一种对虾白斑综合症病毒免疫胶体金快速检测试剂盒的制作方法

本实用新型涉及一种对虾白斑综合症病毒免疫胶体金快速检测试剂盒。

背景技术：

对虾白斑综合症(White Spot Syndrome，简称WSS)是由白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virum，简称WSSV)引起的一种对虾传染性疾病，该病的发病特征为死亡率高，死亡快。常见的症状：濒死的虾先是在表皮处出现圆形的白色颗粒或白斑(有些患病虾群变红或粉红)，然后患病虾会出现嗜睡、体色变红或变黄，或者聚集在池塘边，摄食量急剧减少，并出现较高的死亡率。病理学判断时通过以下三种方式：用鳃和表皮压片能看到肥大的核，或用暗视野观察血淋巴异常凝集，或靶组织的组织切片中看到包涵体。联合国粮食与农业组织(FAO)将该WSS和对虾黄头病以及对虾桃拉综合症并称为“影响世界对虾养殖的三大病害”。WSS还被列入了世界动物卫生组织(OIE)水生动物疫病名录。

WSSV是全世界养殖对虾中危害最为严重的对虾病毒病。WSSV除了能感染大多数对虾品种之外，还能感染其它非对虾种类，如端足类、介形类、蟹类、桡足类、水蝇类等甲壳纲动物。这些甲壳纲动物在生态系统可充当WSSV传播的中间宿主，给养殖对虾及野生甲壳纲动物资源构成严重威胁。对于我国而言，WSSV是影响国内对虾养殖业快速发展的主要瓶颈之一。在2008年我国农业部第1125号公告《一、二、三类动物疫病病种名录》中，WSSV 被划为一类动物疫病。鉴于目前尚未发现有效的治疗方法，快速准确的病原分离检测技术已成为各国学者研究的焦点。

目前，WSSV的检测方法主要有：肉眼观察法，传统组织学方法，电镜观察法，生化检测、免疫学方法，细胞培养法，分子生物学法。应用免疫学、分子生物学等技术手段研究开发的水生动物病原性疾病快速检测试剂盒可在几分钟到几小时内快速准确的诊断出水产病害，比较适合基层病害防控人员使用。当前，国外已建立了多种水产动物病毒、细菌等病原的快速检测方法，欧洲希腊生物公司开发销售的假结核性巴氏杆菌病检测试剂盒，利用ELISA 技术，凭肉眼观察即可判定检测结果；美国生物研发的可同时检测对虾BP、HPV、IHHNV、 MBV、NHP、WSSV的试剂盒，及检测对虾TSV、YHV的试剂盒。近10年来，我国对一些重大疾病病原的快速检测技术进行了较深入的研究，在种类、技术水平、易用性等方面达到或接近国际先进水平。包括建立KHV、IHHNV、TSV及同时区分WSSV不同地理毒蛛的同步PCR等快速检测技术，研制了嗜水气单胞菌、对虾病毒WSSV、对虾TSV等检测试剂盒等。我国WSSV的检测标准主要参考我国出入境检验检验标准(SN/T 1151.2-2011)，该标准规定了对虾白斑病的PCR、斑点杂交和原位杂交三种检测方法。然而不管是试剂盒还是出入境检测标准规定的检测方法，对于基层工作人员来说仍然过于复杂，难以操作，往往还需要送至专业的检验部门或实验室进行检测。因此开发一种检测WSSV的胶体金快速检测试剂盒成为了简化WSSV检测的新途径。

技术实现要素：

本实用新型提供一种灵敏度高、检测时间短、操作方便的对虾白斑综合症病毒免疫胶体金快速检测试剂盒。

一种对虾白斑综合症病毒免疫胶体金快速检测试剂盒，包括：塑料外壳和外壳内的试纸条，其特征在于，所述塑料外壳上壳体设有加样口和观察窗，所述试纸条包括背衬及首尾相接黏贴于背衬上的样品垫、金标抗体结合垫、层析膜和吸水垫，相接处有0.2～0.3cm的重叠，所述样品垫位于加样口的下方，所述层析膜位于观察窗的下方，所述层析膜上包被相互平行的检测线和控制线。

所述背衬由PVC板制成，样品垫由玻璃纤维制成，金标抗体结合垫可由玻璃纤维或聚酯膜制成，层析膜可由硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜或聚四氟乙烯膜制成，吸水垫由滤纸制成。

所述金标抗体结合垫上喷有抗WSSV单克隆抗体的胶体金标记蛋白。

所述检测线包被抗WSSV单克隆抗体，控制线包被二抗。

所述金标抗体结合垫上的抗WSSV单克隆抗体与检测线上的抗WSSV单克隆抗体在 WSSV上有不同的结合位点。

所述二抗可为羊抗鼠IgG、兔抗鼠IgG。

本实用新型采用双抗体夹心免疫层析原理。由金标抗WSSV单克隆抗体(金标抗体)同待测样品液中的抗原反应，形成金标抗WSSV单克隆抗体-WSSV抗原复合物。当该复合物层析至层析膜上检测线时，预先包被在检测线上的另一种抗WSSV单克隆抗体(包被抗体)会识别该复合物中的抗原。反应的结果便形成金标抗体-WSSV抗原-包被抗体的夹心结构，最终使金标抗体上的胶体金颗粒在此固定并累积至出现肉眼可见的红色线。未反应的金标抗体则仍继续层析前行，当达到预先包被在控制线二抗处时被结合住，从而在此处出现由胶体金颗粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色线。结果是：检测线显色表示WSSV阳性；检测线不显色，表示WSSV阴性，即检测样品中不含WSSV或是WSSV含量极低；控制线显色，表示试剂盒有效；控制线不显色，说明试剂盒失效，即金标抗体或是二抗失活，检测结果无效。

本实用新型具有如下有益效果：

灵敏度高，本试剂盒检测限为1mg/kg；特异性高，假阴性率和假阳性率均低于5％；检测时间约30min，检测结果均可用肉眼判断；制备方法简单、稳定性高、重复性好。

附图说明

图1为对虾白斑综合症病毒免疫胶体金快速检测试剂盒剖视图，其中1为塑料外壳，2 为加样口，3为观察窗，4为背衬，5为样品垫，6为金标抗体结合垫，7为层析膜，8为检测线，9为控制线，10为吸水垫，11为不干胶。

图2为对虾白斑综合症病毒免疫胶体金快速检测试剂盒俯视图，其中2为加样口，3为观察窗，8为检测线，9为控制线。

图3为对虾白斑综合症病毒免疫胶体金快速检测试剂盒的结果读取示意图，其中T为检测线，C为控制线；图3-a中T线与C线均显色，为阳性；图3-b中只有C线显色，为阴性；图3-c中T线与C线均消失，为无效。

具体实施方式

实例一对虾白斑综合症病毒免疫胶体金快速检测试剂盒的制备

1样品垫处理

将玻璃纤维素膜用1％BSA(w/v)，1％Tween-20的(w/v)PEG4000的PBS(0.015M， pH＝7.4)均匀浸泡2h，37℃下烘干2h，放置于干燥环境保存备用。

2金标抗体结合垫制备

2.1胶体金溶液的制备

胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在100mL去离子水中加入1mL 1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入1mL 1％氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4℃下保存备用。

2.2金标抗体的制备

取15μg抗WSSV单克隆抗体加入到1mL胶体金溶液中，缓慢搅拌1min，加入1％牛血清白蛋白，4℃过夜；然后将其在4℃下，18000g离心110min；取离心沉淀，用含有1％牛血清白蛋白，0.02％叠氮钠，0.5％吐温-20的0.01M PBS重悬，4℃保存备用。

2.3金标抗体喷膜

将上述金标抗体储液用定量喷膜仪以3μL/cm的流速均匀喷涂于结合垫上，37℃烘干，4℃避光干燥保存。

3层析膜制备

参照图1，用定量喷膜仪把适当浓度的抗WSSV单克隆抗体与羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37℃烘箱干燥8h。

4对虾白斑综合症病毒免疫胶体金快速检测试剂盒的组装

参照图1，以PVC板为背衬，在其上用不干胶按顺序粘上样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。用切割机切割成3.00mm宽的试纸条，装入塑料外壳中制成检测试剂盒，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

实例二对虾白斑综合症病毒免疫胶体金快速检测试剂盒的操作方法

1样品处理

称取待检测虾鳃2g，加入0.01M PBS按1∶10(W/V)的比例混合，加少量石英砂用研钵研磨、匀浆1min，再沉淀5～10min，取上清液作为检测样品，待检。

2试剂盒使用方法

从包装袋中取出试剂盒，吸取待检样品溶液100μL滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在3-5min读取，其他时间判读无效。观察时，试剂盒水平放置于观察者正面。

3实验结果判断

观察窗中T线与C线均显色为阳性，表示检测样品中WSSV的含量高于检出限1μg/mL。如图3-a所示；观察窗中T线显色而C线不显色为阴性，表示检测样品中不含WSSV或是 WSSV含量极低。如图3-b所示；观察窗中未出现T线和C线，可能是操作不当或试剂盒已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂盒重新测试。如图3-c所示。

实例三检出限确定

1操作步骤

称取健康对虾(PCR检测无WSSV感染)的虾鳃2g，加入WSSV溶液至终浓度为0.25、 0.5、0.75、1.0、2.0、4.0mg/kg，再加入0.01M PBS按1∶10(W/V)的比例混合，加少量石英砂用研钵研磨、匀浆1min，再沉淀5～10min，取上清液作为加标检测样品，用实例一制备的试剂盒分别对其进行检测，阴性对照为0.01mol/L PBS溶液。每组设6个平行样。

2实验结果

实验结果如表1所示，检测线颜色呈梯度递增。在阴性对照及WSSV终浓度为0.25、0.5 mg/kg范围内，C线显色而T线不显色，且实验结果的稳定性好；0.75mg/kg浓度下C线与 T线条带显色，但实验结果的稳定性不好；1.0～4.0mg/kg范围内C线与T线显色且具有稳定性好的特点。实验结果表明，本试剂盒的WSSV检测限为1.0mg/kg。

表1对虾白斑综合症病毒免疫胶体金快速检测试剂盒检出限

^a浓度单位：mg/kg；^b显色程度：-代表不显色，+代表显色；^c稳定性：-代表不稳定，+代表稳定。