一种测量流体延迟发光的装置的制作方法

本发明涉及光致发光的测量方法，该方法可以用于相关的设备仪器的设计和制造中，可以用于延迟发光的测量和成像。属于光学仪器制造领域。

背景技术：

在光致发光现象中，分子受光照激发跃迁到激发态，激发态的分子可通过释放光子回到基态，即分子的荧光或磷光。分子的激发态存在寿命，即激发态的分子要在过一段时间之后才释放光子回到基态，且不同分子的激发态寿命各不不同，分子激发态寿命越长，其发光持续时间越长。通常情况下，分子的荧光寿命在纳秒级，磷光寿命可以达到微秒级以上。延迟荧光分子，其寿命也可以达到微秒级甚至毫秒级。近些年发展的一些磷光分子，寿命可以达到秒级。此外一些无机纳米材料，其寿命在毫秒级以上。这些长寿命的发光统称为延迟发光，也被称为辉光。

在荧光和磷光的测量中，一般需要构建两个光路：光路一是激发光路，即激发光照射样品的光路，其目的是使样品中的分子受光照激发；光路二是探测光路，即样品发光到达探测器的光路，其目的是探测样品发光的光谱、强度等信息。

两条光路相交于同一点，将样品置于该交点上，以探测样品的荧光和磷光。

在稳态的测量过程中，光路一和光路二同时打开，即激发光一直照射样品的条件下测量，这种方式可以获得样品发光光谱和强度的信息，但是不能得到样品激发态寿命的信息。

为了测量样品延迟发光的信号，通常需要在关闭激发光路之后打开探测光路，即在停止激发后，测量样品的发光。基于这样的思路，人们发展了许多测量延迟发光的方法和仪器。（参考专利公开说明书CN201310392018.6、CN200510092520.0、CN201180017387.6、CN201110005032.7等。）其中比较常用的方法是采用脉冲光源，一个周期中，光照时间很短，其余时间的发光信号即为延迟发光信号；利用时间相关的单光子计数器可探测样品发光强度随时间变化的曲线。另外一种常用的方法也是采用脉冲光源，用具有门控功能的CCD探测延迟发光信号。

还有一种常用的方法，利用斩波器控制其中一个或两个光路的开关时间，以达到探测延迟发光信号的目的。（参考文献Biophysical Journal 1994, 67, 957-965、Biophysical Journal 1998, 74, 2210–2222、Anal. Chem. 2011, 83, 2294-2300、CN205484048U等。）由于许多样品的发光寿命在毫秒以下，因而两个光路开关需要精确的时间控制，为此，许多瞬态光谱仪和时间分辨的成像装置采用TTL调制、脉冲发生器、延时发生器等控制两个光路的开关时机。此外，为了避免杂散光干扰，还需要光源的脉冲、探测器快门、斩波器控制等都具有较高的时间分辨率。

上述各种零部件的添加增加了仪器的复杂度，此外许多高时间分辨率的零部件价格非常高，如皮秒激光器、高速相机、单光子计数器、高精度的TTL控制器等。

为了简化仪器并降低成本，专利US6839134B2、CN205080051U和CN106066317A公开了使用一个斩波器同时控制激发光路和探测光路的方法，不使用激光器、高速相机、TTL控制也可以实现延迟发光的探测。该方法具有一定的适用性，然而为了获得高的时间分辨率，斩波器的通光孔要尽量狭窄，这直接降低了激发光的光通量，也就降低了发光信号。此外，针对一些特殊的样本或装置，增加斩波器的同时还需要改变光路才能实现延迟发光的探测。

流体样本的荧光测量在色谱、微流控芯片、流式细胞仪等领域具有重要的应用。在以往的微流管道样本测量中，激发光路和探测光路都聚焦于微流管道的同一点，主要用于非延迟的荧光测量（专利CN105917211A），为了测量样本的延迟发光，需要对激发光路进行脉冲控制，对探测进行延迟控制（专利US20100032584A1、CN106053786A），这样的方法不仅增加了仪器的复杂程度，还降低了测量效率。

技术实现要素：

为了进一步简化仪器，以更加便捷的测量延迟发光的信号，本发明构建了不同于传统思路的测量方法。在以往的方案中，激发光路和探测光路相交或聚焦于同一点，样品需置于该交点上进行测量，这种方式必须使用脉冲、快门分别控制激发光路和探测光路才能测量样品的延迟发光。

为了省略脉冲和快门控制，本发明采用的方法是：

构建激发光路和探测光路，使两条光路不相交，这样，当样品在激发光路上的时候，其发光不在探测光路上；当样品在探测光路上的时候，激发光不能照射样品；

在延迟发光的测量中，移动样品，使样品先位于激发光路上，再转移到探测光路上，这样就可以探测样品的延迟发光信号。

其中，激发光路和探测光路可参考现有的技术构建，激发光路包含光源，探测光路包含探测器，还可以根据需要，在光路上设置狭缝、光阑、棱镜、光栅、滤光元件、透镜、光纤等光学元件。

该方法测量延迟发光的原理显而易见：当样品位于激发光路上，样品的荧光或磷光被激发，由于激发光路和探测光路不相交，因而，非延迟的发光不会被探测到；再将样品转移到探测光路上，由于转移需要经历一段时间，因而探测的是延迟的发光信号；其中：该方法中的转移指的是改变样品相对于光路的位置，既可以是转移样品，也可以是转移光路；该转移过程经历的时间就是延迟时间，延迟时间的长短与移动的相对距离和相对速率有关。

该方法探测延迟发光的优势显而易见：不需要对光源进行脉冲控制，省略了TTL控制、脉冲发生器、斩波器等设备，任何稳态的光源都可以作为激发光源；不需要对探测器进行时间、快门控制，省略了斩波器、快门等附件；在一些情况下，不需要周期性激发、延迟、测量的过程，只要重复移动样品或光路、增加曝光时间即可增强探测信号。

本方法适用于流体样本的测量。流体样本包括：液体、气体和等离子样本。其中液体样本包括纯净物液体、溶液、悬浮液、胶体，气体样本包括均相的气态样本、蒸汽样本、气溶胶样本等。

以液体样本为例，具体测量中，液体样本匀速经过某管道，激发光路聚集于管道的上游某处，使该处的样本被激发，探测光路聚焦于管道下游某处，使该处的样本发光可以被探测器检测，这样样本从管道的上游流至管道的下游的过程中，经过了激发，延迟，测量的过程，因而该方法可探测流体样本的延迟发光。

相对于其它时间分辨的流体测量装置，该方法不需要脉冲快门调制，不需要额外添加任何附件，简化了仪器，并降低了成本。此外，通过控制流速或改变光路聚焦的位置可以改变延迟时间，相对于调控快门，这种方法简单易于实施。

在这样的流体测试装置中，含有管道、激发光路和探测光路，其中激发光路聚焦于管道上一点A，探测光路聚焦于管道上另外一点B，样品流经管道，先经过点A，再经过点B，则该系统可以探测管道内流体样品的延迟发光。

优选的，该装置还包括一个泵，将流体样本以恒定速率注入管道，通过泵控制流体的速率可以调节延迟时间。

优选的，可以将流体样本循环注入管道，延长探测的曝光时间可以增强检测信号强度。

优选的，该装置中，激发光路和探测光路聚焦的位置可以移动或调节，通过移动或调节激发光路和探测光路聚焦的位置可以调节延迟时间。

优选的，该装置含有两条或两条以上的探测光路，每个探测光路聚焦于管道上的不同点，样本依次流经各点，各个光路可以同时探测不同延迟时间的发光信号。

在上述所有方案中，如果探测光路包括色散元件和探测器，其中色散元件选自棱镜或光栅，探测器选自线阵CCD或CMOS传感器，则该装置可用于探测延迟发光的光谱。

该方法中，样品从A点到B点的时间为延迟时间，即从A到B所经过的距离除以样品的流速的值。在经过距离不变的情况下，调节流速即可调节延迟时间。在单位时间通过管道某横截面的样品体积不变的情况下，样品的流速与横截面积成反比，当液体以1微升/秒通过管道时，若管道横截面为边长10微米的正方形，则样品的流速为10米/秒，若从A到B所经过的距离为1厘米，则延迟时间为1毫秒，该系统可以测量毫秒的延迟发光信号。如果进一步提高流速，并缩短AB的距离，则延迟时间可以缩短到微秒级，可以满足大多数磷光、延迟荧光材料的检测。

在上述所有方案中，流体管道不限于直线式，可以是曲折式、弯曲式。

实际的流体样品往往是非均相，如血液样本中含有细胞，空气、河水中含有固体颗粒，因而流体样本的延迟发光可能源于样品中的溶质或悬浮颗粒，借助上述微流测试系统，可以测量这些溶质或悬浮颗粒的延迟发光。

此外，许多有机化合物或纳米材料的荧光和磷光往往需要溶解或悬浮于液体中测量，这些化合物或纳米材料的延迟发光也可以在上述微流系统中测量。

流体样本的荧光测量在色谱、微流控芯片、流式细胞仪等领域具有重要的应用，因而该方法用于上述领域具有积极的作用。本方法充分利用流体的流动性，在传统测量设备基础上，只需要改变光路的位置即可实现延迟发光的测量。

例如，在流式细胞仪的应用中，使激发光路和探测光路分别聚焦于流动室微流管道的上下游的不同点，即可以实现对细胞延迟发光的高速探测。

探测过程大致如下：微流管道中每次通过一个细胞，细胞进入管道后在管道上游受光照激发，当该细胞流到下游的时候，经过了一段延迟时间，再被探测器收集的发光信号即为延迟发光信号。

其中，细胞在管道的速度跟延迟时间直接相关。

现有的大多数商业流式细胞仪检测细胞的速度可以达到1000个/秒，有的每秒可检测上万个细胞，按照同样的分选速度，单个细胞流过管道的时间不超过1毫秒，因而这个方法可以检测延迟时间在毫秒级甚至更短延迟时间的发光信号。

从该测试的原理可知，该方法可以搭配任意的稳态光源使用，如汞灯、氙灯等，相对于使用单一波长的脉冲激光器，其激发波长可以使用光栅调节，范围覆盖广，可以测试不同激发波长的物质，大大降低了成本。该方法也可以搭配大功率的近红外激光器，如980nm、808nm等，可以用于上转换材料或近红外发射材料的时间分辨的流体检测。

附图说明

图1为测量流体延迟发光的示意图，101为管道，102为流体样品，103为透镜，104为透镜，105为探测器。

图2为测量流体延迟发光光谱的示意图，201为管道，202为流体样品，203为透镜，204为透镜，205为反射光栅，206为探测器。

图3为测量流体延迟发光的示意图，301为管道，302为流体样品，303为透镜，304为透镜，305为反光镜，306为透镜，307为探测器。

图4为用光纤测量流体延迟发光的示意图，401为管道，402为流体样品，403、404、405、406为光纤，407、408、409为探测器。

图5为测量曲折管道中流体发光的示意图，501为管道，502、503、504为光纤。

图6为流式细胞仪流动室光路示意图，601为管道，602为流体样品，603为激光器，604、606、613为透镜，605、610、611、612、617、618、619为探测器，607、608、609、614、615、616为二向色镜。

具体实施方式

为了说明本发明的原理以及其优势，下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。 在实际应用中，可以根据具体情况实施最合适的方案。

实施实例1 ，流体延迟发光的测量。

如图1所示，管道101中的流体样本102匀速流动，激发光经过透镜103会聚于管道101上A1处，激发该处的样品，其下游B1处的样品发光经过透镜104会聚于探测器105中。其中B1处没有激发光通过，因而该处的样品发光源于样品在A1处受激发后再流经B1处的延迟发光，延迟时间为样品从A1到B1的时间。

该方法使用的是稳态光源，不需要脉冲和快门控制，成本低廉，只要流体样品一直匀速经过管道101，通过增加激发光强和探测器的曝光时间，可以提高检测信号强度。

实施实例2 ，流体延迟发光光谱的测量。

如图2所示，管道201中的流体样本202匀速流动，激发光经过透镜203会聚于管道201上A2处，激发该处的样品，其下游B2处的样品发光经过透镜204后转为平行光，经过光栅205反射后色散为不同波长的光，照射在探测器206上。该装置测量延迟发光的原理与图1中相同，不同的是，采用了色散元件，优选的，探测器206为线阵CCD或CMOS传感器，可以探测延迟发光的光谱。

实施实例3 ，延迟时间可调的流体测量装置。

如图3所示，管道301中的流体样本302匀速流动，激发光经过透镜303会聚于管道301上A3处，激发该处的样品，其下游B3处的样品发光经过透镜304后转为平行光，经过反光镜305反射，再经过透镜306会聚到探测器307中。该装置测量延迟发光的原理与图1中相同，其中，透镜304和反光镜305可以沿着管道301方向平行移动，通过这种移动可以使探测光路聚焦于管道301上的任意一处，在流速不变的情况下，不同位置的发光信号具有不同的延迟时间。

实施实例4 ，用光纤测量流体延迟发光。

如图4所示，管道401中的流体样本402匀速流动，激发光经过光纤403照射于管道401上A4处，激发该处的样品，其下游的样品延迟发光经过光纤404、405、406分别到达探测器407、408、409。

相对于透镜，光纤体积小，便于实现多点检测，图中多个探测器分别探测不同位置的发光信号，由于延迟时间和位置线性相关，因而，比较多个点的光强信号可以获得发光强度随时间的变化信息，即该方法可以测量延迟发光的寿命。

从原理可知，该方法不限于图中的三根探测光纤，增加光纤探测的点，可以获得更多的延迟发光信息。

实施实例5 ，曲折管道流体的延迟发光探测。

如图5所示，流体样本在管道501中匀速流动，激发光经过光纤502照射于管道501上A5处，其透射光经过光纤502可被探测器探测，可以获得样品的吸收光谱信息，管道下游的B5处样品发光经过光纤503可被探测器探测，可以获得延迟发光信息。

曲折的微流管道在实际的应用较广泛，通过设计合理的管道形状，可以降低流体散射光的干扰。按本发明的原理，该方法可以用于其它非直线型的管道流体测量中。

本方法适用于液相色谱的延迟发光探测。

实施实例6，流式细胞仪中延迟发光的探测。

该方法可以应用于流式细胞仪中，探测颗粒的延迟发光信号。

如图6所示，微流管道601中的流体样品602向下流动，激光器603照射在管道601中的A点，构成激发光路；样品在A点受光照激发，其背向散射光经过透镜604会聚于探测器605中，为第一探测光路；A点发出的荧光经过透镜606，会聚于二向色镜607的方向，其中二向色镜607、608、609为长波通二向色镜，截止波长依次增大，各二向色镜将截止波长以下的光分别反射至探测器610、611、612中，构成第二探测光路；位于A点下方的B点发出的光经过透镜613，会聚于二向色镜614的方向，其中二向色镜614、615、616为长波通二向色镜，截止波长依次增大，各二向色镜将截止波长以下的光分别反射至探测器617、618、619中，构成第三探测光路。

该装置中，激发光路和第一、二探测光路为经典流式细胞仪流动室的光路结构，用于颗粒稳态发光的探测。第三激发光路聚焦于激发光照射不到的B点，可以探测流体的延迟发光，原理与前面的实例相同。

从原理可知，该装置可以同时探测样品的非延迟发光和延迟发光，不需要脉冲、延迟控制。流速越快，延迟时间越短，越有利于检测延迟发光信号，同时提高了分选效率。

优选的，该装置中的探测器为光电倍增管。

如果只是为了测量延迟发光，可以省略第一、二探测光路。

将该装置用于流式细胞仪，可以避免细胞自荧光的干扰。相对于现有的时间分辨测量方法，该方法成本低廉、操作简单。

此外，实例1到实例6中的所有装置中，可以改变延迟发光的探测方向，还可以增加延迟发光的探测光路，以获得更多的延迟发光信息。还可以根据具体需要，在光路上添加狭缝、光阑、光栅、透镜、滤光片、分光片、衰减片等，还可以增加二向色镜、棱镜、反光镜或光纤以改变光路的方向，以增强检测的信噪比。