一种多指标一步荧光定量检测系统的制作方法

本实用新型涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种多指标一步荧光定量检测系统。

背景技术：

动脉粥样硬化(AS)是一种全身弥漫性的病理状态，可同时累及冠状动脉、颈动脉以及其他动脉，是冠心病、脑卒中以及其他阻塞性血管疾病的病理基础，而由动脉粥样硬化导致的心血管疾病是居民的首要致死原因，已成为重大的公共卫生问题。因此建立动脉粥样硬化的风险评估机制并对动脉粥样硬化性心血管疾病进行短期和长期的风险预测是挽救患者生病的关键所在。超敏C-反应蛋白(hs-CRP)和脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)被国内外多项指南共识推荐为预测心脑血管疾病的生物学标志物。

C-反应蛋白(CRP)，急性时相反应蛋白之一，是炎症标志物，其通过终末协调复合物(C5b-9)参与早期动脉粥样硬化形成。有研究证明在众多的炎症标志物中hs-CRP是低水平炎症的敏感标志物，是动脉粥样硬化性心血管疾病的独立危险因素。慢性炎症是动脉粥样硬化形成与扩展的一个重要病因，动脉内的轻微炎症是一个引发刺激、损伤、愈合的循环，在长达十年或几十年的进程中周而复始，形成斑块，其结果导致动脉狭窄或粥样斑块。因此，hs-CRP受到更多的关注，其在AS形成上有直接的致病作用。

脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)，可以水解氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)中的氧化磷脂，生成脂类促炎物质，进而产生多种致动脉粥样硬化作用。在动脉粥样硬化斑块中Lp-PLA2表达上调，并且在易损斑块纤维帽的巨噬细胞中强表达，因此高水平的Lp-PLA2可以特异性地反应血管壁周围炎症状态的存在，并且与斑块稳定性丧失以及最终破裂相关。众多临床研究表明，Lp-PLA2是冠心病、心肌梗死、脑卒中等急性心脑血管疾病的独立预测因子，并在年龄、性别、血脂异常、糖尿病、肥胖、生活方式与环境等传统危险因素的基础上提供了新的信息。检测血液Lp-PLA2的浓度能够准确预测心脑血管疾病高危人群发生不良事件的可能性，并有效评估治疗效果和患者的预后复发风险。

在现有的技术中，Lp-PLA2和hs-CRP这两种生物标志物的检测常用方法有两种：一种是用针对其中一个单一标志物的试剂盒分别检测，另一种是将多种待检标志物的抗体固定在同一张膜上从而实现同时检测，但是两种方法重前者操作步骤繁琐且检测费用高，后者在样本上行与不同抗体反应后在检测时极易发生光信号交叉干扰，导致测试结果不准确。这些缺陷也同时存在于很多两种或两种以上生物标志物的检测中。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种多指标一步荧光定量检测系统，用于解决现有技术中多指标检测的技术缺陷，本技术能实现例如Lp-PLA2和hs-CRP的一步定量检测，通过一次加样即可获得多指标检测结果，检测时间短，灵敏度高，精密度高，稳定性好。

为实现上述目的，本实用新型所提出的技术方案为：

一种多指标一步荧光定量检测系统，包括壳体和背衬板，所述背衬板上贴设有至少两组的检测单元，每组检测单元包含硝酸纤维素膜、吸收垫和结合垫，其中硝酸纤维素膜上设有检测线与质控线；所述硝酸纤维素膜与背衬板贴附，所述吸收垫和结合垫的一端分别搭接于硝酸纤维素膜的两端；每一组检测单元均以背衬板的平面中心为圆心呈放射状排列且互不接触，每一组检测单元的结合垫均靠近圆心，结合垫的另一端上方搭设能与所有结合垫搭接的样品垫；所述壳体包含扣合的上盖和下盖，所述下盖设有凹槽或U型凸起，所述背衬板固定于凹槽或U型凸起形成的固定区内，所述上盖对应硝酸纤维素膜的位置设有显示窗，对应样品垫的位置设有加样孔，上盖内侧还设有加固装置，用于进一步固定检测单元和样片垫。

进一步的，所述加固装置靠近显示窗和加样孔的两端，为了减少对检测结果的影响，加固装置优选为凸点或凸线。

进一步的，所述每一组检测单元均以背衬板的平面中心为圆心呈放射状对称排列且互不接触，优选2～8组，更优选为2～4组。

进一步的，各部分搭接处宽度为1～3mm，搭接处在此范围内，可以实现更为清晰的检测结果。

进一步的，所述壳体为圆形、正方形或长方形。

进一步的，所述加样孔高度为1～3mm；加样孔的截面形状为倒梯形，优选加样孔为倒锥型。

本实用新型所述荧光定量检测系统，通过在结合垫上喷涂不同的标记复合物和在检测线上包被不同的抗体，可以实现多种指标检测，检测结果互不干扰，结果准确且简单快捷。此外，通过壳体上下部的固定部件的设定可以使得样本试纸条上行更平稳均匀，从而让检测结果能够更准确。

本实用新型还提供一种更为具体的Lp-PLA2和hs-CRP的一步荧光定量检测系统，包括壳体和背衬板，所述背衬板上贴设有两组的检测单元，所述检测单元包含硝酸纤维素膜、吸收垫和结合垫，其中硝酸纤维素膜上设有检测线与质控线；所述硝酸纤维素膜与背衬板贴附、所述吸收垫和结合垫的一端分别搭接于硝酸纤维素膜的两端；检测单元以背衬板的平面中心为圆心呈放射状对称排列于同一直线上，每一组检测单元的结合垫均靠近圆心，结合垫的另一端上方搭设能与所有结合垫搭接的样品垫；所述壳体包含上盖和下盖，所述下盖设有凹槽或U型凸起，所述背衬板固定于所述凹槽或U型凸起形成的固定区内，所述上盖对应硝酸纤维素膜的位置设有显示窗，对应样品垫的位置设有加样孔，所述上盖内侧还设有加固装置；两个硝酸纤维素膜上的检测线分别包被有抗Lp-PLA2抗体及抗CRP抗体；两个硝酸纤维素膜上的质控线均包被有羊抗鼠IgG抗体；两个结合垫上分别喷涂有连接了抗Lp-PLA2抗体和抗CRP抗体的标记复合物。

进一步的，所述标记复合物的固相载体为胶体金、磁性纳米材料、量子点、纳米金属离子、上转发光材料、胶乳微球、稀土离子或者其他荧光微粒中的一种。

与现有技术相比，本实用新型的所述的Lp-PLA2和hs-CRP的一步荧光定量检测系统优点在于实现hs-CRP和Lp-PLA2一步定量检测，实现了两个项目的同时检测，检测方法简单并降低了检测过程中的信号干扰，此外，通过塑料外壳上下部的固定及加固设置使得样本试纸条上行更平稳均匀，从而让检测结果能够更准确、更特异的进行动脉粥样硬化性心脑血管疾病的早期诊断，并在患者的危险分层和预后判断等方面有着更高的指导价值。

附图说明

图1为本实用新型一种一步荧光定量检测系统的内部结构示意图。

图2为本实用新型一种一步荧光定量检测系统的整体结构示意图。

图3为本实用新型一种一步荧光定量检测系统塑料上壳内部结构示意图。

图4为本实用新型一种一步荧光定量检测系统塑料下壳内部结构示意图。

图5为本实用新型一步荧光定量检测系统检测单元排列示意图。

其中：1背衬板，2吸收垫A，3硝酸纤维素膜A，4结合垫A，5样品垫，6结合垫B，7硝酸纤维素膜B，8吸收垫B，9凸线型加固装置，10凸点型加固装置，11凸点型加固装置，12凸点型加固装置，13U型凸起；C1质控线，C2质控线，T1检测线，T2检测线，a加样孔，b显示窗，b1显示窗，b2显示窗。

具体实施方式

以下参考附图，对本实用新型予以进一步详尽阐述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。

实施例1

本实施例提供一种多指标一步荧光定量检测系统，包括壳体和背衬板1，所述背衬板1上贴设有至少两组的检测单元，每组检测单元包含硝酸纤维素膜3、吸收垫2和结合垫4，其中硝酸纤维素膜3上设有检测线T1与质控线C1；所述硝酸纤维素膜3与背衬板1贴附，所述吸收垫2和结合垫4的一端分别搭接于硝酸纤维素膜3的两端，具体可如图1所示。

每一组检测单元均以背衬板1的平面中心为圆心呈放射状排列且互不接触，如图5所示，每一组检测单元的结合垫均靠近圆心，结合垫4的另一端上方搭设能与所有结合垫4搭接的样品垫5；通过一次加样，即可实现多种不同检测指标的显示。

所述壳体包含扣合的上盖和下盖，如图4所示，所述下盖设有凹槽或U型凸起13，所述背衬板1可以固定于凹槽或U型凸起形成的固定区内，防止移动；如图2和图3所示，所述上盖对应硝酸纤维素膜3的位置设有显示窗b，对应样品垫5的位置设有加样孔a，上盖内侧还设有加固装置9，用于进一步固定检测单元和样片垫。

本实施例中加固装置的位置主要是通过按压作用使试纸条平整不移动，保证检测结果的精准，其位置可以靠近显示窗和加样孔的两端，如图3所示，为了减少对检测结果的影响，加固装置的形状优选为凸点型加固装置11或凸线型加固装置10。

本实施例中每一组检测单元优先选择均以背衬板1的平面中心为圆心呈放射状对称排列且互不接触，优选为2～8组，更优选为2～4组。

本实施例中各部分搭接处宽度可以为1～3mm，搭接处在此范围内，可以实现更为清晰的检测结果。

本实施例中所述壳体可根据检测单元的个数进行设计，可以如图5所示的圆形或正方形，也可以如图2所示的长方形。

本实施例中加样孔高度优选为1～3mm；加样孔的截面形状为倒梯形，优选加样孔为倒锥型，目的为了防止加样量过多导致撒漏的情况。

实施例2

如图1所示，该Lp-PLA2和hs-CRP的一步荧光定量检测试纸条包括：背衬板1，所述背衬板上依次首尾相接的贴附有吸收垫A2、硝酸纤维素膜A3、结合垫A4、样品垫A5、结合垫B6、硝酸纤维素膜B7及吸收垫B8，其中硝酸纤维素膜A3和硝酸纤维素膜B7最靠近背衬板1，结合垫A4和吸收垫A2搭接在硝酸纤维素膜A3的两端，结合垫B6和吸收垫B8搭接在硝酸纤维素膜B7的两端，样品垫搭接在结合垫A4和结合垫B 6之上。

硝酸纤维素膜A3上设有检测线T1和质控线C1，硝酸纤维素膜B7上设有检测线T2和质控线C2，检测线T1靠近结合垫A4，其上包被有抗Lp-PLA2抗体Lp1#，检测线T2靠近结合垫B6，其上包被有抗CRP抗体C28，质控线C1靠近吸收垫A2，质控线C2靠近吸收垫B8，其上均包被有羊抗鼠IgG抗体。

结合垫A4上喷涂有连接了抗Lp-PLA2抗体2#的量子点标记复合物，结合垫B6上喷涂有连接了抗CRP抗体C5E的量子点标记复合物。

如图2所示，该Lp-PLA2和hs-CRP的一步荧光定量检测系统中，试纸条可拆卸的组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设有一个加样孔a，对应于样品垫A5，设有显示窗b1，对应于检测线T1和质控线C1，设有显示窗b2，对应于检测线T2和质控线C2。

如图3所示，塑料上壳内部设有试纸条加固装置，其中凸线型加固装置9位于试纸条样品垫5与结合垫A4搭接处对应位置，凸线型加固装置10位于试纸条样品垫5与结合垫B6搭接处对应位置，凸点型加固装置11和凸点型加固装置12分别位于吸收垫A2和吸收垫B8中部对应位置。

如图4所示，塑料下壳内部设有固定试纸条的U型凸起13。

实施例3Lp-PLA2和hs-CRP的一步荧光定量检测试纸条的制备：

1、结合垫标记复合物制备

结合垫4标记复合物制备：取量子点原液50μl，稀释至500μl，并加入EDC溶液(50mg/ml)及NHS溶液(75mg/ml)各5μl，室温(25℃)搅拌反应30分钟，去除活化剂加入75μg Lp2#抗体，室温搅拌反应1小时，离心后加入500μl的封闭液(5％BSA)重悬沉淀物，室温搅拌反应1小时，离心用500μl的标记物储存液(50mM MOPS，10％蔗糖，1％吐温20，pH 8.0)重悬保存于2～8℃。

结合垫6标记复合物制备：按照结合垫4标记复合物制备方法制备。

2、结合垫的处理及标记复合物的固定

将结合垫裁成8mm的宽度浸泡于含有5％海藻糖、1％吐温20的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中(pH8.0，20mM)5分钟，室温晾干，将晾干后的结合垫置于恒温鼓风干燥箱中，37℃烘干16小时；

取出烘干后的结合垫使用喷金仪以5μl/cm的喷量将步骤1中制备完成的标记复合物固定于对应结合垫，置于恒温鼓风干燥箱中，37℃烘干16小时。

3、硝酸纤维膜上检测线与质控线的固定

用含有5％蔗糖的50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液将Lp1#抗体、C28抗体及羊抗鼠IgG抗体分别稀释至1mg/ml，用Bio Dot喷膜机在硝酸纤维素膜上分别包被不同的抗体作为T线和C线。T1上喷膜1mg/ml的Lp1#抗体稀释液，T2上喷膜1mg/ml的C28抗体稀释液，C1和C2上喷膜1mg/ml的羊抗鼠IgG抗体稀释液，C1和T1、C2和T2间隔8mm，喷膜完成后将硝酸纤维素膜置于恒温鼓风干燥箱中，37℃烘干16小时。

4、样品垫的处理

将样品垫浸泡在含有5％海藻糖、1％吐温20、0.5％BSA的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中(pH8.0，20mM)5分钟，室温晾干，并将晾干后的结合物垫置于恒温鼓风干燥箱中，37℃烘干16小时；

5、试纸条的组装

按照图1的结构组装试纸条，试纸条各相邻垫之间相互重叠，重叠宽度为1.5mm，

将组装好的试纸条用自动斩切机进行切割，每条宽度为3.5mm，并将切割完成的试纸条组装与塑料外壳中。