本发明涉及检测方法，特别涉及一种高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法。
背景技术：
硝基咪唑类药物是分子中含有一个第五位接有硝基的咪唑环兽药，常被用来预防、治疗特定病菌和原生动物疾病。由于硝基咪唑类化合物具有潜在的致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性，故欧盟各国、日本等规定药物动物源性食品中药物残留不得检出，即在检测方法的检出限以下。蜂王浆也是一种药物动物源性食品，但其基质复杂，样品净化困难，导致蜂王浆中硝基咪唑类药物的测定准确性不高。
公开号为cn101865887a的中国专利公开了一种高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法。该方法采用体积浓度为2％的hclo4沉淀蛋白，蛋白沉淀彻底，离子抑制效应低，用浓度为1mol/l的naoh溶液将上清液的ph值调节到8.8，并在ph值为8.8的环境中用乙酸乙酯反萃取目标化合物，反萃取液容易吹干，净化样品方法独特，简便快速，不增加溶剂使用量，不使用磷酸缓冲溶液，同时大大提高了方法的灵敏度。
但是，在使用hclo4沉淀蛋白质的过程中，由于hclo4的加入而产生的蛋白质沉淀会包裹硝基咪唑类药物，导致硝基咪唑类药物难以提取出来，有待改进。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法。该方法能够避免因蛋白质沉淀包裹硝基咪唑类药物而导致硝基咪唑类药物难以提取出来的情况发生，进一步提高方法的灵敏度。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，包括标准溶液制备工序、蜂王浆样品处理工序、标准曲线制作工序和蜂王浆样品检测工序，蜂王浆样品处理工序包括如下步骤：
往蜂王浆样品中加入二甲硝咪唑氘代内标临时使用液，再加入有机溶剂进行涡旋、溶解；
再加入蛋白沉淀剂进行涡旋、溶解，其中有机溶剂在下层，蛋白沉淀剂在上层，然后离心得到上层无机层；
往无机层加入ph调节剂调节ph，然后加入乙酸乙酯进行涡旋、液液萃取，对无机层再次加入乙酸乙酯进行涡旋、液液萃取，合并两次萃取得到的有机层，进行氮气吹干；
然后用流动相进行超声溶解，再加入正己烷涡旋去脂，然后离心得到流动相层，将流动相层过滤膜而制得上机检测样液；
在蛋白沉淀剂和ph调节剂中，其中一个是酸，另一个是碱。
通过采用上述技术方案，蜂王浆的主要成分为蛋白质，利用有机溶剂溶解蜂王浆，蜂王浆中的蛋白质用蛋白沉淀剂进行沉淀。由于有机溶剂的密度大于蛋白沉淀剂的密度且不互溶，因此有机溶剂位于下层，蛋白沉淀剂位于上层。蛋白质在有机层形成蛋白沉淀后会下沉，而硝基咪唑类药物会进入无机层，从而避免在蛋白质于有机层中形成蛋白质沉淀的过程中，硝基咪唑类药物被蛋白质沉淀包裹，从而促进硝基咪唑类药物被提取，进而提高方法的灵敏度。蛋白沉淀剂选用酸或者碱，由于硝基咪唑类药物具有两性，因此蛋白沉淀剂均能够与硝基咪唑类药物反应，从而促进硝基咪唑类药物被蛋白沉淀剂提取，进而提高方法的灵敏度。
本发明进一步设置为：在加入蛋白沉淀剂后且进行离心之前再加入乙酸铵溶液进行涡旋、溶解。
通过采用上述技术方案，乙酸铵溶液作为中性盐溶液，能够促进蜂王浆中蛋白质发生盐析。
本发明进一步设置为：在无机层调节ph后且在加入乙酸乙酯前，往无机层中加入氯化钠，待氯化钠溶解后再加入乙酸乙酯。
通过采用上述技术方案，氯化钠的加入能够进一步沉淀无机层中残留的来自于蜂王浆中的蛋白质，避免影响乙酸乙酯对硝基咪唑类药物的萃取。
本发明进一步设置为：无机层ph经ph调节剂调节到ph＝8.8。
通过采用上述技术方案，ph值过高或者过低时，都会导致硝基咪唑类药物处于带电荷状态，进而导致乙酸乙酯对硝基咪唑类药物的萃取效率较差。
本发明进一步设置为：有机溶剂选用二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳中的一种。
通过采用上述技术方案，二氯甲烷、三氯甲烷和四氯甲烷均为常用有机溶剂，不溶于水且密度大于水，不与酸和碱发生反应，对于硝基咪唑类药物有较好的溶解性能，价廉易得。
本发明进一步设置为：酸选用盐酸、硫酸中的一种。
通过采用上述技术方案，盐酸和硫酸均为常用酸，价廉易得，降低成本。
本发明进一步设置为：碱选用氢氧化钠、氢氧化钾中的一种。
通过采用上述技术方案，氢氧化钠和氢氧化钾均为常用碱，价廉易得，降低成本。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、蜂王浆的主要成分为蛋白质，利用有机溶剂溶解蜂王浆，蜂王浆中的蛋白质用蛋白沉淀剂进行沉淀。由于有机溶剂的密度大于蛋白沉淀剂的密度且不互溶，因此有机溶剂位于下层，蛋白沉淀剂位于上层。蛋白质在有机层形成蛋白沉淀后会下沉，而硝基咪唑类药物会进入无机层，从而避免在蛋白质于有机层中形成蛋白质沉淀的过程中，硝基咪唑类药物被蛋白质沉淀包裹，从而促进硝基咪唑类药物被提取，进而提高方法的灵敏度；
2、蛋白沉淀剂选用酸或者碱，由于硝基咪唑类药物具有两性，因此蛋白沉淀剂均能够与硝基咪唑类药物反应，从而促进硝基咪唑类药物被蛋白沉淀剂提取，进而提高方法的灵敏度；
3、乙酸铵溶液作为中性盐溶液，能够促进蜂王浆中蛋白质发生盐析。
附图说明
图1为本发明实施例中蜂王浆阴性样品添加10μg/kg标准浓度时，通过lc/ms/ms测定蜂王浆中硝基咪唑类残留的总离子流图；
图2为本发明实施例中蜂王浆阴性样品添加0.2μg/kg标准浓度时，通过lc/ms/ms测定蜂王浆中硝基咪唑类残留的提取离子流图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
表1实施例1-5的配比表
实施例1-5的具体步骤：
参照图1和2，一种高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，该方法所用到的原料包括甲硝唑，metronidazole，cas：[443-48-1]，纯度＞99.4％；洛硝哒唑，ronidazole，cas：[7681-76-7]，纯度＞99.0％；二甲硝咪唑，dimetridazole，cas：[551-92-8]，纯度＞98.5％；d3-二甲硝咪唑，dimetridazole-d3，cas：64678-69-9，纯度＞98％；为农残级的乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷；为分析纯的氯化钠、氢氧化钠和氢氧化钾；为优级纯的正己烷；为液相色谱纯的乙腈、甲酸；水；流动相。其中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑和d3-二甲硝咪唑均来自德国dr.ehrenstorfer公司；流动相中的有机相为乙腈，水相中含有体积浓度为0.1％的甲酸，流动相中有机相与水相的体积比为3：97；所使用的水均为双重蒸馏水。
该方法所用到的设备包括agilem三重四极杆串联质谱仪；安捷伦1290高效液相色谱仪：配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、analyst数据处理软件；al204分析天平；phs-3c雷磁精密ph计；上海卢湘仪离心机仪器有限公司低速台式大容量离心机；天津市恒奥科技发展有限公司hsc-24b氮吹仪。其中高效液相色谱仪为agilem1290infinityii，色谱柱为intersilodsc8-3，色谱柱的规格为2.1×150mm，3μm或相当者，进样量为20μl；三重四极杆串联质谱仪为6460c，三重四极杆串联质谱仪中的鞘气温度375℃，流速111/min，喷嘴电压45psi，毛细管电压(is)为3900.00v，离子化法为正离子模式。
该方法包括标准溶液制备工序、蜂王浆样品处理工序、标准曲线制作工序和蜂王浆样品检测工序。
标准溶液制备工序如下：a、混合贮备标准液配制步骤：称取10mg甲硝唑、10mg洛硝哒唑和10mg二甲硝咪唑均置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成甲硝唑、洛硝哒唑和二甲硝咪唑的浓度均为1000mg/l的混合贮备标准液。b、混合中间标准液配制步骤：取a中的混合贮备标准液100μl置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成浓度为10mg/l的混合中间标准液。c、二甲硝咪唑氘代内标配制步骤：先称取d3-二甲硝咪唑10mg置于10ml容量瓶中用乙腈定容至10ml制得浓度为1000mg/l的二甲硝咪唑氘代贮备液，再取100μl二甲硝咪唑氘代贮备液置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成浓度为10mg/l的二甲硝咪唑氘代内标中间溶液。d、临时标准使用液配制步骤：取b步骤中的混合中间标准液分别用水配制成浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液、浓度为20μg/kg的二号临时标准使用液和浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液，取c步骤中的二甲硝咪唑氘代内标中间溶液用水配制成浓度为100μg/kg的二甲硝咪唑氘代内标临时使用液。
蜂王浆样品处理工序如下：
a、将蜂王浆样品10g置于一号100ml离心塑料瓶中，再向一号100ml离心塑料瓶中加入浓度为100μg/kg的二甲硝咪唑氘代内标临时使用液100ul，再向一号100ml离心塑料瓶中加入有机溶剂10ml进行涡旋、溶解；
b、再加入蛋白沉淀剂进行涡旋、溶解，再加入20mmol/l乙酸铵溶液进行涡旋、溶解，其中有机溶剂在下层，蛋白沉淀剂在上层，然后离心得到上层无机层；
c、将无机层置于二号100ml离心塑料瓶中，往无机层加入ph调节剂调节ph到8.8，往无机层中加入2.0g氯化钠，待氯化钠溶解后加入乙酸乙酯10ml进行涡旋、液液萃取，对无机层再次加入乙酸乙酯5ml进行涡旋、液液萃取，合并两次萃取得到的有机层，将有机层置于20ml塑料离心管中并在35℃下进行氮气吹干；
d、然后向20ml塑料离心管加入1ml流动相并进行超声溶解，再向20ml塑料离心管中加入2ml正己烷并涡旋、去脂，然后在转速为800rpm下离心2min得到流动相层，将流动相层过0.22μm滤膜而制得上机检测样液；
标准曲线制作工序中，先称取6份重量均为10.0g的阴性蜂王浆样品分别置于一号试剂瓶、二号试剂瓶、三号试剂瓶、四号试剂瓶、五号试剂瓶和六号试剂瓶中，本发明中所用的阴性蜂王浆样品对本领域技术人员来说为公知常识。然后向一号试剂瓶中加入10ml水并混合均匀而制得一号阴性蜂王浆液；向二号试剂瓶中加入100μl浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得二号阴性蜂王浆液；向三号试剂瓶中加入500μl浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得三号阴性蜂王浆液；向四号试剂瓶中加入1000μl浓度为20μg/kg的二号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得四号阴性蜂王浆液；向五号试剂瓶中加入500μl浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得五号阴性蜂王浆液；向六号试剂瓶中加入1000μl浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得六号阴性蜂王浆液。然后分别用一号阴性蜂王浆液、二号阴性蜂王浆液、三号阴性蜂王浆液、四号阴性蜂王浆液、五号阴性蜂王浆液和六号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而分别制得一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液，例如用一号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而制得一号标准液。本实施例中一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液的系列浓度为0μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、2μg/kg、10μg/kg和20μg/kg。最后将一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得到标准曲线。高效液相色谱仪采用液相梯度程序，表2为高效液相色谱仪的液相梯度洗脱程序表，三重四极杆串联质谱仪对硝基咪唑类药物残留参考质谱条件见表3。
表2高效液相色谱仪液相梯度洗脱程序表
表3三重四级杆串联质谱仪对硝基咪唑类药物残留的质谱参考条件
注：表中带下划线黑体字为定量离子。
需要说明的是，本发明中的高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪均为现有技术，高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪的操作对本领域技术人员来说为公知常，故此处均不再详述。
在蜂王浆样品检测工序中，将蜂王浆样品处理工序中制得的上机检测样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线制作工序中得到的标准曲线而测得蜂王浆中硝基咪唑类药物的残留量；该方法的检测定量限为甲硝唑0.05μg/kg、洛硝哒唑0.1μg/kg和二甲硝咪唑0.1μg/kg。
下面来对本发明的线性范围、检出限、回收率和精密度进行分析，配制27种残留的系列标准溶液，按照本方法设定的色谱条件进样测定。以y表示峰面积(a)，x表示浓度c(μg/kg)，用excel软件，求得回归方程和线性相关系数，得到线性范围在0.1μg/kg-20μg/kg之间，相关系数为0.9995-0.9997，以信噪比s/n＝3对应浓度确定三种残留的检出限分别为：甲硝唑0.015μg/kg、洛硝哒唑0.03μg/kg和二甲硝咪唑0.03μg/kg。以信噪比s/n＝10对应浓度确定三种残留的定量限分别为：甲硝唑0.05μg/kg、洛硝哒唑0.1μg/kg和二甲硝咪唑o.1μg/kg。
在蜂王浆阴性样品中，分别添加3个浓度的残留标准品，按本方法进行样品的处理与测定，确定本方法的回收率和相对标准偏差，结果见表4。
表4方法的线性范围、检出限、回收率、精密度和检测限表(n＝3)
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。