本发明涉及有机化合物检测分析领域，具体为一种孔雀石绿快速检测方法。
背景技术：
孔雀石绿是一种三苯甲烷型绿色染料，俗称碱性绿、苯胺绿等，广泛用于皮革行业、造纸业以及纺织印染行业。同时孔雀石绿也是一种性能极其优异的杀菌及杀虫剂，对于鱼、虾等多种水产的常见病如水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等有良好的杀灭效果；但是孔雀石绿在鱼体内迅速代谢为无色孔雀石绿，无色孔雀石绿具有更高的毒性，且易残留，同时具有致畸、致癌作用，为多数国家明令禁止的水产养殖禁用药。但是由于孔雀石绿价格低廉，效果优异且现在没有相应的替代产品，因而屡禁不止。孔雀石绿常规检测方法主要集中在两类，一类为理化检测方法，另一类为酶联免疫检测方法，这些方法或者为定性检测，或者需要大型仪器和专业的操作人员，或者存在假阳性问题且价格昂贵，因为需要发明一种简单、有效、特异性高且成本低廉的检测方法。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种孔雀石绿快速检测方法，以亚硫酸钠或硫代硫酸钠为增敏剂，将孔雀石绿溶液加入到含有所述增敏剂的缓冲溶液中，将电极静置于含有孔雀石绿的增敏剂缓冲溶液中进行开路富集，孔雀石绿与亚硫酸钠发生加成反应形成中间产物，所述中间产物富集到电极上，用方波阳极溶出伏安法进行检测，得到溶出电流随孔雀石绿溶液浓度变化的标准曲线，再利用方波阳极溶出伏安法和标准曲线，判断出待测孔雀石绿溶液的浓度，即孔雀石绿的含量。所述检测方法试剂的准备及检测过程不需要昂贵的仪器和试剂，成本低廉，操作简单，检测灵敏度高，测试结果稳，具有很好的市场应用前景。
本发明的技术方案为：
一种孔雀石绿快速检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)将亚硫酸钠溶液或硫代硫酸钠溶液加入到醋酸盐缓冲溶液或者磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀，得到增敏剂混合液；
2)将电化学工作站上接有的电极浸入步骤1)所述增敏剂混合液中，选取电化学工作站上的阳极溶出伏安法对所述电极进行电极活化；
3)所述电极活化完成后，将孔雀石绿溶液加入到步骤2)中浸泡有电极的增敏剂混合液中，静置5-10分钟；
4)静置完成后，选取电化学工作站上的阳极溶出伏安法进行检测，得到步骤3)中所述孔雀石绿溶液中孔雀石绿的溶出伏安图；
5)重复步骤1)至步骤4)，测定出不同浓度孔雀石绿溶液中孔雀石绿的溶出伏安图，并根据所述伏安图绘制出溶出电流随孔雀石绿溶液浓度变化的标准曲线；
6)重复步骤1)至4)测定待测孔雀石绿溶液中孔雀石绿的溶出伏安图，根据所述伏安图得到溶出电流，利用步骤5)所述标准曲线，得到待测孔雀石绿溶液的浓度。
所述醋酸盐缓冲溶液为醋酸盐的醋酸溶液，ph值为4.0-5.0。
所述步骤1)中，亚硫酸钠或者硫代硫酸钠与醋酸盐缓冲溶液中醋酸盐的摩尔比为0.002:1。
所述步骤1)将2μl浓度为0.1mol/l的亚硫酸钠溶液或硫代硫酸钠溶液加入到1ml浓度为0.1mol/l的醋酸盐缓冲溶液中，混合均匀，得到所述增敏剂混合液。
所述电极为丝网印刷电极。
所述丝网印刷电极为三电极丝网印刷电极板。
所述阳极溶出伏安法为方波阳极溶出伏安法。
所述步骤5)和步骤6)中孔雀石绿溶液浓度依次为36ppb、72ppb、108ppb、144ppb、180ppb、225ppb、270ppb。
所述电极活化过程中，检测电位0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz。
所述步骤4)中选取电化学工作站上的阳极溶出伏安法进行检测时，检测电位0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz。
本发明的技术效果为：
本发明所述孔雀石绿快速检测方法，亚硫酸钠或硫代硫酸钠与孔雀石绿在醋酸盐缓冲溶液环境下发生加成反应形成中间体，具体反应如下所示：
所述反应中间体为：
所述反应中间体可降低孔雀石绿的检测电位，电极置于溶解有孔雀石绿的增敏混合液中，生成的反应中间体易于富集到电极表面，从而达到信号放大的效果，特别是中间体的电极富集过程是开路富集，即在不接通电源的情况下进行电极静置富集，这一过程在一定程度上提高了检测的灵敏度。电极经过静置后，富集到一定的反应中间体，再利用便携式电化学工作站进行阳极溶出伏安法检测，从而构建一种可以现场、简单、快速、高灵敏检测孔雀石绿的检测平台。
此外，所述检测过程中，采用丝网印刷电极，电极成本低、即用即抛、操作简便、测试性能也非常稳定；采用方波阳极溶出伏安法检测，伏安曲线清晰，变化趋势明显。
本发明所述检测方法孔雀石绿检出限可低至100nm，且检测时间短，无需以往检测方法中构建传感器时所需的抗体等昂贵试剂，仅需微量的亚硫酸盐或硫代硫酸盐，大大降低了检测成本；所述方法操作简单、检测灵敏度高；同时传感器的构建和使用过程中不需要依赖大型仪器以及专业的操作人员，可广泛用于资源匮乏的农村以及发展中国家的现场定量检测。
附图说明
图1为本发明实施例中浓度为36ppb-270ppb孔雀石绿溶液中孔雀石绿的溶出伏安图。
图2为本发明实施例中36ppb-270ppb孔雀石绿溶液浓度与溶出电流的线性拟合图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。
本发明实施例中所用电化学工作站为便携式电化学工作站。
本发明所述ppm＝mg/l,ppb＝μg/l。
实施例1
本实施例提供了一种孔雀石绿快速检测方法，包括如下的步骤：
1)在2μl0.1mol/l硫代硫酸钠溶液中加入1ml的浓度为0.1mol/l且ph＝4.5醋酸钠缓冲溶液，振荡均匀，得到增敏剂混合液；
2)将丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连后，浸入步骤1)所制得的增敏剂混合液中，选取方波阳极溶出伏安法，活化电位窗口0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，进行丝网印刷电极的活化；
3)活化完成后，在步骤2)浸泡有丝网印刷电极的增敏剂混合液中加入浓度为36ppb孔雀石绿溶液，进行孔雀石绿的预处理，静置5分钟；
4)静置完成后，孔雀石绿与亚硫酸钠形成中间物，采用方波阳极溶出伏安法对溶液体系进行检测，参数设置：检测电位0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，得到伏安曲线。
实施例2
本实施例提供了一种孔雀石绿快速检测方法，包括如下的步骤：
1)在2μl0.1mol/l亚硫酸钠溶液中加入1ml的浓度为0.1mol/l且ph＝4.5醋酸钠缓冲溶液，振荡均匀，得到增敏剂混合液；
2)将丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连后，浸入步骤1)所制得的增敏剂混合液中，选取方波阳极溶出伏安法，活化电位窗口0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，进行丝网印刷电极的活化；
3)活化完成后，在步骤2)浸泡有丝网印刷电极的增敏剂混合液中加入浓度为36ppb孔雀石绿溶液，进行孔雀石绿的预处理，静置5分钟；
4)静置完成后，孔雀石绿与亚硫酸钠形成中间物，采用方波阳极溶出伏安法对溶液体系进行检测，参数设置：检测电位0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，得到伏安曲线，如图1中a曲线所示。
通过分析实施例1和2，选择实施例2为基础，测定不同浓度孔雀石绿溶液。
实施例3
本实施例提供了一种孔雀石绿快速检测方法，包括如下的步骤：
1)在2μl0.1mol/l亚硫酸钠溶液中加入1ml的浓度为0.1mol/l且ph＝4.5醋酸钠缓冲溶液，振荡均匀，得到增敏剂混合液；
2)将丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连后，浸入步骤1)所制得的增敏剂混合液中，选取方波阳极溶出伏安法，活化电位窗口0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，进行丝网印刷电极的活化；
3)活化完成后，在步骤2)浸泡有丝网印刷电极的增敏剂混合液中加入浓度为72ppb孔雀石绿溶液，进行孔雀石绿的预处理，静置5分钟；
4)静置完成后，孔雀石绿与亚硫酸钠形成中间物，采用方波阳极溶出伏安法对溶液体系进行检测，参数设置：检测电位0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，得到伏安曲线，如图1中b曲线所示。
实施例4
本实施例提供了一种孔雀石绿快速检测方法，包括如下的步骤：
1)在2μl0.1mol/l亚硫酸钠溶液中加入1ml的浓度为0.1mol/l且ph＝4.5醋酸钠缓冲溶液，振荡均匀，得到增敏剂混合液；
2)将丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连后，浸入步骤1)所制得的增敏剂混合液中，选取方波阳极溶出伏安法，活化电位窗口0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，进行丝网印刷电极的活化；
3)活化完成后，在步骤2)浸泡有丝网印刷电极的增敏剂混合液中加入浓度为108ppb孔雀石绿溶液，进行孔雀石绿的预处理，静置5分钟；
4)静置完成后，孔雀石绿与亚硫酸钠形成中间物，采用方波阳极溶出伏安法对溶液体系进行检测，参数设置：检测电位0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，得到伏安曲线，如图1中c曲线所示。
实施例5
本实施例提供了一种孔雀石绿快速检测方法，包括如下的步骤：
1)在2μl0.1mol/l亚硫酸钠溶液中加入1ml的浓度为0.1mol/l且ph＝4.5醋酸钠缓冲溶液，振荡均匀，得到增敏剂混合液；
2)将丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连后，浸入步骤1)所制得的增敏剂混合液中，选取方波阳极溶出伏安法，活化电位窗口0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，进行丝网印刷电极的活化；
3)活化完成后，在步骤2)浸泡有丝网印刷电极的增敏剂混合液中加入浓度为144ppb孔雀石绿溶液，进行孔雀石绿的预处理，静置5分钟；
4)静置完成后，孔雀石绿与亚硫酸钠形成中间物，采用方波阳极溶出伏安法对溶液体系进行检测，参数设置：检测电位0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，得到伏安曲线，如图1中d曲线所示。
实施例6
本实施例提供了一种孔雀石绿快速检测方法，包括如下的步骤：
1)在2μl0.1mol/l亚硫酸钠溶液中加入1ml的浓度为0.1mol/l且ph＝4.5醋酸钠缓冲溶液，振荡均匀，得到增敏剂混合液；
2)将丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连后，浸入步骤1)所制得的增敏剂混合液中，选取方波阳极溶出伏安法，活化电位窗口0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，进行丝网印刷电极的活化；
3)活化完成后，在步骤2)浸泡有丝网印刷电极的增敏剂混合液中加入浓度为180ppb孔雀石绿溶液，进行孔雀石绿的预处理，静置5分钟；
4)静置完成后，孔雀石绿与亚硫酸钠形成中间物，采用方波阳极溶出伏安法对溶液体系进行检测，参数设置：检测电位0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，得到伏安曲线，如图1中e曲线所示。
实施例7
本实施例提供了一种孔雀石绿快速检测方法，包括如下的步骤：
1)在2μl0.1mol/l亚硫酸钠溶液中加入1ml的浓度为0.1mol/l且ph＝4.5醋酸钠缓冲溶液，振荡均匀，得到增敏剂混合液；
2)将丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连后，浸入步骤1)所制得的增敏剂混合液中，选取方波阳极溶出伏安法，活化电位窗口0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，进行丝网印刷电极的活化；
3)活化完成后，在步骤2)浸泡有丝网印刷电极的增敏剂混合液中加入浓度为225ppb孔雀石绿溶液，进行孔雀石绿的预处理，静置5分钟；
4)静置完成后，孔雀石绿与亚硫酸钠形成中间物，采用方波阳极溶出伏安法对溶液体系进行检测，参数设置：检测电位0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，得到伏安曲线，如图1中f曲线所示。
实施例8
本实施例提供了一种孔雀石绿快速检测方法，包括如下的步骤：
1)在2μl0.1mol/l亚硫酸钠溶液中加入1ml的浓度为0.1mol/l且ph＝4.5醋酸钠缓冲溶液，振荡均匀，得到增敏剂混合液；
2)将丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连后，浸入步骤1)所制得的增敏剂混合液中，选取方波阳极溶出伏安法，活化电位窗口0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，进行丝网印刷电极的活化；
3)活化完成后，在步骤2)浸泡有丝网印刷电极的增敏剂混合液中加入浓度为270ppb孔雀石绿溶液，进行孔雀石绿的预处理，静置5分钟；
4)静置完成后，孔雀石绿与亚硫酸钠形成中间物，采用方波阳极溶出伏安法对溶液体系进行检测，参数设置：检测电位0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，得到伏安曲线，如图1中g曲线所示。
根据实施例2-8，测定的浓度分别为36ppb、72ppb、108ppb、144ppb、180ppb、225ppb、270ppb的孔雀石绿溶液中孔雀石绿的溶出伏安图，并根据所述伏安图绘制出溶出电流随孔雀石绿溶液浓度变化的标准曲线，即孔雀石绿溶液浓度与溶出电流的线性拟合图，如图2所示。
实施例9
1)在2μl0.1mol/l亚硫酸钠溶液中加入1ml的浓度为0.1mol/l且ph＝4.5醋酸钠缓冲溶液，振荡均匀，得到增敏剂混合液；
2)将丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连后，浸入步骤1)所制得的增敏剂混合液中，选取方波阳极溶出伏安法，活化电位窗口0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，进行丝网印刷电极的活化；
3)活化完成后，在步骤2)浸泡有丝网印刷电极的增敏剂混合液中加入待测的孔雀石绿溶液，进行孔雀石绿的预处理，静置5分钟；
4)静置完成后，孔雀石绿与亚硫酸钠形成中间物，采用方波阳极溶出伏安法对溶液体系进行检测，参数设置：检测电位0.3v–0.7v，电压增量4mv，振幅0.025v，频率15hz，得到伏安曲线，根据所述伏安曲线得到此浓度下的溶出电流为0.2μa，根据所述溶出电流0.2μa，对应图2所示的标准曲线得出待测孔雀石绿的浓度为201ppb。
本发明所述检测方法无需以往检测方法中构建传感器时所需的抗体等昂贵试剂，仅需微量的亚硫酸盐或硫代硫酸盐，大大降低了检测成本；且检测时间短，操作简单、检测灵敏度高；丝网印刷电极的使用，电极成本低、即用即抛、操作简便、测试性能也非常稳定；采用方波阳极溶出伏安法检测，伏案曲线特征明显；同时所述检测方法传感器的构建和使用过程中不需要依赖大型仪器以及专业的操作人员，可广泛用于资源匮乏的农村以及发展中国家的现场定量检测。
需要指出的是，以上实施例只是对本发明的解释，并非是对发明的限定，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改，例如亚硫酸盐浓度、氢氧化钠浓度、活化电位、活化时间、预处理电位、预处理时间及检测参数变化都应在本发明技术方案保护范围之内。