使用流式细胞术散射波形分析进行样品之间的空气气泡检测的方法与流程

本发明要求于2016年6月7日提交的名称为“使用流式细胞术前向散射波形分析进行样品之间的空气气泡检测的方法”的美国临时申请no.62/346,739的优先权的权益，其内容据此通过引用以其整体并入本文。

背景技术：

高通量流式细胞术系统使用泵系统来用离散样品颗粒悬浮液的物料流填充样品管线，其中离散样品颗粒悬浮液的物料流被从微孔板的孔中吸出并通过空气气泡间隙被彼此分离。将整个样品物料流连续地输送至流式细胞仪，以获取来自微孔板中所有样品的数据并将其存储在单个数据文件中。在数据采集期间，还记录高分辨率时间参数。由空气间隙的通过来在数据流中创建颗粒检测中的时间间隙，以允许在结合时间参数绘制时区分并单独评价各个颗粒悬浮液。基于这种时间分布，识别数据峰并将其分配给微孔板的各个孔。然而，在许多情况下，这些时间分布不足以准确地识别各个样品孔，并且有时会发生识别错误。

技术实现要素：

本文中公开了用于在由空气气泡分离的连续流动的样品物料流中检测空气气泡的方法和系统。在一个示例中，使用流式细胞仪的散射检测器的散射波形输出来检测空气气泡。

本公开的一些实施方式提供了用于如下的方法：随着包含多个样品的流动物料流穿过流式细胞仪一段时间，采用散射检测器生成电压输出信号，每个样品被分离气体分离；对电压输出信号进行采样；并对于大于分离间隙阈值的电压输出信号的每个采样电压，记录时间戳和电压值。本方法还可以包括如下步骤：在生成步骤之前，将包含颗粒的多个样品移动到流动物料流中；将分离气体插入到所述多个样品中的相邻样品之间，以使所述样品在所述流动物料流中彼此分离，从而所述流动物料流构成经气体分离的样品流动物料流；将包含分离的样品和分离流体的所述经流体分离的样品流动物料流引导到流式细胞仪并引导穿过流式细胞仪；并且随着流体流动物料流穿过流式细胞仪，连续操作流式细胞仪，以使经气体分离的流动物料流集中并通过散射检测器检测散射光。在另一个实施方式中，本方法可以包含如下步骤：在移动步骤之前，从具有多个样品孔的板获得多个样品，其中多个样品的每个样品是从多个孔的相应孔获得的。

本公开的实施方式还包括非暂时性计算机可读介质，在其中存储有可被执行以使处理器执行本文中所描述的方法的指令。

本公开的其他实施方式包括一种系统，其包含：包含散射检测器的流式细胞仪；处理器，其与所述散射检测器的输出通信；以及，非暂时性计算机可读介质，在其中存储有可被执行以使处理器执行本文中所描述的方法的指令。

附图说明

图1a是流式细胞术装置的示意图。

图1b是图1a的流式细胞术装置的导管中紧邻的样品的横截面示意图。

图2示出了来自前向散射检测器的样品事件波形输出的示例图。

图3示出了来自前向散射检测器的空气气泡间隙波形输出的示例图。

图4示出了采用从流式细胞仪的前向散射检测器获取的分离气体计时输出数据作图的，从流式细胞仪获取的如下的样品事件数据的示例性直方图：预板(pre-plate)装填(prime)空气气泡、具有行间振动的样品板的第一行a和样品板的b行的前两个孔。

图5是图4的一部分的放大视图。

图6是图4的一部分的放大视图。

图7示出了采用从流式细胞仪的前向散射检测器获取的分离气体计时输出数据作图的，从流式细胞仪获取的完整96孔板的样品事件数据的示例性直方图。

图8示出了采用从流式细胞仪的前向散射检测器获取的分离气体计时输出数据作图的，从流式细胞仪获取的经处理的fsc-a输出的样品事件数据的示例性直方图。

图9示出了采用从流式细胞仪的侧向散射检测器获取的分离气体计时输出数据作图的，从流式细胞仪获取的经处理的ssc-a输出的样品事件数据的示例性直方图。

发明详述

除非上下文明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”等应被解释为包含性的意义，而不是排他性或穷举性的意义；也就是说，为“包括但不限于”的意义。使用单数或复数形式的词语也分别包括复数和单数。

对本公开/示例的实施方式的描述不旨在是穷举的或不旨在将本公开限制为所公开的精确形式。虽然本文中出于说明性目的描述了本公开的具体实施方式和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等同的修改。

除非上下文另有明确规定，否则本发明任何方面的所有实施方式可以组合使用。

出于本发明的目的，本文中所用的术语“样品”是指可以包含通过颗粒分析仪可检测到的感兴趣的颗粒或标记颗粒的任何量的液体。更具体地，样品可以包括含有待被使用本文公开的方法和/或装置检测和/或分析的感兴趣的颗粒或标记颗粒的流体溶液或悬浮液。可以对样品中感兴趣的颗粒作标签，例如用荧光标签。感兴趣的颗粒也可以与珠粒、受体或其他有用的蛋白质或多肽结合，或者可以仅作为游离颗粒存在，例如在细胞裂解物中天然发现的颗粒、来自细胞裂解物的经纯化的颗粒、来自细胞培养物的颗粒，等。样品可以包含有机或无机化学品，用于与感兴趣的颗粒产生反应。当感兴趣的颗粒是生物材料时，可以将药物添加到样品中以在生物材料颗粒中引起反应或响应。当样品在样品源孔中时，可以将化学品、药物或其他添加剂添加到样品中并与样品混合，或者可以在样品已被自动进样器吸收之后将化学品、药物或其他添加剂添加到流体流动物料流中的样品中。

本文中使用时，术语“生物材料”是指从活有机体或死亡的有机体获得的任何有机材料。术语“生物材料”还指任何合成的生物材料，例如合成的寡核苷酸、合成的多肽等。合成的生物材料可以是天然存在的生物材料的合成形式或由天然存在的生物材料的部分制成的非天然存在的生物制品，例如融合蛋白，或者两种结合在一起的生物材料，例如寡核苷酸(诸如dna或rna)与肽共价或非共价地结合，寡核苷酸在天然中通常不与其结合。

本文中使用时，术语“寡核苷酸”是指任何寡核苷酸，包括双链和单链dna、rna、pna(肽核酸)以及衍生的或非衍生的天然或合成的任何核酸序列。

本文中使用时，“肽”是指所有类型的肽和缀合的肽，包括：肽、蛋白质、多肽、蛋白质序列、氨基酸序列、变性蛋白质、抗原、癌基因和癌基因的一部分。

本文中使用时，术语“有机体”不仅指动物、植物、细菌、病毒等，还指由从动物、植物、细菌、病毒等获得的有机材料制成的细胞培养物、再生寡核苷酸等。

本文中使用时，术语“药物”是指通常被认为是药物的任何类型的物质。药物可以是作用于个体中枢神经系统的物质，例如麻醉剂、迷幻剂、巴比妥酸盐或精神药物。出于本发明的目的，药物也可以是杀死或灭活致病传染性有机体的物质。另外，药物可以是影响特定细胞、身体器官或功能的活性的物质。药物可以是有机或无机化学物质、生物材料等。

本文中使用时，“等分试样”是经由流式细胞仪的探针从孔中取出的一小口样品。

本文中使用时，术语“导管”是指供流体物料流流过的诸如管、通道等的设备。导管可以由多个单独的设备组成，例如多个相连或相接的管或单独的或与通道或其他不同设备组合的单个管。在各种实施方式中，导管可以包括可与蠕动泵一起使用的任何管，该蠕动泵具有压缩特性，该压缩特性允许蠕动泵将由分离气体分离的样品或标记颗粒的等分试样以每分钟至少6个样品的速度移动通过管，不会使相邻样品彼此混合。

本文中使用时，“标记颗粒”可以包括对照颗粒、珠粒或微珠，并且还指通过流式细胞仪系统(例如，如美国专利no.6,878,556和wo2010005617中所述的系统)可检测的一种或多种颗粒，该系统可以从样品容器中吸取被怀疑其中具有待分析的感兴趣的颗粒的样品的等分试样。

出于本发明的目的，本文中使用时术语“颗粒”是指可以存在于样品中并使用流式细胞术装置能够检测的小物体，包括但不限于生物颗粒，例如分子、细胞、蛋白质、蛋白质聚集体、细胞组分(例如细胞核和线粒体)、生物体(包括微生物和病毒)、微球体、微珠和合成颗粒，例如化学化合物和化学聚集体等。

为了本发明的目的，术语“样品”是指可含有感兴趣的颗粒的流体溶液或悬浮液。

出于本发明的目的，本文中使用时，术语“孔”是指包含待分析的样品、对照或等分试样的标记颗粒的任何结构。

出于本发明的目的，本文中使用时，术语“板”、“微孔板”和“微量滴定板”是指包含待分析的样品、对照或等分试样的标记颗粒的结构。

出于本发明的目的，术语“约”意指所述参数的+/-5％。

出于本发明的目的，术语“检测器”是指能够检测散射光的任何检测器，包括光电倍增管(pmt)和单光子雪崩二极管(spad)。

出于本发明的目的，术语“分离气体”是指可用于在相邻样品之间或在样品与缓冲流体之间形成气体气泡或不混溶的流体的任何气体，例如空气、惰性气体或流体等。不混溶的流体是基本上不会与样品混合并污染样品的流体。

出于本发明的目的，术语“相邻样品”是指流体流动物料流中的两个样品，其仅通过分离气体(例如空气气泡)彼此分离。

出于本发明的目的，术语“流式细胞仪”包括任何流式细胞术装置，包括但不限于，描述于美国专利no.5,895,764、no.5,824,269、no.5,395,588、no.4,661,913中的流式细胞仪；其全部内容和公开内容在此通过引用并入本文。在流式细胞仪中，可以使用已知方法逐个颗粒地对样品进行分选。

本公开描述了新颖的系统和方法，其用于使用流式细胞仪检测器的散射波形输出来在由空气气泡分离的样品的连续流体物料流中检测空气气泡。

图1a示出了与本发明结合使用的示例性流式细胞术装置100。流式细胞术装置100包含具有可调节的臂101的传统自动进样器102，在该可调节的臂101上安装有中空的探针106。随着臂104来回(图1a中的左右)移动并且从一边到另一边移动(进出图1a的平面)，探针106下降到孔板110的各个源孔108中，以获得待使用流式细胞术装置100进行分析的包含颗粒(其可以被用荧光标签作标签(图1a中未示出))的样品。在来自各个源孔108的进样样品材料之间，允许探针106吸取分离流体(例如空气)的等分试样，从而在流体流动物料流中的连续样品之间形成分离气泡。

一旦样品被探针106获取，它就被引入到流体流动物料流中并且蠕动泵112驱使样品穿过导管114，导管114从自动进样器102延伸穿过蠕动泵112并进入包括流式细胞仪116，流式细胞仪116包含流动池118和激光询问(interrogation)设备120。随着流体流动物料流通过流式细胞仪，流动池118可以被连续操作以使流体流动物料流集中并分析多个样品中的每个样品中的颗粒。激光询问设备120在激光询问点122处检查从流动池118流出的各个样品。

图1b示出了一系列样品130、132和134，它们在导管114中通过分离气泡136和138彼此分离，从而形成经气泡分离的流体流动物料流。在图1b中，样品130紧邻样品132，并且样品132紧邻样品134。当样品130、132和134通过激光询问点122时，由流式细胞仪116感测样品中的颗粒。由前向散射检测器124检测前向散射光。由荧光检测器126检测流动池中从被标签的颗粒发射的荧光。由侧向散射检测器128检测侧向散射光。相比之下，当空气气泡136和138通过激光询问点122时，没有感测到颗粒。因此，使用流式细胞仪分析的一系列样品的所感测的荧光的数据点相对于时间的图将形成不同的组，每个组与包含颗粒的样品通过激光询问点的时间匹配。这些曲线图可以通过前向散射检测器124、荧光检测器126和/或侧向散射检测器128的输出来生成。

在分析和使用流式细胞仪输出数据时，重要的是正确识别从中采集每个样品的样品孔。在一些高通量流式细胞术系统方法中，使用采样协议，包括例如探针吸取时间(探针在孔中的持续时间)、探针上提时间(探针从孔中出来到在空气中吸取的暂停时间)、多孔摇动和冲洗步骤、采样顺序以及事件峰值的高度和它们之间的间隔的参数，来将整个微量滴定板的数据文件分割成单独的孔数据。然而，即使利用这些元素，仍然会发生孔识别错误。

在本发明的一个实施方式中，分离气泡间隙的检测用于准确识别各个样品孔。在某些情况下，这可以作为已经使用的参数的补充或替选来使用。随着具有多个经分离气体的分离的样品的流动物料流穿过流式细胞仪一段时间，通过分析由流式细胞仪的散射检测器(例如前向检测器124或侧向散射检测器128)生成的电压输出信号来识别分离气泡间隙。在流动物料流中的每个预期包含感兴趣颗粒的样品经过流式细胞仪流动池时，由颗粒触发的每个事件生成相当一致的散射波形模式，其具有在约4μs和10μs之间的持续时间和在约1.4-1.6伏之间的峰间检测器电压输出。经由连接到前向散射检测器输出的示波器获得的样品事件波形如图2所示。

在样品经过流式细胞仪流动池之后，分离气泡间隙也产生相当一致的散射波形模式。波形模式如图3所示，并且具有50μs和90μs之间的持续时间的特性，这为样品事件波形的7到9倍，并且具有大约在4.2-4.8伏之间的峰间检测器电压输出，这为样品事件波形的3倍。随着空气气泡穿过流动池，空气气泡充当反射镜，将大部分激发激光反射到前向散射检测器。这种散射光强度使检测器输出具有最大电压的信号，如波形所示。

使用这些波形，集成作为流式细胞仪的一部分的处理器或与流式细胞仪通信的处理器分析随时间的电压输出，以匹配以下信号模式中的一种：背景(未测到事件)，基于上述波形测到空气气泡或测到事件。然后，可以使用这些模式来识别数据流中的每个源孔。

特别地，用于在流体流动物料流中检测分离气体的方法包括：(a)随着包含多个样品(其中每个样品被分离气体分离)的流动物料流穿过流式细胞仪一段时间，采用散射检测器，生成指示散射光强度的散射电压输出信号，(b)对散射电压输出信号进行采样，并且(c)对于大于分离间隙阈值的散射电压输出信号的每个采样电压，记录时间戳和电压值。在一个示例中，多个样品中的每一个样品被怀疑含有感兴趣的颗粒。该方法还可以包括将散射电压输出信号的每个采样电压与分离间隙阈值进行比较。

在操作中，处理器对散射检测器的电压输出信号进行采样，并记录大于分离间隙阈值的电压值。在一些示例中，将电压输出信号的每个采样电压与分离间隙阈值进行比较。在一些示例中，分离间隙阈值的值为多个样品的最大电压输出的至少两倍，这可取决于流式细胞仪的类型和前向散射检测器的电子器件。结合下面给出的实验数据，能够由前向散射检测器检测的最大电压是5v，并且选择3.9v的分离间隙阈值(对应于(800/1023)*5v)。该阈值比来自前向散射检测器的1.6v的最大预期样品输出大两倍多。此外，以一定频率对电压输出信号进行采样。在一些示例中，采样频率在5khz和500khz之间。在另一示例中，使用高达约10mhz的采样频率。

由处理器执行的分析软件算法可以包括两个部分，初始时间相关性和空气气泡间隙事件计时，以根据连续流式细胞仪数据流描绘各个微孔板孔。气泡-间隙事件计时算法可以与其他孔识别参数，例如上面描述的那些参数结合使用。

当收集散射数据时，在超过阈值的每个采样电压出现时记录时间戳。因此，流式细胞术系统或集成在其中或与其通信的处理器也可以包括时钟。该时间戳将用于将检测到的模式与来自流式细胞仪的数据流相关联。流式细胞术系统还可以包含存储器，或者与存储器通信，在存储器中记录高于阈值的采样电压值和时间戳。

另外，在微孔板采样运行开始时，在对第一微孔板孔进行采样之前，可以执行开始时间校准序列。在这样的示例中，该方法还可以包括在生成步骤之前，将包含颗粒的多个样品移动到流动物料流中，将分离气体插入到所述多个样品中的相邻样品之间以在所述流动物料流中将所述样品彼此分离，从而所述流动物料流构成经气体分离的样品流动物料流，将包含分离的样品和分离流体的所述经流体分离的样品流动物料流引导到流式细胞仪并引导穿过流式细胞仪，并且当流体流动物料流通过流式细胞仪时，连续操作流式细胞仪，以使经气体分离的流动物料流集中并通过散射检测器检测散射光。在这样的示例中，该方法还可以包括在移动步骤之前，从具有多个样品孔的板获得多个样品，其中多个样品中的每个样品是从多个孔的相应孔获得的。

在一个特定示例中，引入三个分离气泡间隙，其各自由一秒钟吸取的去离子水然后是八秒的去离子水分离。当从流式细胞仪开始样品事件数据采集时，气泡-间隙检测器微处理器在零的时间戳时启动。利用该校准序列，空气气泡间隙检测器的时间戳输出(分离气体计时数据)可以与流式细胞仪样品事件数据计时相关联，以与板采样运行的开始处于同步。在操作中，根据捕获的散射电压信号和在散射检测器的输出超过设定电压阈值时施加的相应的时间戳来生成分离气体计时数据。该分离气体计时数据是与基于计时的来自流式细胞仪的样品事件数据同步的。分离气体计时数据与用于孔识别的样品事件相对于时间的直方图一起绘制。因此，空气气泡检测模式计时输出可用于划清孔空气气泡间隙，其中微气泡、碎片、样品不足、样品制备错误或残留将使得在仅使用随时间的事件计数时难以划清孔空气气泡间隙。

在一个示例中，散射检测器包括前向散射检测器，如下面关于图4-8另外详细描述的。在另一个示例中，散射检测器包括侧向散射检测器，如下面关于图9另外详细描述的。在散射检测器包括前向散射检测器的实施方式中，该方法还可以包括随着包含多个样品(每个样品被分离气体分离)的流动物料流穿过流式细胞仪一段时间，采用侧向散射检测器，生成指示侧向散射光强度的侧向散射电压输出信号；随着包含多个样品(每个样品被分离气体分离)的流动物料流穿过流式细胞仪一段时间，采用荧光检测器，生成指示所发射的荧光强度的荧光电压输出信号；并且至少部分地基于前向散射电压输出信号、侧向散射电压输出信号和荧光电压输出信号，生成样品事件数据。

通过首先测量空气气泡和样品二者的前向散射流式细胞仪波形并确定区分这两种波形的方法，来实验性地测试本发明的示例性空气气泡检测器。得到的分离气体计时数据示于图4-7中，用样品检测数据绘制直方图。流式细胞仪基于前向散射、侧向散射和荧光检测器的输出生成样品检测数据。通过孔识别算法识别的孔的数量和样品板中的孔的总数显示在直方图的顶部。在这些图中，时间直方图上的长竖直线与穿过流动池的气泡相关联，而短竖直线与样品中的事件数量相关联。在图4所示的预板装填序列中可以特别好地看到分离气泡的检测，图4还示出了来自孔板的第一行a的采样的检测器输出，随后是具有行间振动的微孔板的振动，以使样品中的任何颗粒重新悬浮，以及来自b行的前两个孔的采样的检测器输出。图5是图4的一部分的特写图，具体而言，来自孔板的第一行a的采样的检测器输出，随后是微孔板振动，以及来自b行的前两个孔的采样的检测器输出。图6也是图4的一部分的特写图，具体地说，来自孔板的a行的前六个孔的采样的检测器输出。图7是来自采样的全96孔板的检测器输出的直方图。在一些情况下，用于操作流式细胞术设备的控制软件可以允许用户编程定制的采样协议，其可以包括例如在对一定数量的孔采样之后要执行的一组探针冲洗和/或微孔板振动序列。在所示的示例中，逐行取样96孔微孔板，每行后进行微孔板振荡。

图4-7中每个图中的栅格(gate)各自对应于通过本公开的方法识别的孔板的相应孔，每个栅格都用字母和数字标记。与先前的方法相比，利用前向散射输出来检测气泡间隙的这种新方法限制了孔识别错误。本文所描述的前向散射波形分析与采样协议结合使用，可以使得准确识别和验证采样协议特征，例如行或列板振动和探针冲洗，以及在样品之间的气泡间隙，而与样品本身的检测无关。在前向散射波形分析中，检测到的气泡序列用于描绘样品，而不是在样品之间的低事件计数的序列。这可以消除在样品中存在低事件计数序列的情况下可能发生的错误，例如，由于样品制备错误、错误分配的样品、具有非常少的感兴趣颗粒的样品(例如，毒性测定)、样品重新悬浮不足、流体样品管堵塞。另外，前向散射波形分析可以提供关于流动池中气泡间隙的一致性的实时反馈，其可以用于检测从样品探针到流动池的流体路径的堵塞。

图8示出了采用从流式细胞仪的前向散射检测器获取的分离气体计时输出数据作图的，从流式细胞仪获取的经处理的fsc-a输出的样品事件数据的示例性直方图。就其本身而言，在图8所示的例子中，流式细胞仪检测器本身(不是外部设备)将来自前向散射pmt的电压输出转换为针对每个事件的经处理的fsc-a数字输出值。分离气体和液体样品之间的边界将导致具有处于检测的上限(例如，由流式细胞仪产生的最高值)的fsc-a值的一个或多个事件，从而在上限fsc-a事件值周围形成栅格，如图8所示。流式细胞仪还记录每个所记录事件的时间戳。利用该信息，分离气体计时数据与基于计时的来自流式细胞仪的样品事件数据同步。分离气体计时数据与用于孔识别的样品事件相对于时间的直方图一起绘制。因此，空气气泡检测模式计时输出可用于划清孔空气气泡间隙，其中微气泡、碎片、样品不足、样品制备错误或残留将使得在仅使用随时间的事件计数时难以划清孔空气气泡间隙。

图9示出了采用从流式细胞仪的侧向散射检测器获取的分离气体计时输出数据作图的，从流式细胞仪获取的经处理的ssc-a输出的样品事件数据的示例性直方图。在图9所示的示例中，流式细胞仪检测器本身(不是外部设备)将来自侧向散射pmt的电压输出转换为针对每个事件的经处理的ssc-a数字输出值。流式细胞仪还记录每个所记录事件的时间戳。利用该信息，分离气体计时数据与基于计时的来自流式细胞仪的样品事件数据同步。分离气体计时数据与用于孔识别的样品事件相对于时间的直方图一起绘制。

虽然本文已经公开了各种方面和实施方式，但是其他方面和实施方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本文公开的各个方面和实施方式是出于说明的目的而不是限制性的，其中真实范围由所附权利要求指定。