一种检测真菌毒素的侧流片的制作方法

本实用新型涉及检测检验技术领域，通过免疫化学中抗原抗体免疫反应借助于层析技术达到检测目的，具体地涉及一种检测真菌毒素的侧流片。

背景技术：

真菌，是一类有细胞壁，不含叶绿素，无根叶茎，以腐生或寄生方式生存，能进行有性或无性繁殖的真核微生物。真菌中最常见的是各类蕈类，另外还有霉菌和酵母。虽然真菌被广泛应用于食品工业，如酿酒、制酱、面包制造等，给人类生产生活带来益处，但有些真菌也能通过产生真菌毒素污染食品这一方式给人体健康带来危害。

真菌毒素是真菌产生的次生代谢产物，主要包括黄曲霉毒素、镰刀菌毒素等。最早在11世纪欧洲圣像画中就有关于真菌毒素引起中毒的描述，但直到1960年英国10万多只火鸡因饲用黄曲霉毒素污染的饲料而死亡的事件发生后，真菌毒素才被人们重新认识。受全球气候变暖、潮湿等因素的影响，食用和饲用农产品受真菌毒素污染日趋严重，长期食用真菌毒素污染食品，不但导致中毒而且引起三致，致癌、致奇，致突变，世界各地对于真菌毒素污染的报道日渐增多。

我国由于地理气候环境特点，加上人们意识举措不到位，真菌毒素污染更为严重，根据中国农科院农产品加工研究所统计，2001至2011年十年间，受真菌毒素污染的影响，我国出口欧盟食品违例事件达2559起，其中真菌毒素超标占28.6％，高于公众熟知的重金属、食品添加剂、农业残留等因素，在单一事件中比例最高。农科院加工所研究员刘阳认为，真菌毒素超标已成为我国农产品出口欧盟的最大阻碍，给我国粮油加工和出口企业造成了巨大经济损失。

真菌毒素检测的常用方法包括：薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、ELISA方法等。上述检测方法需要配合检测仪器使用，且检测时间较长，操作复杂，不便于现场检测。因此，本领域急需使用方便、结果可靠的检测真菌毒素的试剂和方法。

技术实现要素：

本实用新型的目的是提供一种使用方便、结果可靠的检测真菌毒素的侧流片。

在本实用新型的第一方面，提供了一种检测真菌毒素的侧流片，所述侧流片包括一检测卡，所述的检测卡包括背衬(0)，以及位于所述背衬上的从近端到远端的以下结构：样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(8)、检测区、质控区(6)、和吸收垫(7)；

并且所述的金标垫(2)包括：第一抗体负载区、第二抗体负载区和第三抗体负载区，其中，所述的第一抗体为胶体金标记的特异性针对黄曲霉素的抗体，所述的第二抗体为胶体金标记的特异性针对T2毒素的抗体，所述的第三抗体为胶体金标记的特异性针对玉米赤霉烯酮的抗体；

并且所述检测区包括：第一检测区(3)、第二检测区(4)和第三检测区(5)，其中，所述的第一检测区(3)包被有黄曲霉素的完全抗原，所述的第二检测区(4)包被有T2毒素的完全抗原，所述的第三检测区(5)包被有玉米赤霉烯酮的完全抗原。

在另一优选例中，所述的黄曲霉素的完全抗原是黄曲霉素与载体蛋白的偶联物。

在另一优选例中，所述的T2毒素的完全抗原是T2毒素与载体蛋白的偶联物。

在另一优选例中，所述的玉米赤霉烯酮的完全抗原是玉米赤霉烯酮与载体蛋白的偶联物。

在另一优选例中，所述载体蛋白选自下组：BSA、OVA、或其组合。

在另一优选例中，所述的背衬(0)为PVC板。

在另一优选例中，所述样品垫(1)为玻璃纤维。

在另一优选例中，所述吸收垫(7)为吸水纸。

在另一优选例中，所述的样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(8)、和吸收垫(7)粘贴于所述背衬上。

在另一优选例中，所述的样品垫(1)和金标垫(2)部分重叠。

在另一优选例中，所述的检测区设置在靠近金标垫(2)的一侧，且所述的质控区(6)设置在靠近吸收垫(7)的一侧。

在另一优选例中，所述侧流片还包括卡盒(9)，以及位于所述卡盒上的加样孔(10)和观察窗(11)。

在另一优选例中，所述的检测卡完全设置于卡盒(9)中，所述加样孔(10)对应于所述检测卡上的样品垫(1)，且所述观察窗(11)对应于所述检测卡上的检测区和质控区。

在另一优选例中，所述卡盒的长度为80-90.0mm，宽度为10-20mm，且高度为4-5mm。

在另一优选例中，所述侧流片的长度为60-70mm，且宽度为3-4mm。

在另一优选例中，所述质控区(6)包含第四抗体，所述第四抗体特异性结合于所述第一抗体、第二抗体和第三抗体。

在另一优选例中，所述的第一检测区(3)、第二检测区(4)、第三检测区(5)和质控区(6)位于硝酸纤维素膜(8)上。

在另一优选例中，所述侧流片用于检测食品或饲料中的真菌毒素。

在另一优选例中，所述食品包括奶、饲料、谷类、食用油和豆类。

在本实用新型的第二方面，提供了一种用于检测真菌毒素的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)一容器；以及

(ii)如本实用新型第一方面所述的检测真菌毒素的侧流片。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书。

应理解，在本实用新型范围内，本实用新型的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本实用新型一种优选例的检测卡的结构剖视图。其中，1为样品垫，2为金标垫，3为第一检测区，4为第二检测区，5为第三检测区，6为质控区，7为吸收垫，8为硝酸纤维素膜，0为背衬。

图2为本实用新型一种优选例的检测真菌毒素的侧流片的俯视图。其中，9为卡盒，10为加样孔，11为观察窗。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，意外地发现了一种检测食品中真菌毒素的侧流片。具体地，根据检测时显色位置的不同，该侧流片可同时快速检测多种真菌毒素，包括但不限于黄曲霉素、T2毒素和玉米赤霉烯酮，改变目前一个试剂只检测一种成分的现状。在此基础上，完成了本实用新型。

真菌毒素

真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害。

如本文所用，所述的“黄曲霉素”、“黄曲霉毒素”可互换使用，是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉(aspergillus flavus)、寄生曲霉(a.parasiticus)产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。

T2毒素(T2)是由多种镰刀菌产生的一种霉菌毒素。主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物及其制品，对人类健康及畜牧业构成了较大危害。T-2毒素主要影响血液，肝脏，肾脏，胰腺肌肉及淋巴细胞的功能，T-2毒素中毒后的一般临床症状为厌食、呕吐、腹泻、生长停滞、繁殖和神经机能障碍等。

玉米赤霉烯酮(Zearalenone)又称F-2毒素，它首先从有赤霉病的玉米中分离得到。玉米赤霉烯酮其产毒菌主要是镰刀菌属(Fusarium)的菌侏，如禾谷镰刀菌(F.graminearum)和三线镰刀菌(F.tricinctum)、黄色镰孢(Fusarium culmorum)、木贼镰孢(Fusarium equiseti)、半裸镰孢(Fusarium sernitectum)、茄病镰孢(Fusarium solani)等菌种。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其中玉米的阳性检出率为45％，最高含毒量可达到2909mg/kg；小麦的检出率为20％，含毒量为0.364～11.05mg/kg。玉米赤霉烯酮的耐热性较强，110℃下处理1h才被完全破坏。

如本文所用，所述的“待测真菌毒素”是指本实用新型的侧流条检测的真菌毒素，具体包括黄曲霉素、T2毒素和玉米赤霉烯酮。

检测方法和工作原理

为了便于理解本实用新型，给出本实用新型侧流片的检测原理。应理解，本实用新型的保护范围并不受该原理的影响或限制。

本实用新型采用竞争法免疫层析的原理，将黄曲霉素的完全抗原(第一复合物)、T2毒素的完全抗原(第二复合物)、以及玉米赤霉烯酮的完全抗原(第三复合物)分别固定于硝酸纤维膜上的第一检测区、第二检测区和第三检测区(固相抗原)，将胶体金标记的特异性针对黄曲霉素的抗体(第一抗体)、胶体金标记的特异性针对T2毒素的抗体(第二抗体)以及胶体金标记的特异性针对玉米赤霉烯酮的抗体(第三抗体)固定于金标垫，并按图1组成检测试条并装卡中。将待检样本通过加样孔加到检测卡一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合金标垫上的胶体金标记的第一抗体、第二抗体和第三抗体，再依次移动至第一检测区、第二检测区、第三检测区、质控区。如果样本中不含有待测真菌毒素，胶体金标记的第一抗体、第二抗体和第三抗体会分别被固定在硝酸纤维素膜上的第一复合物、第二复合物和第三复合物捕获，从而在第一检测区、第二检测区、第三检测区形成红色条带。如果样本中含有一定浓度某种待测真菌毒素，如含有黄曲霉素，金标垫上胶体金标记的第一抗体在被溶解后会先与样本中黄曲霉素结合，从而抑制第一抗体与硝酸纤维素膜上的第一复合物的结合，第一检测区的条带颜色将会减弱或者消失；第二抗体与第二复合物的结合、第三抗体与第三复合物的结合不会受到影响，第二检测区和第三检测区仍形成红色条带。如样本中同时含有两种或多种待测真菌毒素，如同时含有黄曲霉素、T2毒素和玉米赤霉烯酮，胶体金标记的第一抗体、第二抗体和第三抗体与硝酸纤维素膜上的第一复合物、第二复合物和第三复合物的结合均会受到抑制，第一检测区、第二检测区、第三检测区的条带颜色均会减弱或者消失。换言之，当待检样本中含有某种真菌毒素时，与之对应的抗体与检测区域的结合受到影响，对应的检测区域的带颜色会减弱或者消失。

本实用新型在硝酸纤维素膜的质控区设置有第四抗体，所述第四抗体特异性结合于所述第一抗体、第二抗体和第三抗体，无论待检样品中是否含有待测真菌毒素，胶体金标记的第一抗体、第二抗体和第三抗体总能与质控区的第四抗体结合形成红色条带，该条带是判定层析过程是否正常和检测板是否失效的标准，同时也作为定量分析中控制批间差的计算指标。

灵敏度

本实用新型的侧流片灵敏度如下，

黄曲霉素B1检测域值：2.5ug/l

T2毒素检测域值：100ug/l

玉米赤霉烯酮检测域值：60ug/l

侧流片的制造

在本实用新型中，所述侧流片的各组成元件(或组件)可选用本领域已有的材料制成。

背衬0可以用任何稳定的、无孔的材料制成，其强度应足以支承材料和粘于其上的各组成元件。因为许多测定用水作为扩散介质，因此背衬0较佳地是基本上不透水的。在一个优选例中，背衬0是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的(如PVC胶板)。

样品垫1可用任何吸收性材料制成。可使用的材料例子包括：纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜。

吸收垫7可以用任何能吸收作为样品和缓冲液的液体的材料制成。吸收垫7的吸收能力应足够大，以便吸收添加至测试条的液体。适用于吸收垫7的材料的例子包括纤维素和吸水滤纸。

抗体

第一抗体、第二抗体和第三抗体均为胶体金标记的抗体，能够分别与黄曲霉素、T2毒素、玉米赤霉烯酮结合。

第四抗体同时结合第一抗体、第二抗体和第三抗体，优选的第四抗体为羊抗鼠IgG多抗。

本实用新型所用的抗体均为市售。

胶体金标记

胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白、多肽类等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。

免疫金标记技术(Immunogold labelling technique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。

在本实用新型侧流条的制备中，优选地，取40nm胶体金，用0.1M K₂CO₃调pH，以每毫升胶体金5μg抗体进行标记，标记液离心后得沉淀，沉淀用10mM pH7.2PBS溶解，并在650nm下测定吸光值OD，以1-3OD涂铺聚脂材料上并烘干，即为本实用新型检测卡中的金标垫。

侧流条的制备

本实用新型侧流片的各组成元件(或组件)采用本领域通用的技术方法制造和组装。

优选地，用包被缓冲液稀释第一复合物、第二复合物、第三复合物和质控抗体，将稀释后的四种捕获液分别均匀地包被于作为检测部件的硝酸纤维膜上，四种捕获液体渗入硝酸纤维素膜后分别形成第一检测区、第二检测区、第三检测区和质控区。

分别将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫通过粘合剂粘贴于背衬上。用切条机切成4mm的检测卡，置于卡盒内，加样孔对准检测卡样品垫位置，压紧后组装成检测试剂盒，加入干燥剂铝箔密封包装保存。

本实用新型的优点：

本实用新型所述的检测真菌毒素的侧流片克服了现有方法中需逐个检测不同种类真菌毒素的弊端，通过在同一侧流条上设置三个检测区，快速高效准确地特异性检测多种真菌毒素。

以下结合具体的实施例，进一步说明本实用新型。需理解，以下的描述仅为本实用新型的最优选实施方式，而不应当被认为是对于本实用新型保护范围的限制。在充分理解本实用新型的基础上，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，本领域技术人员可以对本实用新型的技术方案做出非本质的改动，这样的改动应当被视为包括于本实用新型的保护范围之中的。

实施例1

侧流片的结构

本实用新型的检测真菌毒素的侧流片(或测试条)包括卡盒和位于卡盒内的检测卡。

一种优选的检测卡的结构如图1所示，其包括背衬0，以及位于背衬上的：样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜8、检测区(或检测线)，包括第一检测区3和第二检测区4、第三检测区5、质控区6(或对照区、对照线、质控线)、和吸收垫7。

一种优选的卡盒9的结构如图2所示，其上包括加样孔10和观察窗11。并且，所述的检测卡完全设置于卡盒9中，所述加样孔10对应于所述检测卡上的样品垫1，且所述观察窗11对应于所述检测卡上的第一检测区3、第二检测区4、第三检测区5和质控区6

具体地，本实用新型的侧流片具有以下特点：

背衬0的长度与侧流片相同。

样品垫1位于测试条的一端，吸收垫7位于测试条的另一端。

金标垫2上负载有三种抗体，第一抗体为胶体金标记的特异性针对黄曲霉素的抗体，第二抗体为胶体金标记的特异性针对T2毒素的抗体，第三抗体为胶体金标记的特异性针对玉米赤霉烯酮的抗体，上述抗体均为市售。

检测区(也称检测线)位于样品垫1和吸收垫7之间，包括第一检测区3、第二检测区4和第三检测区5，优选地，第一检测区3位于靠近样品垫1的一端，通常检测区设置在硝酸纤维素膜8上，通过所述硝酸纤维素膜连接标记的金标垫2和吸水垫7。优选地，所述硝酸纤维素膜8上还设置有质控区6(也称质控线)，质控区6位于检测区和吸收垫7之间。

其中，所述的第一检测区3包被有黄曲霉素的完全抗原；所述的第二检测区4包被有T2毒素的完全抗原，所述的第三检测区5包被有玉米赤霉烯酮的完全抗原。质控区6包被有第四抗体，所述第四抗体特异性结合于所述的第一抗体、第二抗体和第三抗体。

实施例2

侧流片的使用

1.取5g以上有代表性的谷物样品粉碎(过20目筛)，本实施例以小麦为样品准确称取2g均匀粉碎试样加入到离心管中；向离心管中准确加入2ml稀释液1和乙酸乙酯8mL，将瓶塞盖紧密封，用力振荡5分钟，4000rpm离心1分钟；用吸管取2mL上清液到小玻璃杯中，吹干滤液，再量取0.4mL稀释液2复溶杯底固体。此溶解液即为检测液。

2.将检测卡平放，用滴管吸取待检样本溶液，垂直滴加3滴于加样孔中，加样后开始计时。

3. 5分钟内读取检测结果。

结果判断：

A：第一检测区、第二检测区、第三检测区和质控区同时变色(红色)，表明样本中不含待测真菌毒素或其浓度低于最低检测值，检测结果为阴性。

B:质控区变色(红色)，而第一检测区、第二检测区和第三检测区不变色，表明样本中同时含有黄曲霉素、T2毒素和玉米赤霉烯酮，检测结果为阳性。

C：质控区和某一个或两个检测区变色(红色)，而其他检测区不变色，表明样本含有与不变色检测区相对应的真菌毒素，检测结果为阳性。

D：质控区不变色，无论检测区是否变色，均表明本次检测无效。

在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。