4)。图3为以乙酸-乙酸钠为缓冲液的标准曲线，图4是以甘氨酸-盐酸缓冲溶液的标准曲线图。
可以看出，体系在ph＝3.0甘氨酸-盐酸缓冲溶液中灵敏度最高，δa值最大，另外申请人发现甘氨酸-盐酸具有较好的抗干扰作用，能掩蔽部分金属离子，故最佳缓冲溶液选择为ph＝3.0甘氨酸-盐酸缓冲溶液。
3.缓冲液的加入量对吸光度值的影响
缓冲溶液为实验体系提供合适的酸度结合环境，其加入量对离子缔合物的形成有着一定的影响，不改变其他实验条件，改变ph＝3.0的甘氨酸-盐酸缓冲溶液的加入量为1.0，1.5，2.0，2.5，3.5ml，测定其吸光度值。
图5为甘氨酸-盐酸缓冲液的加入量对于吸光度值的影响。结果看出，甘氨酸-盐酸缓冲溶液的加入量对该反应体系的影响较小，在加入量在1.0～3.5ml范围内，吸光度值变化较小，在1.5ml加入量时达到最大。故选择甘氨酸-盐酸缓冲溶液加入量为1.5ml。
4诱惑红加入量的影响
申请人发现，诱惑红的加入量直接影响着离子缔合物的形成，不改变其他实验条件，改变浓度为2.0×10-4mol/l的诱惑红的加入量为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml，测定其吸光度值。
图6为诱惑红的加入量对于体系吸光度的影响。结果看出，诱惑红的加入量对该反应体系有显著影响，当加入量大于2.5ml时△a呈下降趋势，故2.0×10-4mol/l的诱惑红最佳加入量为2.5ml。
5反应温度对于体系吸光度的影响
在实验条件下，考察了20～100℃不同温度对体系的影响，结果见图7，温度对对该反应体系的影响较小，吸光度值变化小。80℃达到最大δa值。且在该反应温度下，重现性较好，故体系最佳温度为80℃。
6加热时间对于体系吸光度的影响
在实验条件下，考察了加热时间对体系的影响，结果见图8。80℃水浴加热10min条件下δa值(绝对值)较大。故体系的最佳加热时间为10min。
7增敏剂对于体系吸光度的影响
在实验条件下，探究了五种增敏剂(op-10、吐温20、吐温80、聚乙烯醇、sds)对体系的影响，结果见图9。所探究的增敏剂均对体系反应无增敏作用，因此不加入增敏剂。
8试剂加入顺序对于体系吸光度的影响
在实验条件下，考察了染料诱惑红，甘氨酸-盐酸缓冲液，壳聚糖的3种不同的加入顺序对体系吸光度值的影响。结果见表2，图10，最佳加入顺序为“壳聚糖标准溶液+甘氨酸-盐酸缓冲液+诱惑红溶液”，此时体系的δa值最大，灵敏度最高且重现性最好。
表1试剂加入顺序对于体系吸光度的影响
9.稳定时间对于体系吸光度的影响
在较优实验条件下，考察体系的稳定时间，考察时间2h，水浴加热后冷却至室温，每隔一段时间测其吸光度值，半小时内每隔10min测一次，半小时后两小时内每隔20min测一次。结果如图11，体系在10min内即可达到稳定，2h内可保持稳定的吸光度值不变。
10.离子强度对于体系吸光度的影响
以nacl(0.005～0.3mol/l)考察离子强度对体系的吸光度值的影响。结果见图12，nacl浓度在0-0.005mol/l内对反应基本没有影响；在0.005mol/l后，体系的δa值随离子强度的增加而呈不规则的升高，可能是在高浓度时nacl与该体系结合在一起使δa值增大。因此，nacl的浓度小于0.005mol/l的时候对实验没有影响。
本发明与现有技术相比具有如下技术优势：
1)线性好、检出限低：在最佳实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的壳聚糖对应的△a，绘制标准曲线，结果表明，壳聚糖在浓度0.5μg/ml～4.5μg/ml范围内与△a存在良好的线性关系，检出限0.4987μg/ml。
2)本方法测定受壳聚糖的分子量的影响，在实际样品测定中，需考虑采用相近分子量的标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高重现性好的优点。
附图说明
图1为cts-诱惑红体系的在不同cts浓度下的吸收光谱图。
图2不同缓冲液对于体系吸光度的影响图。
图3为以乙酸-乙酸钠为缓冲液的标准曲线。
图4是以甘氨酸-盐酸缓冲溶液的标准曲线图。
图5为甘氨酸-盐酸缓冲液的加入量对于吸光度值的影响。
图6为诱惑红的加入量对于体系吸光度的影响。
图7反应温度对于体系吸光度的影响。
图8加热时间对于体系吸光度的影响。
图9增敏剂对于体系吸光度的影响。
图10试剂加入顺序对于体系吸光度的影响。
图11稳定时间对于体系吸光度的影响。
图12离子强度对于体系吸光度的影响
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述发明并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例
一种通过褪色分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：
1)绘制△a和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线:
向10ml比色管中加入3.0ml一定浓度梯度的低分子壳聚糖标准溶液，加入1.5ml甘氨酸-盐酸缓冲溶液和2.5ml浓度为2.0×10-4mol/l的诱惑红溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，将其置于80℃水浴加热10min，冷却至室温后于紫外分光光度计上，在体系的最大褪色波长500nm处以水为参比测量吸光度；其中试剂空白记为a0，含壳聚糖的溶液记为a，并计算△a＝a0–a，建立△a与低分子壳聚糖浓度的标准曲线c1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立△a与中分子壳聚糖浓度的标准曲线c2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立△a与高分子壳聚糖浓度的标准曲线c3；结果见表2。
表2不同分子量的壳聚糖标准曲线
2)10μg/ml的样品工作液的制备：将澳利维甲壳素胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100ml容量瓶中，用0.5mol/l冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5ml于100ml容量瓶，定容，得浓度为10μg/ml的样品工作液。
3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)种检测方法绘制△a和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的△a和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；
用样品工作液按实验方法绘制样品曲线，与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，结果为样品的线性回归方程是△a＝0.0459c+0.0097，相关系数0.999，结果与低分子量的壳聚糖标准曲线接近，采用低分子量壳聚糖的标准曲线作为定量标准曲线。
4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1ml，按步骤1)实验方法进行测定，在500nm处测定其吸光度值a，并计算△a＝a0–a，将△a代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
取样品工作液1ml，按实验方法进行测定，在500nm处测定其吸光度值a，并计算△a＝a0–a，将△a代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。结果为：海澳利维甲壳素胶囊中壳聚糖的含量1095mg/g，rsd为3.97％。加标回收率见表3。
表3样品分析结果
在实验中，于10ml的比色管依次加入3.0ml浓度为10μg/ml的壳聚糖溶液，1.5mlph＝3.0的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，以及2.5ml浓度为2.0×10-4mol/l的诱惑红溶液，用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，置于80℃水浴加热10min，冷却至室温。于u-3010型紫外分光光度计上，在体系的大褪色波长500nm处以水为参比，测量吸光度，于2h内测完。其中试剂空白记为a0，含壳聚糖溶液记为a，并计算△a＝a0–a。壳聚糖在浓度0.5μg/ml～4.5μg/ml范围内与a0存在良好的线性关系，检出限为0.4987μg/ml。本方法测定受壳聚糖的分子量的影响，在实际样品测定中，需考虑采用相近分子量的标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高重现性好的优点。
3.3线性范围与检出限
在最佳实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的壳聚糖对应的△a，绘制标准曲线，结果表明，壳聚糖在浓度0.5μg/ml～4.5μg/ml范围内与△a存在良好的线性关系，线性回归方程为△a＝0.0336c-0.0097，相关系数0.9981，检出限0.4987μg/ml。